过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.00

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (50): 7507-7517.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.00

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过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

张伟¹，朱肖奇¹，张德才²

1南方医科大学附属深圳宝安医院，广东省深圳市 518101
2深圳市罗湖区中医院，广东省深圳市518001

修回日期:2016-09-21 出版日期:2016-12-02 发布日期:2016-12-02
通讯作者: 朱肖奇，博士，主任医师，南方医科大学附属深圳宝安医院，广东省深圳市 518101
作者简介:张伟，男，1989年生，湖北省麻城市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事脊髓损伤和干细胞治疗方面的研究。
基金资助:
深圳市科技创新委员会资助项目(JCYJ20130329090921096)

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing Shootin1 for treatment of spinal cord injury

Zhang Wei¹, Zhu Xiao-qi¹, Zhang De-cai²

1Affiliated Baoan Hospital of Shenzhen, Southern Medical University, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China
2Luohu District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518001, Guangdong Province, China

Revised:2016-09-21 Online:2016-12-02 Published:2016-12-02
Contact: Zhu Xiao-qi, M.D., Chief physician, Affiliated Baoan Hospital of Shenzhen, Southern Medical University, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China
About author:Zhang Wei, Studying for master’s degree, Affiliated Baoan Hospital of Shenzhen, Southern Medical University, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China
Supported by:
a grant from the Shenzhen Scientific Innovation Committee, No. JCYJ20130329090921096

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
慢病毒：是指以人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
转染：是指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，指外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一类是稳定转染(永久转染)，指外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要一些选择性标记，得到稳定转染的同源细胞系。

摘要
背景：为解决骨髓间充质干细胞体内分化效率低的问题，拟联合Shootin1基因修饰，希望能有效提高脊髓损伤区内骨髓间充质干细胞神经分化的能力，增加细胞移植治疗脊髓损伤的效果。
目的：探讨过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植修复脊髓损伤模型大鼠的神经再生能力。
方法：①通过腺病毒转染48 h，使骨髓间充质干细胞过表达Shootin1；②在体外进行神经诱导分化，免疫荧光检测神经巢蛋白(Nestin)与神经元特异性核蛋白(NeuN)的表达；③运用改良Allen 撞击装置制备脊髓撞击损伤模型，造模后半小时在蛛网膜下腔注射Shootin1转染的骨髓间充质干细胞和未转染骨髓间充质干细胞，脊髓损伤对照组仅进行脊髓损伤手术。脊髓损伤5周后取脊髓样本进行冰冻切片检测神经相关标记。
结果与结论：①腺病毒转染48 h，免疫荧光与Western Blot检测骨髓间充质干细胞内已成功表达Shootin1蛋白；②体外神经诱导分化7 d，3组细胞形态上均发生了变化，Shootin1转染的骨髓间充质干细胞组和未转染骨髓间充质干细胞组Nestin与NeuN的表达差异不明显；③脊髓撞击损伤大鼠体内实验发现，与对照组相比，细胞移植组BBB评分增高。移植Shootin1转染的骨髓间充质干细胞组和未转染骨髓间充质干细胞组均有Nestin，NeuN，GFAP，MAP-2，ChAT，SYN表达的升高，神经再生能力增强。④实验再次认证了骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的显著性效果，Shootin1蛋白对脊髓损伤后的神经再生及神经功能性恢复起到一定作用，但其对于骨髓间充质干细胞直接移植来说修复差异仍不太明显，优化骨髓间充质干细胞对脊髓损伤的治疗仍需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9004-9374(朱肖奇)

关键词: 干细胞, 移植, 脊髓损伤, 骨髓间充质干细胞, Shootin1, 神经再生

Abstract:

BACKGROUND: Genetic modification by Shootin1 aims to effectively improve neural differentiation of bone marrow mesechymal stem cells (BMSCs) in the injured spinal cord, thereby promoting functional recovery from spinal cord injury after cell transplantation.
OBJECTIVE: To explore the nerve regeneration ability of transplanted BMSCs overexpressing Shootin1 in rats with spinal cord injury.
METHODS: BMSCs were transfected using adenovirus-Shootin1 for 48 hours. Then, immunofluorescence staining was used to detect Nestin and NeuN expression levels in the transfected cells under in vitro neuronal induction and differentiation. Animal models of spinal cord injury were made in rats using modified Allen’s method. Thirty minutes later, Shootin1-transfected BMSCs and non-transfected BMSCs were respectively injected into the subarachnoid space of the rats in the transfection and non-transfection groups, respectively. Rats in the model group were given no treatment. Five weeks after modeling, spinal cord samples were taken from each rat to make frozen sections for detection of nerve related markers
RESULTS AND CONCLUSION: After 48-hour adenoviral transfection, Shootin1 expression was successfully detected in BMSCs. After 7-day in vitro induction, the cell morphology in the three groups varied, and there was no significant difference in the expression of Nestin and NeuN between the transfection and non-transfection groups. Basso, Beattie and Bresnahan scores were higher in the two cell transplantation groups than the model group. Increased expression levels of Nestin, NeuN, GFAP, MAP-2, ChAT and SYN were observed in both two cell transplantation groups, indicating a strengthened ability of nerve regeneration. Our experimental findings further confirm that BMSCs transplantation for spinal cord injury has achieved good outcomes, and Shootin1 protein plays a certain role in nerve regeneration and functional recovery after spinal cord injury. However, Shootin1 overexpression shows no obvious additional effects in combination with BMSCs transplantation, and further studies on the optimization of BMSCs transplantation for spinal cord injury are necessary.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Spinal Cord Injuries, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Nerve Regeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张伟，朱肖奇，张德才. 过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7507-7517.

Zhang Wei, Zhu Xiao-qi, Zhang De-cai . Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing Shootin1 for treatment of spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7507-7517.

图/表（结果） 6

2.1 Shootin1转染骨髓间充质干细胞 用携带Shootin1腺病毒与EGFP对照病毒感染骨髓间充质干细胞2 d，出现大量绿色荧光，感染效率可达70%-80%，说明MOI=100可得到较高转染率的细胞。

2.2 免疫荧光与蛋白印迹检测病毒转染后Shootin1 蛋白的表达 图1B显示的是转染目的基因Shootin1- EGFP腺病毒的骨髓间充质干细胞中Shootin1蛋白表达，图1B1中检测到较强的Shootin1荧光信号，且与图1B2中EGFP荧光信号几乎共定位(图1B3)，与对照组(图1A)相比，几乎所有骨髓间充质干细胞均成功转染上目的基因Shootin1，细胞内伴随有Shootin1蛋白的表达。蛋白印迹检测同样可见携带目的基因Shootin1的腺病毒成功转染骨髓间充质干细胞。图1C显示成功转染Shootin1基因的骨髓间充质干细胞中Shootin1蛋白的表达，转染目的基因Shootin1的骨髓间充质干细胞在M_r60 000处出现一条明显的条带，而仅转染报告基因EGFP的骨髓间充质干细胞中未在M_r60 000处出现条带。

2.3 骨髓间充质干细胞体外神经诱导与免疫荧光检测神经标记的表达 图2A-C显示的是3组不同类型的骨髓间充质干细胞体外经过神经诱导7 d后的形态变化。图2A为正常骨髓间充质干细胞组经过神经诱导后细胞形态变化图，该组细胞经过诱导后数量轻微减少，少许细胞形态变为细长形。图2B为转染报告基因EGFP的骨髓间充质干细胞组经诱导后大量减少，且多数细胞呈现椎形样，出现细长突起样延伸，细胞与细胞间类似发生了联系，诱导7 d后细胞突起样长度较正常骨髓间充质干细胞组长(图2D)。图2C为转染目的基因Shootin1的骨髓间充质干细胞组，该组细胞形态与转染报告基因EGFP的骨髓间充质干细胞组出现相同的变化，同时细胞数量减少，且出现较明显的突起样延伸(图2E)。

尽管神经诱导后细胞形态发生了较明显的变化，但仍不能说明细胞形态改变是由诱导剂中添加的化学因子引起的。于是进行了免疫荧光技术检测诱导后细胞中是否表达了神经相关标记。图3A-C为各组骨髓间充质干细胞诱导7 d后Nestin的表达情况。在图3B3、C3中出现的细胞突起样延伸，用免疫荧光技术可在这类细胞突起延伸端检测到明显的荧光信号(图3D和E黄色箭头处)，而在正常骨髓间充质干细胞组中未发现突起样处有荧光信号，而少数形态未发生太大变化的细胞内可检测到荧光信号。

Nestin蛋白的表达能说明体外神经诱导骨髓间充质干细胞已向神经前体细胞分化，随后对体外神经诱导分化后NeuN蛋白表达进行免疫荧光检测，图4A-C为各组骨髓间充质干细胞诱导7 d后NeuN的表达情况。3组均发现NeuN蛋白的表达，且该蛋白主要表达于细胞核内，说明通过体外神经诱导，骨髓间充质干细胞大多数已成功分化为成熟的神经元。

免疫荧光检测3组细胞体外神经诱导7 d后Nestin 与NeuN荧光表达量，利用Image J2.0对荧光强度进行分析，可知3组Nestin与NeuN表达差异无显著性意义 (P > 0.05，图5)。

2.4 骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤运动行为学评价 表1是跟踪5周内脊髓损伤大鼠运动行为学BBB评分情况，脊髓损伤开始0-1周内，3组大鼠运动功能恢复情况差别不大。第4周开始2个细胞移植组大鼠的运动功能恢复情况均较对照组有明显提高。到达第5周，对照组大鼠运动功能恢复仅停留在5.62分左右，而2个细胞移植大鼠的运动功能恢复均达到10分以上。图6显示了5周内脊髓损伤大鼠运动功能恢复趋势，3组大鼠运动功能均有恢复提高，对照组大鼠恢复速率从第4周开始进入平台期，停留于5至6分，进一步运功功能恢复有限。5周内2个细胞移植组大鼠运动功能呈直线上升趋势，5周时均达到10分以上，为对照组的2倍。统计学分析显示骨髓间充质干细胞移植组BBB评分与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组BBB评分与对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，而Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组BBB评分与骨髓间充质干细胞移植组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，在此仅能说明细胞移植对于脊髓损伤具有治疗作用，而Shootin1转染骨髓间充质干细胞与未转染骨髓间充质干细胞移植的治疗效果差异不大。

2.5 脊髓损伤后脊髓组织内部结构的变化情况 图7A为治疗5周后3组大鼠脊髓横断面的苏木精-伊红染色结果。图7B，C为治疗5周后3组大鼠脊髓冠状面的苏木精-伊红染色结果。

脊髓组织切片苏木精-伊红染色结果显示，2个细胞移植组脊髓组织结构均较清晰，白质部分保持完整，灰质中有较小坏死区形成的空洞，瘢痕组织较少，但仍见灰质中组织结构较紊乱，细胞排列不整齐。对照组冠状面切片可见灰质几乎全部被破坏溶解，并形成巨大的空腔，瘢痕组织形成比细胞移植组增多，完整的细胞结构较少，其白质区较细胞移植组范围窄，结构较紊乱。同时发现对照组脊髓组织内细胞数目较细胞移植治疗组偏少。

2.6 免疫组织荧光技术检测脊髓损伤后脊髓内神经标记的表达情况 图8显示的是2个细胞移植组脊髓组织中检测到外源移植细胞的荧光信号，移植细胞的数量均较少。

检测到的外源移植细胞一方面会对损伤脊髓起到修复作用，另一方面大鼠自身也会对外源损伤产生神经修复功能。实验通过检测损伤治疗后第5周6个神经细胞相关标记来说明大鼠脊髓损伤后生理生化功能恢复情况(图9)。

在骨髓间充质干细胞移植组与Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组中可见Nestin表达明显增加，通过对损伤脊髓切片横断面的Nestin荧光强度统计分析可知，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组与对照组比较差异有显著性意义(0.01 < P < 0.05)，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组与骨髓间充质干细胞移植组比较差异也有显著性意义(0.01 < P < 0.05)。

免疫荧光检测脊髓组织NeuN神经元特异性核蛋白表达的结果显示，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组NeuN的表达量也较对照组与骨髓间充质干细胞移植组高，统计学分析可知，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组损伤脊髓切片无论是冠状面还是横断面的NeuN荧光密度均较对照组差异有显著性意义(0.01 < P < 0.05)，同时Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组与骨髓间充质干细胞移植组比较差异也有显著性意义(0.01 < P < 0.05)。该结果说明了在Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组中存在大量成熟的神经元细胞。

免疫荧光检测脊髓组织GFAP表达的结果显示，2个细胞移植组较对照组GFAP表达量增加，且Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组最高。对3组损伤脊髓切片冠状面的GFAP荧光密度分析可知，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组与骨髓间充质干细胞移植组比较差异有显著性意义(0.01 < P < 0.05)。

免疫荧光检测脊髓组织MAP-2表达的结果显示，2个细胞移植组较对照组均有MAP-2表达量的提高，2个细胞移植组SYN表达的荧光信号均较对照组强，可说明2个细胞移植组中的神经元细胞突触功能恢复情况较好。

通过对3组损伤脊髓切片进行神经相关抗体免疫荧光染色与统计学分析，Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组对比对照组只有在Nestin、NeuN、GFAP 3种神经蛋白表达上有明显的差异，Nestin、NeuN数量的增多说明脊髓损伤后的运动功能修复程度较高，对照组GFAP增粗胞体变大，是损伤后胶质增生的表现，而Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组GFAP荧光表达量较对照组低。Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组与骨髓间充质干细胞移植组间差异无显著性意义，暂未有充分证据证明Shootin1蛋白对脊髓修复具有明显作用。

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引言

目前对脊髓损伤所致的截瘫临床上仍缺乏有效的治疗手段，寻求一种有效治疗的新方法已成为脊髓损伤临床治疗的迫切需求。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一种非造血干细胞，具有多向分化潜能，与神经干细胞、胚胎干细胞等其他可用于移植的干细胞比较，具有来源广泛、取材方便、易于体外扩增、免疫排斥反应弱、可进行基因技术加工等优点，成为细胞移植治疗脊髓损伤的研究热点。最近研究发现Shootin1蛋白在胚胎发育和神经系统成熟过程中有重要的神经诱导作用，是神经元极化和轴突生长的关键调节基因^[1]。Toriyarna等^[2^]通过培养大鼠脑内海马区神经细胞，发现Shootin1蛋白是大脑特异性蛋白且在神经发育极化过程中高表达，特别在轴突生长锥生长的2期至3期间募集表达。同时发现在海马区神经细胞胞体和突起间来回移动运输的Shootin 1蛋白对于打破神经细胞的对称性发挥了至关重要的作用。在神经生长发育神经元发生极化通路中Shootin1蛋白与PI3激酶有着密切的关系，Shootin1蛋白的募集可激活轴突极化活动过程相关信号通路上游PI 3激酶的活性，继而使PI 3激酶作用的底物蛋白P-Akt被激活，导致神经元轴突极化过程发生。Shootin1蛋白作用于PI 3激酶上游，需要与PI 3激酶在空间上共定位激活后对神经非对称性极化发挥关键的作用^[1]。目前对Shootin1蛋白作用于神经极化发育的研究仅停留在细胞分子水平上，未见其用于动物体内。实验用Shootin1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤，探讨其能否显著提高脊髓损伤恢复的疗效。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年1至12月在深圳大学医学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级8周龄雌性SD大鼠31只(10只用于制备骨髓间充质干细胞，21只用于建立脊髓损伤动物模型)，体质量250-300 g，由广东省实验动物中心提供。

1.3.2 试剂和仪器 胎牛血清(Sigma公司)；0.25% Trypsin-0.04%EDTA(Gibco公司)；超净工作台、CO₂培养箱、细胞计数仪(德国Thermo公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；改良Allen撞击装置(中国，A21203)；DAPI染色试剂盒(碧云天生物公司)；Nestin抗体、GFAP抗体、NeuN抗体(美国Abcam公司)；Shootin1 Rabbit Polyclonal IgG antibody(美国Abcam公司)；Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG( H+L)、Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG( H+L)、Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG( H+L) (Invitrogen公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离及纯化培养^[3] 选取250 g成年大鼠，以腹腔注射过量2%戊巴比妥钠(0.6 mL)的方式处死，摘除双侧股骨，超净工作台内用PBS洗3次，用含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，接种于10 cm培养皿中，补充培养基至10 mL，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的恒温培养箱中培养，24 h后更换培养液，弃除骨组织、软组织及血细胞等杂细胞。以后根据细胞生长情况，两三天更换1次培养液，8-10 d后细胞融合至80%左右进行传代。待细胞传代至第5代时形态几乎为长梭形，可以认为第5代以后的细胞即为较纯的骨髓间充质干细胞。应用流式细胞术鉴定大鼠骨髓间充质干细胞表型。

1.4.2 Shootin1质粒的构建与腺病毒包装 深圳Biowit公司构建质粒，并包装腺病毒。NCBI中检索了目的基因的基本信息，靶基因名称：Rattus norvegicus similar to 4930506M07Rik protein (RGD1311558)，全长1 902 bp，其mRNA的Gene Bank Ref. ID: NM_001079705.3。使用的腺病毒穿梭载体为pDC316-mCMV-EGFP，带有氨苄Amp抗性，同时带有NheⅠ与NotⅠ酶切位点，因此可根据酶切位点设计引物pDC316-Shootin1-NheI-F，将靶基因Shootin1连接于pDC316-mCMV-EGFP载体上。

穿梭质粒载体pDC316-Shoootin1-mCMV-EGFP构建完成后，用纳米聚合物高效转染试剂polyfectin将病毒载体导入293T细胞进行腺病毒包装。获得了以下滴度浓度的腺病毒液：10 mg/L质粒 pDC316-mCMV-EGFP- rShootin1 10 μL，2×10¹³ PFU/L腺病毒rAV-mCMV- EGFP-rShootin1 1 mL，1×10¹³ PFU/L腺病毒rAV- mCMV-EGFP 1 mL。

1.4.3 Shootin1腺病毒转染骨髓间充质干细胞 将第5代纯化的骨髓间充质干细胞按照5×10⁴/孔接种于预先铺好了直径为14 mm细胞爬片的24孔板中，待细胞充分贴壁铺展开后可进行腺病毒转染。该实验分为两组，每组2孔，一组进行rAV-EGFP-Shootin1腺病毒转染，一组进行rAV-EGFP腺病毒转染。另外，同时接种2个6 cm 培养皿，每皿接种5×10⁵个细胞。一皿转染腺病毒rAV-EGFP，一皿转染腺病毒rAV-EGFP-Shootin1。

1.4.4 免疫荧光检测基因修饰后骨髓间充质干细胞中Shootin1蛋白表达情况 转染48 h待EGFP表达达到高峰时收获细胞。将腺病毒rAV-EGFP-Shootin1及rAV-EGFP转染的骨髓间充质干细胞铺板后进行Shootin1免疫荧光染色。Shootin1一抗(Abcam Rb Polyclonal IgG)按照1︰100稀释后每组的1个孔加入300 μL抗体，另1个孔加入PBS作为阴性对照，4 ℃孵育过夜。第2天室温放置30 min复温，PBS洗3次，去除非特异结合的一抗。荧光二抗Alexa Fluor 594(Goat Anti-Rabbit IgG)按照1︰100稀释后每孔加入300 μL抗体，避光孵育30 min，PBS洗3次，去除未结合游离的二抗。取出细胞爬片，轻轻倒扣于滴加DAPI封固剂(Southern Biotect DAPI Fluoromount-G)的载玻片上，完成封固后可进行荧光检测。

1.4.5 蛋白印迹检测基因修饰后骨髓间充质干细胞中Shootin1蛋白表达情况 收获细胞，制备样品，WB检测，配制分离胶，加样，电泳，转膜，加一抗：用封闭液按1︰1 000稀释一抗Shootin1(Abcam Rb Polyclonal IgG)及Anti β-actin(CWBIO Anti β-actin Mouse Monoclonal Antibody) 4 ℃过夜，然后用TBST漂洗3次× 5 min。加二抗：取封闭液按1︰2 000稀释二抗Goat anti Rb IgG-HRP(CWBIO)及Goat anti Ms IgG-HRP (CWBIO)室温振动孵育1 h，然后用TBST漂洗3次× 5 min。将ECL显色剂A、B按1︰1等体积混合(各1 mL)。取1 mL显色液滴入显影仪上，曝光3-10 min，观察结果。

1.4.6 骨髓间充质干细胞体外神经诱导分化 实验分3组：A组：转染Shootin1的骨髓间充质干细胞组；B组：转染报告基因EGFP的骨髓间充质干细胞组；C组：骨髓间充质干细胞正常对照组。将经过腺病毒rAV-EGFP- Shootin1及rAV-EGFP转染的骨髓间充质干细胞按照5×10⁴/孔接种于预先铺有细胞爬片的24孔板中，补齐培养液至1mL进行培养，24 h后待细胞完全贴壁进行体外神经诱导。先进行预诱导24 h，预诱导培养基：L-DMEM+体积分数为10%胎牛血清+100 μg/L碱性成纤维生长因子，然后改用诱导培养基诱导7 d，诱导培养基：L-DMEM+ 0.1%二甲基亚砜+2 mmol/L维甲酸+100 μg/L碱性成纤维生长因子+100 μg/L表皮生长因子+100 μg/L脑源性神经营养因子^[4]。正常对照组骨髓间充质干细胞未转染，常规培养24 h后进行体外神经诱导。

1.4.7 免疫荧光检测各组Nestin、NeuN的表达差异 每孔细胞用PBS清洗，40 g/L多聚甲醛固定，再加入0.1% Triton X-100透化，然后用5% BSA封闭，加Nestin抗体(Abcam Mouse monoclonal)、NeuN抗体(Abcam Rabbit polyclonal)，按照1︰100稀释，每孔300 μL，4 ℃孵育过夜。第2天室温放置30 min复温，PBS洗3次，去除非特异结合的一抗。加入荧光二抗Alexa Fluro 594 (Goat Anti-Mouse IgG(H+L))、Alexa Fluor(594 Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L))，按照1︰500稀释，每孔300 μL，避光孵育30 min，PBS洗3次，去除未结合游离的二抗。取出细胞爬片，轻轻倒扣于滴加DAPI封固剂(Southern Biotect DAPI Fluoromount-G)的载玻片上，完成封固后可进行荧光检测。

1.4.8 大鼠脊髓损伤模型的建立及细胞移植^[5] 21只SD大鼠随机分3组，每组7只。脊髓损伤对照组仅进行脊髓损伤手术；骨髓间充质干细胞移植组造成脊髓损伤后进行神经诱导后的骨髓间充质干细胞移植；Shootin1转染骨髓间充质干细胞组造成脊髓损伤后进行Shootin1转染神经诱导后的骨髓间充质干细胞移植。

用2%戊巴比妥钠作腹腔麻醉后，按肋骨确定椎体序列以T₉棘突为中心，背部正中切口，长3 cm，分离椎旁肌，显露T₈_-₉棘突，咬骨钳咬除T₈_-₉棘突，小心去除椎板，暴露T₁₀段脊髓，用改良的Allen’s撞击装置制备脊髓损伤动物模型^[6]，用拉钩拉开脊髓两侧软组织，牵拉固定，使脊柱稳定，不受呼吸运动影响，将40 g的撞击棒从5 cm高度自由落体，致伤能量200 g•cm，撞击T₁₀骨窗对应的脊髓，造成急性脊髓损伤。脊髓损伤模型撞击造模成功的标准^[7-8]：撞击后的脊髓组织出现水肿、膨隆、出血，硬脊膜保持完整且呈紫红色，大鼠尾巴偶出现痉挛性摆动。脊髓损伤完成后，用胰岛素注射器吸取10 μL神经诱导后的骨髓间充质干细胞或Shootin1转染神经诱导后的骨髓间充质干细胞，细胞量为1×10⁶，注射入脊髓损伤中心头侧2 mm处，留针1 min。常规分层缝合后回笼饲养。术后每日腹腔注射青霉素8×10⁴ U，庆大霉素0.2×10⁴ U，维持7 d。术后人工排尿，2次/d，直到动物自身恢复排尿反射能力。大鼠共计死亡2只，出现在脊髓损伤对照组。行为学评价时每组只统计5只大鼠。

1.4.9 行为学检测各组大鼠运动功能恢复情况 参照BBB运动评分系统提出的脊髓损伤大鼠功能恢复评判标准即BBB评分法(共21级)^[9]，对各组动物进行评分并记录，它将大鼠后肢运动分为22个等级。后肢全瘫为0分，完全正常为21分，其基本内容为：活动关节的数目和运动范围，负重程度及前后肢协调性，前、后爪和尾部的运动情况。评分时使用双盲法对各组动物后肢运动能力进行评估，BBB评分观察期为5 min，动物应尽量保持在监测范围的中心区域活动。分别在脊髓损伤后1，2，3，4周记录大鼠双后肢运动功能恢复情况。

1.4.10 组织学检测 脊髓损伤5周后，麻醉大鼠，进行心脏灌注，取出以损伤区为中心，头尾侧各1 cm长度的脊髓段，置于40 g/L多聚甲醛中固定过夜。第2天按照10%、20%、30%梯度沉糖法兑换水分进行脱水处理，然后包埋，冰冻切片，进行苏木精-伊红染色检测脊髓组织结构，同时用免疫荧光检测脊髓组织神经相关标记：消除组织内过氧化物酶，封闭及细胞透化，加入一抗Nestin(Abcam Mouse monoclonal)1︰200、NeuN (Abcam Rabbit polyclonal) 1︰500、MAP-2(Cell Signaling Technology Rabbit polyclonal) 1︰200、GFAP(Abcam Mouse monoclonal) 1︰50、ChAT (Abcam Rabbit polyclonal) 1︰200，Synaptophysin (Millipore Mouse Monoclonal) 1︰100 置于4 ℃冰箱孵育过夜，复温PBS冲洗后滴加1︰500荧光二抗Alexa Fluro 594 (Goat Anti-Mouse IgG(H+L))、Alexa Fluor 594 (Goat Anti-Rabbit IgG)室温孵育1 h，封固后在荧光显微镜下进行观察。

1.5 主要观察指标 各组BBB评分以及脊髓组织中Nestin、GFAP、NeuN、MAP-2、ChAT、突触素等神经相关蛋白表达的差异。

1.6 统计学分析 荧光强度使用ImageJ 2×进行计算，数据以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0软件，细胞移植治疗组与对照组间的比较采用单因素方差分析及q 检验，两个细胞移植治疗组间比较采用t 检验。

讨论

骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤后，损伤脊髓内可见神经相关的细胞增多。脊髓获得神经修复和治疗的过程是多方面综合的结果，一方面有学者认为可能是外源干细胞进入体内可迁移至损伤区，替代损失的神经细胞发挥生物学功能，同时连接上下行神经元突触，重塑神经传导通路，达到脊髓损伤修复的作用^[10]；另一方面可能是由移植外源干细胞对损伤后内源性的机体内干细胞产生激活作用，启动内源性干细胞与外源干细胞一起进行神经修复，替代损失的神经细胞，达到脊髓损伤修复的作用；又一方面可能是外源干细胞进入损伤处，分化为神经相关的其他类细胞，这类细胞与骨髓间充质干细胞同时产生神经营养因子，如神经营养因子3、血管内皮生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子等^[11]，从而改善损伤脊髓的微环境，促进血管再生、突触再生以及神经环路重建^[12]。

实验结果显示骨髓间充质干细胞移植组与Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组中Nestin与NeuN表达均较对照组高，可能是外源干细胞进入机体后激活了内源性干细胞与外源性干细胞一起启动神经分化，修复损伤的神经元，Nestin阳性细胞的增多为后期神经分化、补充丢失的神经元和神经胶质细胞做好了物质的储备。实验结果显示对照组中GFAP呈粗短状且胶质增生程度较高，MAP-2呈现不连续微管丝状，ChAT、SYN表达量均较细胞移植组低，可能是由脊髓损伤后炎症反应引起胶质细胞活化增生产生不利于脊髓修复的微环境，脊髓组织结构受到严重破坏导致细胞大量死亡，炎症因子加上坏死细胞内释放的蛋白酶导致细胞骨架蛋白——MAP-2降解，神经元细胞大量死亡、突触结构被破坏导致ChAT、SYN表达下降。当间充质干细胞移植体内进行治疗后，2个细胞治疗组均呈现胶质增生化减缓，MAP-2呈现连续清晰的微管丝状，ChAT、SYN表达量明显上升，其可能的原因与间充质干细胞进入损伤区后释放的神经营养因子对脊髓损伤修复起到的积极作用有关。在胶质增生化程度较低的微环境里，GFAP阳性细胞也会释放神经营养因子协同外源间充质干细胞分泌的神经因子促进脊髓修复。

尽管实验结果已充分显示了间充质干细胞治疗组与对照组之间的明显差别，但未获得Shootin1转染骨髓间充质干细胞移植组与骨髓间充质干细胞移植组脊髓修复的显著性差异，其原因可能与以下2个方面密切相关：①实验操作上仍存在大量非可控因素造成的偏差，如实验造模时撞击位置的不固定性、动物个体内在体质的差异、由于损伤部位偏差造成的脊髓切片段位的非一致性等，均是实验结果未获得满意的原因；②Shootin1蛋白在体内的功能未达到最大程度的发挥，换句话说，Shootin1蛋白功能的发挥也许不仅靠其自身就可进行，其为一个作用于微丝及微管间的极化聚集蛋白，需要某个或者一类辅助分子协同进行作用方可将其功能最大化，这与Shootin1蛋白在体外神经分化诱导上的限制因素可能也相关，包括Shootin1蛋白在体内磷酸化激活的程度以及Shootin1蛋白参与极化活动所需的运输分子Kif20b等。

已有研究表明Shootin1蛋白是神经元极化和轴突生长的关键调节基因，在胚胎发育和神经系统成熟过程中起到重要的神经诱导作用。Shootin1蛋白在神经发育2期和3期的轴突生长锥中聚集，其过表达可诱导多个轴突的形成，而Shootin1的敲除则会抑制神经极化。在actin富集的结构中Shootin1更容易被转运至生长锥处^[13]。有研究发现Shootin1蛋白与Kif20b共同调节大脑发育过程中椎体神经元的极化^[14]。Kif20b是一个微管相关驱动蛋白超级家族的分子马达蛋白。Kif蛋白超级家族参与了细胞的迁移、物质运输、细胞骨架运输等多种生理活动。突触小泡前体细胞由KIF5和KIF1A或KIF1B转运^[15]。在伸长的神经突末端PIP3募集引导轴突生长，是由依赖马达分子Kif13b完成的^[16]。PIP3募集引发的驱动蛋白定位迁移和转运，均由Kif13b调节^[14]。Kif11具有调节大脑神经元迁移的作用，Kif11的敲除导致了椎体神经元快速迁移，而过表达Kif11抑制了神经元的迁移^[17]。Kif20b蛋白起初被作为细胞有丝分裂的驱动蛋白，并在参与有丝分裂过程中被高度磷酸化^[18]。Kif20b呈现出微管依赖的分子马达作用，同时在胞质分裂中与微管充分结合^[19]。至今Kif20b在神经元中并未有研究，尽管有人已认为Kif20b可能作用于有丝分裂后的神经元细胞^[20]。

Tamar等研究结果已显示Kif20b和Shootin1/ Kif20b对初级海马区神经元极化、椎体神经元极化和迁移是非常重要的。Shootin1/Kif20极化复合体在神经元迁移中发挥了重要作用。Shootin1和 Kif20b在发育的小鼠大脑高表达，它们在体内形成复合体并分别与初级神经元中的微管共定位。随着微管的聚合和解聚，Shootin1在微管相关蛋白的小片段中被检测到，即Shootin1与神经发育中微管的生物学活动有着密切的关系^[14]。Shootin1和 Kif20b基因敲除会阻碍神经元的迁移活动。Shootin1结合了Kif20b 57个负极区的氨基酸序列。Shootin1蛋白与Kif20b相互作用需要Shootin1蛋白N末端与Kif20b酪氨酸肽段的结合，两者的相互作用区域并不会遮盖Shootin1与actin的结合，因为与actin的结合在Shootin1蛋白的C末端^[15^，^21]。

目前有研究者已发现Shootin1是 Kif20b微管运动依赖性的货物蛋白且Shootin1蛋白与Kif20b相互作用后可通过 Kif20b的运输达到轴突生长锥。Kif20b的促极化功能体现在初级海马区神经元内调节Shootin1和PIP3的运输以及神经元迁移过程中，神经极化和迁移均有Kif20b蛋白的参与^[14]。

实验在现有的实验平台上并未获取到充分的证据证明Shootin1对骨髓间充质干细胞神经分化以及对脊髓损伤发挥更显著的作用，可能的原因为Shootin1对神经分化与极化发生过程中需要分子马达蛋白Kif20b的参与，在没有Kif20b存在的情况下，Shootin1尽管在骨髓间充质干细胞内高表达，但未有充分的Kif20b驱动蛋白与其作用，使得Shootin1转运积聚于生长锥中影响神经极化发生。同样在脊髓损伤移植后，若Shootin1转染骨髓间充质干细胞在体内能发生神经修复的作用，启动神经分化与神经元极化，靠Shootin1蛋白的存在而缺少足够的转运分子马达Kif20b蛋白也是不能实现的。因此，希望骨髓间充质干细胞不仅过表达Shootin1蛋白，同时也过表达Kif20b蛋白，在结合Kif20b 蛋白作用后，骨髓间充质干细胞的体外神经分化效率可显著提高，同时经过这两种基因Shootin1与Kif20b修饰的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤动物体内也能发挥更优于骨髓间充质干细胞单独移植治疗的效果，在Kif20b蛋白辅助下Shootin1的潜在功能可在脊髓损伤治疗中最大程度地被发掘使用。

结论：①骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤治疗具有明显的作用；②Shootin1体外诱导骨髓间充质干细胞朝神经方向分化的效果不明显；③Shootin1体内诱导骨髓间充质干细胞进行脊髓损伤后神经再生修复的效果不明显，Shootin1对骨髓间充质干细胞神经诱导分化的能力有待更进一步研究；④骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的机制可能有3方面：外源的干细胞进入体内可迁移至损伤区，替代损失的神经细胞发挥生物学功能。移植外源干细胞激活内源干细胞，对损伤脊髓进行修复。外源干细胞进入损伤处分化为神经细胞，分泌神经营养因子，进行脊髓损伤再生。

过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing Shootin1 for treatment of spinal cord injury

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