骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
白细胞介素10：是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。白细胞介素10来源于Th2和部分调节性T细胞，能抑制Th1细胞应答，抑制巨噬细胞的抗原提呈功能及合成细胞因子，促进B细胞增殖、分化及抗体产生。
Foxp3：是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一，它的发现是Treg免疫生物学重要的进步。虽然人们也发现Treg发育和功能也需要其他转录因子如AhR和STAT5的参与，但是Foxp3仍旧是Treg细胞系的主要调节因子。实验表明，在体外或体内诱导初始T细胞表达Foxp3后可以出现Treg样的免疫抑制作用，可见Foxp3是控制免疫抑制分子表达的关键因素。

摘要
背景：心脏移植是治疗终末期心力衰竭等疾病的有效手段，但移植后容易出现免疫排斥反应，严重影响到移植效果。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对心脏移植大鼠免疫功能的调节作用。
方法：Lewis大鼠20只作为供体，Wistar大鼠20只作为受体，采用套管法建立大鼠颈部心脏移植模型。模型制备后，20只Wistar大鼠随机分为细胞移植组与空白对照组，每组10只。心脏移植后48 h，细胞移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL(细胞浓度为2×10⁸ L^-1)，空白对照组经尾静脉注射等量的生理盐水注射液。细胞移植后7 d，ELISA法检测血清白细胞介素2、白细胞介素10水平，流式细胞术检测大鼠静脉血中CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD4⁺CD25^high、CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ T细胞百分含量，获取心肌组织进行病理学观察。
结果与结论：①细胞移植组心脏存活时间显著长于空白对照组(P < 0.05)；②两组血清白细胞介素2水平差异无显著性意义(P > 0.05)，细胞移植组血清白细胞介素10水平显著高于空白对照组(P < 0.05)；③细胞移植组CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD4⁺CD25^high、CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ T细胞占总淋巴细胞的比例均显著高于空白对照组(P < 0.05)，CD8⁺ T细胞占总淋巴细胞的比例显著低于空白对照组(P < 0.05)；④细胞移植组心肌组织中有少量淋巴细胞浸润，心肌间质可观察到轻微出血和水肿，较空白对照组炎性反应程度较轻；⑤结果表明，对心脏移植大鼠实施骨髓间充质干细胞治疗可以有效减轻排斥反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0075-9845(赵敏)

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 心脏移植, 器官移植, 免疫功能, 动物实验

Abstract:

BACKGROUND: Heart transplantation is an effective method for treatment of end-stage heart failure, but immune rejection that seriously impact therapeutic effacicy is easy to occur after transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the immune function of rats undergoiong heart transplantation.
METHODS: Twenty Lewis rats were enrolled as donors, and 20 Wistar rats as recipients. Heart transplantation models were established in the Wistar rats. These 20 model rats were randomized into cell transplantation and control group with 10 rats in each group. Forty-eight hours after heart transplantation, rats in the cell transplantation group were given bone marrow mesenchymal stem cell suspension
(1 mL, 2×10⁸ cells/L) via the tail vein, while rats in the control group were given normal saline in the same dose. Then, the expression levels of serum interleukin-2, interleukin-10 and percentage of CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺/CD8⁺, CD4⁺CD25^high, CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ T cells in the venous blood were detected in the two groups at 7 days after cell transplantation. Additionally, rat myocardial tissues were taken and observed pathologically.
RESULTS AND CONCLUSION: The survival time of the cell transplantation group was significantly longer than that of the control group (P < 0.05). The expression level of interleukin-2 showed no significant difference between the two groups (P > 0.05), but the level of interleukin-10 in the cell transplantation group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Compared with the control group, the percentage of CD4⁺/CD8⁺, CD4⁺CD25^high, CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ and CD4⁺ T cells was significantly higher, and the percentage of CD8⁺ T cells was significantly lower in the cell transplantation group (P < 0.05). Histopathological findings showed that there were a small amount of infiltrated lymphocytes in the cell transplantation group with the presence of slight bleeding and edema, and these inflammatory reactions were milder than those in the control group. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can effectively reduce the rejection in rats undergoing heart transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Heart Transplantation, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Immunomodulation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至6月在郑州澍青医学高等专科学校基础医学部实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 ①心脏移植供体：健康雄性Lewis大鼠20只，体质量250 g左右，8周龄，由北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(京)2002-0003；②心脏移植受体：健康雄性Wistar大鼠20只，体质量240 g左右，8周龄，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003；③骨髓间充质干细胞供体：健康雄性Wistar大鼠10只，体质量240 g左右，8周龄，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003。所有动物饲养于郑州澍青医学高等专科学校实验动物中心SPF环境中，常规喂养。研究相关方案均提交医学伦理部门审核，符合相关伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 速眠新注射液(上海育播宠物用品有限公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(上海博升生物科技有限公司)；抗大鼠CD4、CD8、CD25、Foxp3单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；大鼠白细胞介素2、白细胞介素10 ELISA试剂盒(上海弘顺生物科技有限公司)；光学显微镜(上海哈灵生物科技有限公司)；石蜡切片机(北京科誉兴业科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的体外分离、培养 取Wistar大鼠10只，无菌分离股骨和胫骨，剪断骨干骺端，暴露骨髓腔，用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液并反复抽吸吹打，获得单细胞悬液。用注射器接4.5号针头回收细胞悬液于10 mL离心管中，离心后去上清，将沉淀用体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，加入密度为1.085 g/mL的Percoll淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸取中间的乳白色细胞层，用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液重悬，接种于25 cm²塑料培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，3 d后第1次换液，以后每周换液2次，倒置显微镜下观察细胞约80%融合时传代培养，收集第4-6代细胞备用。

1.4.2 实验方案 Lewis大鼠20只作为供体，Wistar大鼠20只作为受体，参照文献[7-10]，采用套管法建立大鼠颈部心脏移植模型。供受体动物肌肉注射速眠新注射液麻醉，注射剂量2 mg/kg。动物保持仰卧位，四肢固定保持伸展状态。受体颈部及供体胸腹部剃毛，体积分数为75%乙醇消毒后切取供体心脏，于10倍镜下用10-0无损伤血管缝线将供心主动脉与受体右颈总动脉行端侧吻合，用9-0无损伤血管缝线将供心主肺动脉与受体右颈外静脉行端端吻合，移植心脏位于右侧颈部皮下，每日观察大鼠心跳、精神状态，如果移植心跳动48 h以上，即可视为模型建立成功。

1.4.3 实验分组及干预^[11-12] 颈部心脏移植模型制备完毕后，20只Wistar大鼠随机分为细胞移植组与空白对照组，每组10只。术后48 h，两组动物肌肉注射速眠新麻醉，细胞移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液，每只1 mL，细胞浓度为2×10⁸ L^-¹，空白对照组经尾静脉注射等量的生理盐水注射液，无其他特殊干预。

1.4.4 ELISA法检测白细胞介素2、白细胞介素10水平^[13-15] 移植后7 d，麻醉状态下尾静脉取血，分离血清，利用双抗体夹心ELISA法检测白细胞介素2、白细胞介素10水平，严格按照说明书进行操作。重复检测3次，取平均值。

1.4.5 流式细胞术检测大鼠血液中CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/ CD8⁺、CD4⁺CD25^high、CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ T细胞百分含量 移植后7 d，麻醉状态下抽取下腔静脉血1 mL置于EDTA抗凝管中，采用流式细胞术检测大鼠血液中CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺CD25^high、CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ T细胞百分含量，计算CD4⁺/CD8⁺比值。

1.4.6 病理学观察 移植后7 d，两组各取5只大鼠，麻醉处死后获得心脏标本进行病理学观察，剩余大鼠继续观察存活天数。每日观察大鼠精神状态，按时触诊移植心脏，观察移植物搏动幅度、节律及速度，停跳者移植物存活时间视为到停跳的前一天。

1.5 主要观察指标 ①心脏的存活时间；②白细胞介素2、白细胞介素10水平；③T细胞占总淋巴细胞的比例；④病理学观察结果。

1.6 统计学分析 实验数据利用SPSS 18.0软件处理，计量资料行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心脏移植是治疗终末期脏器功能衰竭唯一有效的治疗手段，移植后会出现不同程度的免疫排斥现象^[16-18]。临床可通过服用各种免疫抑制药物来抑制免疫排斥，但容易导致各种并发症的出现，不利于提高预后效果^[19-22]。

间充质干细胞具有多向分化的能力，并具有很强的免疫调节作用^[23-25]。间充质干细胞进入机体之后，可以结合不同的环境特点来发挥调节作用，对机体产生不同的免疫反应。间充质干细胞可以发挥出诱导免疫耐受作用，有效抑制移植物抗宿主病的出现，从而提高器官移植成功率，改善预后^[26-30]。王海涛^[31]对同种异体心脏移植大鼠进行骨髓间充质干细胞移植治疗，观察发现细胞移植可以有效减轻心脏的免疫排斥反应，促进移植心脏存活时间的延长，其机制可能与骨髓间充质干细胞调节T细胞转化进而发挥免疫抑制作用有关。

实验制备心脏移植动物模型，观察尾静脉注射受体同系骨髓间充质干细胞对大鼠心脏移植免疫反应的影响。器官移植后急性排斥反应的发生主要与T淋巴细胞相关，是T细胞介导的免疫损伤导致迟发型变态反应，病理学特征表现为以单个核细胞浸润和细胞变性、坏死为特征的局部超敏反应性炎症。研究表明，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞可特异性下调大鼠T细胞对异体大鼠抗原刺激的反应性。所以，Foxp3是目前公认的CD4⁺CD25⁺ Treg细胞的特异性表面标志^[32]。

实验结果显示两组血清白细胞介素2水平差异无显著性意义(P > 0.05)，细胞移植组血清白细胞介素10水平显著高于空白对照组(P < 0.05)。白细胞介素2属于促炎因子，白细胞介素10 属于抗炎因子，骨髓间充质干细胞移植治疗可以有效提高大鼠白细胞介素10水平，说明骨髓间充质干细胞可以发挥出很好的抗炎作用，产生免疫抑制和诱导免疫耐受，提高移植的耐受程度^[33-37]。通过实验还发现，细胞移植组CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD4⁺CD25^high、CD4⁺CD25^high Foxp3⁺ T细胞占总淋巴细胞的比例均显著高于空白对照组(P < 0.05)，CD8⁺ T细胞占总淋巴细胞的比例显著低于空白对照组(P < 0.05)，说明骨髓间充质干细胞移植治疗后，免疫平衡发生了变化，逐渐向免疫抑制方向偏移，进而有效降低急性排斥反应程度，促进移植物的存活^[38-40]。实验中，细胞移植组心脏存活时间显著长于空白对照组，提示骨髓间充质干细胞移植治疗发挥出很好的促进移植物存活的效果。病理学观察也发现，细胞移植组心肌组织中存在少量的淋巴细胞浸润，心肌间质可观察到轻微出血和水肿，较空白对照组炎性反应程度较轻，提示对心脏移植大鼠实施骨髓间充质干细胞治疗可以有效减轻排斥反应。

综上所述，骨髓间充质干细胞移植可以发挥出良好的免疫调节作用，关于其在临床器官移植后免疫调节方面的应用，值得在今后予以进一步分析。