骨髓间质干细胞减轻收缩期高血压的心肌损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
收缩期高血压：指一个人的舒张压不高，仅仅收缩压超过正常范围。1993年3月，世界卫生组织在轻度高血压自理准则会议简报中，重新规定了单纯收缩期高血压标准为收缩压>21.3 kPa(160 mm Hg)，舒张压<12.0 kPa(90 mm Hg)。如果收缩压为18.7-21.3 kPa(140-160 mm Hg)，称临界单纯收缩期高血压。
心肌纤维化：是指心肌组织中胶原纤维过量沉积，胶原浓度和胶原容积分数显著增加，各型胶原比例失调以及排列紊乱。按Weber的分型方法，心肌纤维化可分为4型：①间质纤维化：胶原纤维增粗，出现在原先没有胶原的肌间隙；②血管周围纤维化：胶原沉积在心肌内冠状动脉的外膜；③修复性纤维化：出现心肌细胞坏死和显微瘢痕灶；④丛状纤维化：胶原旱漩涡状排列，心肌纤维弥散分布。而根据有无心肌细胞坏死和替代性瘢痕的出现将心肌纤维化分为反应性纤维化和修复性纤维化，前者又包括间质纤维化和血管周围纤维化。

摘要
背景：研究发现骨髓间质干细胞可以用于多种损伤性疾病的治疗，但关于骨髓间质干细胞治疗收缩期高血压的研究不多。
目的：探讨骨髓间质干细胞对收缩期高血压大鼠的治疗作用。
方法：24只大鼠等分为对照组、模型组和骨髓间质干细胞移植组。模型组和骨髓间质干细胞移植组采用维生素K和华法林纳制备单纯收缩期高血压大鼠模型。骨髓间质干细胞移植组大鼠左心室注射骨髓间质干细胞，模型组和对照组注射生理盐水。
结果与结论：与模型组相比，骨髓间质干细胞移植组大鼠的左心室质量指数降低，心脏组织中Ⅰ型胶原容积分数、胶原容积分数和血管周围胶原容积分数上升，但舒张末期容积/体质量比没有明显改变。表明骨髓间质干细胞移植治疗收缩期高血压大鼠能够改善大鼠的心肌肥厚状况，改善大鼠的心脏纤维化程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2707-3643(王勇)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间质干细胞, 收缩期高血压, 细胞移植, 心肌损伤, 心肌肥厚, 纤维化

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells can be used to treat a variety of injuries, but little is known about their effect on systolic hypertension.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on systolic hypertension rats.
METHODS: Twenty-four rats were randomized equally into control, model and cell transplantation groups. A rat model of systolic hypertension was made by injection of vitamin K and warfarin sodium in the model and cell transplantation groups. Rats in the cell transplantation group were given injection of bone marrow mesenchymal stem cells into the left ventricle, while those in the other two groups given normal saline.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, bone marrow mesenchymal stem cells could reduce left ventricular mass index, increase cardiac tissue type I collagen volume fraction, collagen volume fraction and perivascular collagen volume fraction, but the ratio of end-diastolic volume/body weight did not change significantly. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can reduce myocardial hypertrophy and cardiac fibrosis in systolic hypertension rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Systole, Hypertension, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王勇，张亚光. 骨髓间质干细胞减轻收缩期高血压的心肌损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7518-7523.

Wang Yong, Zhang Ya-guang. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation alleviates myocardial injury due to systolic hypertension[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7518-7523.

图/表（结果） 2

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引言

单纯性收缩期高血压是高血压的亚型之一^[1-2]，在中老年人群中的发病率比较高。部分原发性高血压患者会发展成单纯性收缩期高血压。单纯性收缩期高血压的病理生理特点和一般高血压不同，其病理生理变化具有一定的特异性，单纯性收缩期高血压的最主要的病理生理改变为主动脉损伤，从而造成主动脉的顺应性下降，在患病早期即出现主动脉的顺应性下降，引起血管的重构，血管重构在单纯性收缩期高血压的病程中发挥重要作用^[3-5]，对患者的预后造成严重影响。单纯性收缩性高血压的主要临床表现为脉压差增大、收缩压升高，而舒张压在正常范围内，引起脉压差增大、收缩压升高的主要原因为大动脉血管的顺应性下降，大动脉血管的顺应性下降也是单纯性收缩期高血压的中风发生率升高和死亡率升高的主要原因^[5]。

既往高血压的治疗主要是对血压的有效控制^[4^，^6]，现在高血压的治疗已经从控制血压不断转移到在有效控制血压的同时延缓高血压对靶器官的损伤^[7-9]，治疗高血压比较理想的方法是既能修复高血压对动脉壁的损伤，改善胶原纤维和弹力纤维的比例失衡，恢复弹力纤维的结构和功能，修复损伤的内皮细胞，逆转大动脉血管的重构，恢复大动脉血管的顺应性；又能受到损伤的心脏和肾脏的靶器官起到修复作用，从而达到治疗单纯性收缩期高血压，改善患者的预后。

骨髓间质干细胞具有不断分化和自我更新的能力，能够修复多种组织损伤^[10-12]，为改善收缩期高血压患者的大动脉顺应性，治疗收缩期高血压提供了新的思路。

实验拟对骨髓间质干细胞对收缩期高血压大鼠的治疗作用进行研究，探讨骨髓间质干细胞对收缩期高血压大鼠的治疗作用。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年4月至2015年6月在河南省人民医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级健康雄性SD大鼠34只，鼠龄6-8周，体质量290-320 g，其中10只用于制备骨髓间质干细胞，24只用于分组实验。所有大鼠购自河南省实验动物中心，动物许可证号：SYXK(豫)2005-0012。所有大鼠实验前饲养1周，饲养于实验室大鼠专用鼠笼，按照实验大鼠标准进行进食和饮水。所有大鼠的应用经过河南省人民医院动物伦理学委员会批准。

主要试剂和仪器：胎牛血清，DMEM培养基由美国 HyClone公司生产；PBS，小鼠抗大鼠单克隆抗体 CD34-PE，小鼠抗大鼠单克隆抗体 CD45-FITC，小鼠抗大鼠单克隆抗体CD90-FITC，小鼠抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC的生产厂家是美国Pharmacia公司；胰蛋白酶，维生素K，华法林钠购自美国Sigma公司；超净台由苏州安泰公司提供；倒置相差显微镜，偏振光显微镜来自日本尼康公司；CO₂孵育箱，流式细胞仪，离心机购自美国 BD公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间质干细胞的培养和传代 取10只大鼠，麻醉，取胫骨和股骨，PBS洗，DMEM培养基中浸泡，剪去胫骨和股骨两端，注射器抽取DMEM培养基冲洗骨髓腔，将收集的骨髓转移至离心管中，进行离心，吸取第2层细胞液，加入DMEM离心，弃去上清液，加入胎牛血清制成细胞悬液，接种到培养瓶中进行培养，每过3 d进行1次换液，培养至12 d时，细胞达到90%以上融合，PBS洗，胰蛋白酶消化，离心，弃去上清液，加入胎牛血清制成单细胞悬液，接种到培养瓶中进行传代培养，培养至细胞90%以上融合时，进行消化，并继续传代培养。

1.4.2 骨髓间质干细胞的鉴定 采用流式细胞仪对骨髓间质干细胞第2代细胞进行鉴定，取骨髓间质干细胞和小鼠抗人CD34-ECDCD34-PE单抗单抗、小鼠抗人CD45-PE单抗、小鼠抗人CD29-FITC单抗和小鼠抗人CD29-FITC单抗室温下进行孵育，流式细胞仪进行鉴定。

1.4.3 分组 将24只实验大鼠分为3组，对照组、模型组和骨髓间质干细胞移植组，各8只。

1.4.4 制备单纯收缩期高血压大鼠模型 采用维生素K和华法林纳制备单纯收缩期高血压大鼠模型：取16只大鼠进行造模，维生素K1皮下注射(10 mg/kg)，华法林钠自由饮水(15 mg/kg/d)，1次/d，至42 d造模完成^[13]。造模过程中每星期进行2次血压测定。

1.4.5 细胞移植 造模结束7 d后，骨髓间质干细胞移植组大鼠在左心室注射1 mL骨髓间质干细胞(1×10⁸ L^-¹)^[14]，模型组和对照组在左心室注射等量的生理盐水。骨髓间质干细胞移植治疗后4周处死各组大鼠进行检测。

1.4.6 心肌肥厚的检测 将大鼠心脏组织标本经二甲苯脱蜡，乙醇脱水，明矾苏木精染色，蒸馏水冲洗，盐酸乙醇分红，蒸馏水冲洗反蓝，伊红复染，乙醇分红，二甲苯透明，中性树胶封固，测定左心室质量指数(g/kg)。

1.4.7 心脏胶原组成变化 采用天狼星红染色进行检测：石蜡切片脱蜡，乙醇脱水，苏木精染色，蒸馏水洗涤，苦味酸-天狼星红溶液染色，酸化水洗涤，乙醇脱水，二甲苯进行透明，中性树胶进行封固。染色后的切片在偏振光显微镜下采用图像分析软件对图像进行分析，每个区域选择8个视野进行观察，取平均值，测定胶原含量及Ⅰ型胶原容积，数字电荷耦合元件CCD对图像进行扫描后分析胶原面积和胶原容积分数。

1.5 结局观察指标 骨髓间质干细胞的形态；流式细胞仪检测结果；收缩期高血压模型大鼠的血压变化；骨髓间质干细胞移植对收缩期高血压模型大鼠心肌肥厚的影响以及对心脏组织中间质胶原成分的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料用x(_)±s表示，多组间均数比较采用ANOVA，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

单纯性收缩期高血压是老年患者中比较常见的一种高血压类型^[8^，^15]，是指只有收缩压升高，而舒张压正常或者降低的一种血压状态，单纯性收缩期高血压是脑卒中和心力衰竭等心脑血管事件的独立影响因子^[16-17]，在临床治疗过程中，不仅仅要控制血压，同时要预防靶器官的损伤。单纯性收缩性高血压和年龄有关，年龄越高，单纯性收缩期高血压的发病率也越高，除了年龄外，和患者的性别也有相关性，女性患者的发病率较男性患者高。单纯性收缩期高血压的发病机制为^[18]：①动脉硬化：随着年龄的不断增加，大动脉血管壁的弹力蛋白不断减少，胶原蛋白不断增加，从而导致动脉硬化的发生，同时外周阻力血管的数量和内径减小，造成外周血管阻力增加，同时血管内皮细胞受到损伤，血管舒张因子减少，也导致动脉硬化的发生，引起单纯性收缩期高血压的发生；②血压调节机制的异常：收缩压的水平主要靠压力感受器反射进行调节，随着年龄的增加，压力感受器的敏感性下降，对收缩压升高的缓冲作用下降，同时年龄的增加，出现交感神经的活性增高，从而引起血压调节机制的异常，导致单纯性收缩期高血压的发生；③瓣膜的改变：随着年龄的增加，瓣膜也发生变化，其中钙化是最主要的变化，在瓣膜的钙化过程中，有炎症细胞积聚，并有骨桥蛋白出现，骨桥蛋白是一种调节病理钙化和正常钙化的一种蛋白，和动脉血管的硬化有一定关系；④血流动力学的改变：影响收缩压的血流动力学变化主要有心脏输出量额增加，外周血管的阻力增加，血容量的扩张等；⑤基因的作用：单纯性收缩期高血压的发生和一些基因也具有一定的相关性，如血管紧张素原基因型和弹性蛋白基因型等。单纯性收缩期高血压的治疗主要是降压治疗^[19-20]，由于单纯性收缩期高血压的发病机制比较复杂，其临床治疗比较困难，使单纯性收缩期高血压的控制一直不太理想，舒张压的降低会影响心肌的供血，引起心肌缺血，甚至心肌梗死，因此在降压的过程中需兼顾舒张压，使舒张压不能降得过低，目前降压治疗的主要方法仍然是降压药物治疗。随着医学的不断进步，高血压的治疗已经不单单需要有效的控制血压，在控制血压的同时要降低靶器官的损伤，因此寻找一种能够从根本上改善血压，防止靶器官损伤的方法至关重要。

骨髓间质干细胞作为一种比较理想的种子细胞，在多种损伤性疾病中被广泛应用，不取得了良好的效果。骨髓间质干细胞是一种不具有分化功能的骨髓内的休眠细胞，为造血干细胞提供营养，近年来的研究发现，骨髓间质干细胞具有强大的分化能力以及自我更新能力^[21-22]，在不同条件的诱导下能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等多种细胞^[23-25]，在分化的过程中能够调节局部的环境，并向目的细胞的方向分化，骨髓间质干细胞在分化为不同细胞的同时，对受损伤的组织也有修复作用，因此骨髓间质干细胞被用于多种损伤性疾病的治疗^[26-30]。骨髓间质干细胞能够分化为血管壁成分，在体内微环境的作用下，骨髓间质干细胞通过分化为血管壁细胞参与动脉壁结构的构建；骨髓间质干细胞能够促进弹力纤维的生成，并恢复弹力纤维的功能，骨髓间质干细胞植入体内后，能够分化植入组织相似的纤维素样成分，在受损在动脉壁内，能够分化为弹力纤维，改变动脉血管壁内的纤维成分，恢复动脉血管的顺应性；骨髓间质干细胞能够恢复内皮细胞的功能^[31]。

目前骨髓间质干细胞在心肌梗死方面的研究比较多，在高血压方面，尤其是单纯性收缩期高血压中的研究不多。实验通过培养骨髓间质干细胞，建立收缩期高血压大鼠模型，发现骨髓间质干细胞能够成功治疗单纯性收缩期高血压大鼠，但实验尚缺乏组织学方面的证据，将在未来研究中进一步进行分析。收缩期高血压模型组大鼠的收缩压、脉压差明显高于对照组，而舒张压和对照组接近。模型组和骨髓间质干细胞移植组大鼠的左心室质量指数明显高于对照组，骨髓间质干细胞移植组大鼠的左心室质量指数低于模型组大鼠，骨髓间质干细胞移植组、模型组和对照组大鼠舒张末期容积/体质量接近。骨髓间质干细胞移植组和模型组的Ⅰ型胶原容积分数、胶原容积分数和血管周围胶原容积分数均明显高于对照组，骨髓间质干细胞移植组的Ⅰ型胶原容积分数、胶原容积分数和血管周围胶原容积分数均明显高于模型组。

由此可见，收缩期高血压模型大鼠出现心肌肥厚现象，心脏出现纤维化，骨髓间质干细胞移植治疗收缩期高血压大鼠能够改善大鼠的心肌肥厚状况，改善大鼠的心脏纤维化程度。