构建HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物及对乳腺癌细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.019

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (49): 7425-7435.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.019

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构建HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物及对乳腺癌细胞增殖的影响

刘逸之1，赵新汉2，吕卫东3，常柏玲1

陕西省肿瘤医院，1肿瘤内科，3胸外科，陕西省西安市 710061；2西安交通大学第一附属医院肿瘤内科，陕西省西安市 710061

收稿日期:2016-09-02 出版日期:2016-11-30 发布日期:2016-11-30
通讯作者: 吕卫东，博士，副主任医师，陕西省肿瘤医院胸外科，陕西省西安市 710061
作者简介:刘逸之，男，1971年生，陕西省宝鸡市人，1995年白求恩医科大学毕业，副主任医师，主要从事实体瘤化疗研究。
基金资助:
陕西省自然科学基金面上项目(2013JM3010)

Preparation of HSA-PEI-pcDNA-Apoptin and its effect on the proliferation of breast cancer MCF-7 cells

Liu Yi-zhi1, Zhao Xin-han2, Lv Wei-dong3, Chang Bai-ling1

1Department of Medical Oncology,3Department of Thoracic Surgery, Tumor Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China; 2Department of Medical Oncology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Received:2016-09-02 Online:2016-11-30 Published:2016-11-30
Contact: Lv Wei-dong, M.D., Associate chief physician, Department of Thoracic Surgery, Tumor Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
About author:Liu Yi-zhi, Associate chief physician, Department of Medical Oncology, Tumor Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shaanxi Province, No. 2013JM3010

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物：是将构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin，经电荷中和效应与人血白蛋白-聚醚酰亚胺(HSA-PEI)复合物连接，形成相应复合物。因其带有Apoptin基因，故具有Apoptin基因的诱导肿瘤特异性细胞凋亡作用而对正常细胞无毒性。
细胞凋亡素(Apoptin)：是一种具有高度保守性的蛋白，其只诱导癌细胞或有成癌倾向的细胞凋亡，对各种原代正常细胞均没有杀伤效应。此外，Apoptin诱导凋亡的的机制是非P53依赖性凋亡，且不受抗凋亡因子Bcl-2的抑制。Apoptin有望成为一种极具应用前景的抗肿瘤制剂。

摘要
背景：凋亡素(Apoptin)能诱导50种以上不同类型的肿瘤细胞凋亡，有望成为一种极具应用前景的抗肿瘤制剂。如何安全、有效地将其应用于临床，是一个亟待解决的最具现实意义的问题。
目的：拟制备人血清白蛋白(HSA)与Apoptin基因的复合物，通过体内外实验验证其抗瘤效果，为Apoptin尽早应用于基因治疗寻找一个简单有效的转移方式。
方法：①构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin。以水溶性碳二亚胺(EDC)为交联剂，将聚醚酰亚胺(PEI)与人血清白蛋白(HSA)连接，合成HSA-PEI复合物，然后经电荷中和效应将HSA-PEI复合物与pcDNA-Apoptin重组体及pcDNA空载体分别连接，形成相应HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物；②将HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物转染乳腺癌MCF-7细胞，Western blot检测Apoptin基因在细胞中的表达，MTT法和流式细胞术检测转染后细胞增殖情况；③建立裸鼠乳腺癌模型，使用尾静脉注射法，分别将0.5 mL HSA-PEI-pcDNA-Apoptin、HSA-PEI-pcDNA及生理盐水注射入裸鼠体内，4周后测量肿瘤体积。
结果与结论：①成功构建并鉴定了HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物，体外成功转染乳腺癌MCF-7细胞；②HSA-PEI-pcDNA-Apoptin转染MCF-7细胞24 h有Apoptin蛋白的表达，而转染HSA-PEI-pcDNA细胞及空白对照组细胞未见Apoptin蛋白的表达；③体外细胞增殖实验提示HSA-PEI-pcDNA-Apoptin组吸光度值明显低于HSA-PEI-pcDNA组及空白对照组(P < 0.05)；④裸鼠乳腺癌模型HSA-PEI-pcDNA-Apoptin组肿瘤体积小于HSA-PEI-pcDNA组及空白对照组(P < 0.05)；⑤结果表明，HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物有明显的抑制肿瘤作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID:0000-0003-2685-4218(吕卫东)

关键词: 实验动物, 细胞损伤与修复模型, 凋亡素, 乳腺癌, 增殖, 基因治疗, 人血清白蛋白, 载体, 细胞凋亡, 细胞转染, 体外培养, 陕西省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Apoptin is known to induce apoptosis of more than 50 kinds of tumor cells. However, efficient systems are required to deliver apoptin to the cancer cells for clinical use.
OBJECTIVE: To construct human serum albumin (HSA) and Apoptin complex and transfect it to cancer cells in vitro and in vivo so as to find an efficient approach for apoptin delivery.
METHODS: Polyethylenimine was used to react with N-hydroxysuccinimide (NHS)-HSA solution to synthesized HSA-PEI, and then react with pcDNA-Apoptin to construct recombinant HSA-PEI-pcDNA-Apoptin. HSA-PEI-pcDNA-Apoptin complex was transformed into MCF-7 breast cancer cell lines. Then the expression of apoptin was detected by western blot assay and the cell proliferation was detected by MTT assay and flow cytometry. The MCF-7 breast cancer cell xenograft model was used to detect the in vivo performance of HSA-PEI-pcDNA-Apoptin by measuring the tumor volume at 4 weeks, with saline and HSA-PEI-pcDNA as controls.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) We successfully prepared and confirmed the construction of HSA-PEI-pcDNA-Apoptin complex, which was successfully transformed into MCF-7 cells. (2) MCF-7 cells could express apoptin in the HSA-PEI-pcDNA-Apoptin group at 24 hours, but neither HSA-PEI-pcDNA group nor blank control group could express apoptin. (3) MTT assay for cell viability showed that HSA-PEI-pcDNA-Apoptin group had significantly lower optical density value than that in the other two groups (P < 0.05). (4) The tumor volume in the HSA-PEI-pcDNA-Apoptin group was significantly less than that in the other two groups (P < 0.05). (5) These findings indicate that the HSA-PEI-pcDNA-Apoptin complex markedly inhibits tumor growth in vitro and in vivo.

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Key words: Breast Neoplasms, Apoptosis, Gene Therapy, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘逸之，赵新汉，吕卫东，常柏玲. 构建HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物及对乳腺癌细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7425-7435.

Liu Yi-zhi, Zhao Xin-han, Lv Wei-dong, Chang Bai-ling . Preparation of HSA-PEI-pcDNA-Apoptin and its effect on the proliferation of breast cancer MCF-7 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7425-7435.

图/表（结果） 5

参考文献

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引言

细胞凋亡素(Apoptin)是来源于鸡贫血病毒(chicken anemiavirus，CAV)的一种具有高度保守性、不与其他任何动物或病毒享有序列同源性的蛋白^[1]。因其凋亡诱导效应而得到研究者的青睐，尤其在抗肿瘤治疗领域。真正令人们感兴趣的是Apoptin引起肿瘤特异性细胞凋亡但对正常细胞无毒性：Apoptin只诱导癌细胞或有成癌倾向的细胞凋亡，对各种原代正常细胞均没有杀伤效应^[2-3]。此外，Apoptin诱导凋亡的机制是非P53依赖性凋亡，且不受抗凋亡因子Bcl-2的抑制^[4-6]。显然，Apoptin的这些特性表明了其作为一种抗肿瘤生物制剂有着强大的优势。现已发现，Apoptin具有“广谱”抗癌能力，它能诱导50种以上不同类型的肿瘤细胞凋亡。因此，Apoptin有望成为一种极具应用前景的抗肿瘤制剂^[7]。

如何安全、有效地将其应用于临床，是一个亟待解决的最具现实意义的问题。有效的基因转移手段是实施基因治疗的关键之一。由于裸DNA分子容易被血清中的核酸酶降解，有必要给DNA 穿上“防弹衣”。近年来，非病毒基因转移系统以其安全、稳定、价廉等优点而备受青睐，其中包括以天然或合成的蛋白质作为基因运载工具^[8]。人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是血清中含量最高的蛋白质，也是血液运输系统的主力军。HSA 还是机体细胞重要的营养来源，肿瘤生长要消耗大量营养物，HSA优先在实体瘤中聚集^[9]。最近，HSA-DNA复合物被成功制备，而且复合物稳定性、细胞毒性、抗核酸酶能力以及转染和表达效率等检测结果表明：白蛋白可能是一个理想的基因运输工具^[10]。

作者设想制备适合于基因传递的HSA与Apoptin复合物，并且优化复合物性能，以期获得良好的体内外表达，诱导肿瘤细胞凋亡从而达到抗瘤效果。Apoptin能诱导乳腺癌细胞凋亡^[11]，但既往研究局限在Apoptin蛋白本身对肿瘤的影响，而以下实验研究HSA与Apoptin形成的复合物对乳腺癌MCF-7系细胞的促凋亡作用。

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材料方法

1.1 设计观察实验。

1.2 时间及地点于2013年9月至2015年8月在陕西省肿瘤医院基础研究室及西安交通大学医学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物四五周龄雌性健康BALB/c(nu-nu)无胸腺裸小鼠15只，体质量15-17g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。饲养于SPF环境，恒温22-25 ℃，恒湿50%-65%。

1.3.2 主要细胞、试剂乳腺癌MCF-7系细胞(中国科学院上海细胞库)；pEGFP-N1质粒(西安交通大学赵新汉教授馈赠)；内切酶、连接酶、Tap酶(Sigma公司)；HSA、PEI(Sigma公司)；质粒提取试剂盒(美国OMEGA公司)；DMEM培养液、胎牛血清(Hyclone公司)；四甲基偶氮唑盐(北京鼎国生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 真核表达载体pcDNA-Apoptin构建采用primer 5.0设计引物，矫正末端突变碱基编码链5’- ACG AAT TCC GAT GAA CGC TCT CCA AGA AGA TAC TC-3’，反义链5’CAG GAT CCG TFG ACA GTC TFA TAC ACC TTC TTG CG-3’。引物两端引入BamHⅠ、EcoRⅠ限制性酶切位点。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。pEGFP-N1质粒及PCR产物进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切。在回收目的片段后，以T₄连接酶处理，然后筛选出需要的克隆。

1.4.2 HSA-PEI构建使用10 mg HSA溶解于pH为4的MES/NaCl缓冲液中(0.05 mol/L MES和0.5 mol/L NaCl)。300 mg N-乙基N(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.06 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于MES/NaCl缓冲液中，形成NHS-HSA酯。10 mg PEI与NHS-HSA溶液反应，通过磁力搅拌器在室温下搅拌20 h。使用HITRAP SP FF离子交换柱试剂盒(脱盐)来净化合成HSA-PEI。最终产物冷冻干燥，密封，并贮存于-20 ℃。高效液相分子排阻色谱法(HPLC-SEC)检测其合成。

1.4.3 HSA-PEI-pcDNA-Apoptin构建 HSA-PEI和pcDNA-Apoptin 各10 μg分别溶解于100 mL纯净水中。将混合物在室温下搅拌30 min，以形成纳米尺寸的复合物。1%琼脂糖凝胶电泳检测其构建。

1.4.4 体外转染MCF-7细胞将人乳腺癌MCF-7细胞种植于24孔板内，待细胞生长至对数期时，设置不同质量浓度HSA-PEI-pcDNA-Apoptin(0，0.1，0.25，0.5，1.0 g/L)加入细胞培养液内，培养箱内培养24 h后换液，使用PBS清洗细胞后于荧光显微镜下挑选转染效率最高，质量浓度最低条件进行下一体外实验。Western blot检测Apoptin在细胞中的表达，β-actin作为内参(n=5)。

1.4.5 体外细胞增殖实验人乳腺癌MCF-7细胞制成细胞浓度为4×10⁷ L^-1单细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL，分为生理盐水空白组、HSA-PEI-pcDNA组和HSA-PEI- pcDNA-Apoptin组(n=12)。置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱，在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养液中培养24 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清，加150 μL二甲基亚砜，室温振荡15 min，490 nm处测定每孔吸光度值。

1.4.6 体内肿瘤抑制实验 MCF-7乳腺癌细胞用含体积分数为10%胎牛血清RPMI1640培养液在体积分数为5%CO₂、37 ℃饱和湿度恒温箱中培养，每隔2 d传代1 次，待传代足够数量后取对数生长期细胞配成细胞悬液，细胞浓度调至1×10¹⁰L^-1。裸鼠用1%戊巴比妥(0.1 mL/kg)麻醉，从裸鼠右侧胸壁皮肤切开，暴露第2对乳腺的脂肪垫，向其中注入0.1 mL细胞悬液，相当于1×10⁶/只；每天观察肿瘤生长情况，用游标卡尺测量肿瘤大小，按体积=(长×宽²)/2计算肿瘤体积。第3周，可在2只裸鼠的右侧腋下发现2 mm×2 mm的质硬、局限皮下结节。第5周，皮下结节长至100 mm³，将瘤鼠随机分为3组，每组5只。使用尾静脉注射法，分别将0.5 mL HSA-PEI- pcDNA-Apoptin、HSA-PEI-pcDNA及生理盐水注射入裸鼠体内，4周后将建立好的乳腺癌荷瘤裸鼠采用颈椎脱位法处死并测量肿瘤大小。

1.5 主要观察指标 ①琼脂糖凝胶电泳检测HSA-PEI-pcDNA-Apoptin的构建；②Western blot检测Apoptin在MCF-7细胞中的表达；③MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况；④体积法测量荷瘤裸鼠肿瘤生长情况。

1.6 统计学分析实验数据均以x(_)±s表示，采用 SPSS 18.0软件进行统计分析，多个样本的比较用方差分析，多个样本的两两比较采用q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白，能诱导雏鸡T淋巴细胞前体细胞和造血母细胞凋亡，导致雏鸡出现免疫机能低下及严重的贫血^[12]。Apoptin还能诱导人肿瘤细胞凋亡，但不诱导正常的人二倍体细胞凋亡^[13-14]，因此其被认为是第一个真正意义上不损伤正常细胞而可选择性诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白，在肿瘤基因治疗领域应用的潜力巨大^[15-16]。已有将其与腺病毒载体重组的研究报告，且取得了满意的治疗效果^[17]，但将其与非病毒载体构建基因-载体复合物的报道较少^[17-18]。

基因治疗载体的理想要求是安全有效、可控性好、靶向性好、穿透性能好、易转移和方便制备等^[19]。目前肿瘤基因治疗载体的靶向性差，其所携带的目的基因进入体内后除了对肿瘤组织起作用，往往会对正常组织也产生损伤^[20]。因此，提高基因治疗载体的靶向性是目前肿瘤基因治疗研究的热点之一^[21]。

HSA具有优良的生物降解性、无毒性、抗原性及稳定性，近年来逐渐被用于药物载体，尤其是肿瘤药物^[22]。将HSA与基因偶联行基因治疗的研究较少。聚乙烯亚胺(PEI)是一种高性能聚合物，具有较高的阳离子电荷密度，是非常有前景的基因治疗载体，对细胞毒性小，转染效率高，能将各种报告基因转入各种属细胞^[23]。目前在设计基因载体时，PEI经常作为核心组成成分。HSA-PEI结合体已被用作纳米颗粒载体^[24]。

以前有研究成功构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin^[25]。实验成功将PEI与HSA连接，合成HSA-PEI复合物，然后经电荷中和效应将HSA-PEI复合物与pcDNA-Apoptin重组体连接，形成相应复合物。琼脂糖凝胶电泳检测和Apoptin蛋白检测证实获得了HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物。进一步的体外肿瘤细胞增殖实验提示HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，体内实验提示荷瘤裸鼠注射HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物后肿瘤生长明显得到抑制。作为对照的HSA-PEI-pcDNA组和生理盐水空白对照组肿瘤生长无区别，这说明HSA-PEI- pcDNA-Apoptin复合物的抑瘤作用主要靠Apoptin发挥作用。

实验首次利用HSA作为Apoptin基因传递的工具，并成功合成HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物，体内外实验均提示其明显的抑瘤作用。该实验为Apoptin的基因治疗和广泛应用奠定基础，动物实验选用裸鼠结果有利于向人体推广，为肿瘤基因治疗提供一种新型基因传递系统，将增加基因治疗的安全性、有效性和靶向性，并降低基因治疗成本。

当然，该研究有一定的局限性，HSA-PEI-pcDNA- Apoptin复合物仅在乳腺癌细胞转染，进一步需要在多种肿瘤细胞上验证。

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