气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤动物模型的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.013

摘要/Abstract

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文题释义：
气虚血瘀：为虚实夹杂之中医证型，以气虚与血瘀证候同时并见为特点。其病因病机为各种原因导致脏腑气机衰弱，气虚无力推动血行，血行不畅而形成瘀滞。患者常有面色淡白，身倦乏力，少气懒言的气虚之证；兼有瘀血内阻，血行缓慢，瘀阻络脉之表现，如疼痛、面色晦滞等，甚至出现脏器的微循环障碍。
Corti器：又称螺旋器，为听觉感受器，位于内耳膜迷路蜗管基底膜上，其感觉细胞为内、外毛细胞，支持细胞为柱细胞、内指细胞、Deiter细胞、内缘细胞、Hensen细胞和Claudius细胞等。其盖膜附着在毛细胞和Hensen细胞上面，毛细胞底部有神经纤维发出连接螺旋神经节，Corti器将内淋巴震动的机械能转化电能即神经冲动，通过神经传导通路上传至大脑皮质听觉中枢从而产生听觉。

摘要
背景：随着中医药对耳鸣耳聋的疗效越来越受到重视，但对其机制尚缺乏系统深入的研究，利用动物模型进行中医药治疗耳鸣耳聋的机制探索是非常有意义的研究方向。
目的：建立一种气虚血瘀证型的Corti器毛细胞损伤动物(豚鼠)模型并评价其效果。
方法：12只成年豚鼠按随机数字表法分为正常对照组和造模组。造模组首先采用改良耗气破气加饥饱失常法处理15 d进行气虚造模，之后以光化学反应法复制血瘀Corti器毛细胞损伤模型；正常对照组不干预。造模后检测两组豚鼠血清的D-木糖浓度，行耳声发射DPOAE测试，并观察光镜下耳蜗组织形态。
结果与结论：①与正常对照组相比，造模组血清D-木糖浓度较低(P < 0.01)；②耳声发射DPOAE测试结果显示，造模组1 560，3 125 Hz DPOAE幅值较正常对照组及造模前降低(P < 0.01)；③造模组耳蜗组织形态发生变化：螺旋韧带、基底膜微血管及蜗轴毛细血管内有血管扩张、微血栓形成，血管纹水肿变性；Corti 器内毛细胞变性、坏死或缺失；④提示：模型成功模拟了豚鼠气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤的过程，未来可应用于中医药治疗耳鸣耳聋特别是突发性耳聋的机制研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0003-3873-0845(彭桂原)

关键词: 实验动物, 细胞损伤与修复模型, 气虚血瘀, Corti器毛细胞损伤, 豚鼠, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Traditional Chinese medicine holds therapeutic potential for deafness and tinnitus, but there is a lack of in-depth research about the underlying mechanism, so establishing an animal model maybe helpful to explore the mechanism.
OBJECTIVE: To establish hair cell damage model in the Corti organ with Qi deficiency and blood stasis in guinea pigs, and to assess its effects.
METHODS: Twelve adult guinea pigs were randomly divided into normal control and model groups by random number table method. Guinea pigs in the model group were firstly treated with the modified relieving stagnated Qi and abnormal starvation for 15 days to model Qi deficiency, and then stimulated hair cell damage with blood stasis by photochemical induction. The controls received no intervention. Subsequently, the detection of serum D-xylose content and DPOAE test were performed, and the cochlea morphology was observed under light microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The serum D-xylose content in the model group was significantly lower than that in the normal control group (P < 0.01). (2) DPOAE test revealed that the amplitudes of 1 560 and 3 125 Hz in the model group were lower than those in the normal control group and before modeling (P < 0.01). (3) In the model group, hemangiectasis and microthrombosis appeared in the spiral ligament, microvascular basement membrane and modiolus capillaries, and stria vascularis presented edema and degeneration; degeneration, necrosis or loss of hair cells were visible in the Corti organ. (4) To conclude, the model of hair cell damage in the guinea pig with Qi deficiency and blood stasis is established successfully, which will provide a research tool for figuring out the mechanism underlying the traditional Chinese medicine for treating deafness and tinnitus, especially sudden hearing loss.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Hair Cells, Auditory, Organ of Corti, Tinnitus, Guinea Pigs, Models, Animal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

彭桂原，李松键，杨黎，杨朝杰，谭串. 气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤动物模型的建立[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7384-7390.

Peng Gui-yuan, Li Song-jian, Yang Li, Yang Chao-jie, Tan Chuan. Establishing hair cell damage model in the animal Corti organ with Qi deficiency and blood stasis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7384-7390.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 12只豚鼠均进入结果分析。造模流程图见图1。
2.2 模型更接近人类的特点豚鼠的耳蜗对声波较敏感，其反应与人类相似，常用于耳及听觉方面的研究；而豚鼠为哺乳类动物，因此其制作出的动物模型在生理及病理上更接近于人类。造模中使用的耗气破气及饥饱失常为临床上引起患者气虚的常见病因，光化学法模拟了血瘀的形成过程，与血瘀证的病机相符。造模后豚鼠表现出的体质量下降、精神萎靡，蜷卧，行动迟缓等症状均为中医气虚证患者的典型症状表现。
2.3 实验动物外观形态采用耗气破气加饥饱失常法处理15 d后，造模组6只豚鼠均出现不同程度的体质量下降、精神萎靡，蜷卧，行动迟缓等中医气虚证的典型症状表现(图2)，被毛有不同程度的枯槁、脱落，大便稀烂。而对照组6只豚鼠体质量逐渐增加，动作灵活，皮毛始终光滑、润泽，大便正常。
2.4 实验动物血清D-木糖浓度变化结果表明，与正常对照组(5.094 8±0.980 6) mmol/L相比，造模组血清D-木糖浓度较低，为(3. 351 5±1.186 7) mmol/L，组间差异有非常显著性意义(P < 0.01)。说明造模后豚鼠的吸收消化能力下降，证实豚鼠出现类似中医气虚运化无力表现。
2.5 实验动物耳声发射DPOAE测试结果为证实实验动物耳蜗Corti器毛细胞的情况，在造模前后进行耳声发射DPOAE测试，造模后各频率DPOAE幅值均有不同程度的降低，见图3。
表1，2显示造模后耳声发射DPOAE各频率幅值及SNR值均下降(P < 0.01)，提示造模组豚鼠耳蜗Corti器毛细胞损伤，造模成功。
2.6 耳蜗病理检查造模组光镜下耳蜗病理切片形态变化如下：耳蜗各回的螺旋韧带、基底膜螺旋缘微血管及蜗轴毛细血管内有血管扩张、微血栓形成等现象，血管纹水肿变性；Corti器内毛细胞变性、坏死、缺失(图4)。而正常对照组耳蜗可见螺旋器隧道正常，外毛细胞排列整齐，刷状缘盖膜清晰，基底膜处规则排列一排内毛细胞和三排外毛细胞、柱细胞和耳蜗神经。

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引言

人们在探索疾病发生发展规律及治疗的过程中，很多试验在伦理和方法上会受到或多或少的限制，因此，现代医学研究中，越来越多的人借助动物实验模型进行研究。耳鸣耳聋是耳鼻喉科的常见病及疑难病，在其机制及防治上尚存在着许多争论。在耳聋动物模型的研究中有多种造模的方法，较常用的方法为应用具有耳毒性的药物进行造模，可选用庆大霉素^[1]、新霉素^[2]、环磷酰胺^[3]、顺铂等^[4]。闫辉等^[5]利用硫酸卡那霉素与呋塞米联合用药建立药物快速致聋大鼠动物模型，结果发现腹腔用药24 h后大鼠ABR反应阈明显增高，大鼠耳蜗底回毛细胞的明显缺失。此外，还有应用噪声致聋的方法造模^[6]。随着耳聋的遗传学研究不断深入，对遗传性耳聋动物模型的需求也不断增多，段宏等^[7]还应用CRISPR/ Cas系统介导的基因靶向修饰技术建立了耳聋动物模型。但这些常用的耳聋动物模型从病因上来看并不是突发性耳聋的常见病因。

突发性耳聋又称特发性突聋，患者可出现不同程度的Corti器毛细胞损伤，就中医病因病机而言，气虚血瘀证为常见的证型之一^[8-9]。中医中药在耳鸣耳聋方面有较好的疗效，为进一步研究中医中药治疗耳鸣耳聋的作用机制，建立符合中医证型的动物模型尤为重要。相关的研究有：于秀华等^[10]采用强迫游泳法复制气虚血瘀证动物模型；朱传武等^[11]应用机械开颅电凝+术后电脉冲刺激法复制气虚血瘀证脑缺血大鼠动物模型；杨硕等^[12]采用冠状动脉结扎术配合饥饿、游泳等方法造成气虚血瘀证慢性心衰的动物模型；冯玄超等^[13]也采用左冠状动脉前降支高位结扎法复制大鼠慢性心衰模型，并在术后分别进行游泳力竭实验、旷场实验以建立气虚血瘀证慢性心衰大鼠模型；杨卫平等^[14]以力竭游泳+皮下注射肾上腺素法复制心肌缺血大鼠气虚血瘀证动物模型；易亚乔等^[15]利用“劳则伤气”原理在对大鼠进行力竭游泳训练后再行2-VO法以建立血管性痴呆气虚血瘀证大鼠模型；杨洪雁等^[16]采用“饥饿+高脂+肾上腺素”复合多因素制备气虚血瘀证模型；王键等^[17]用饥饿、疲劳、寒湿、惊恐、高脂饮食等多因素复合方法建立气虚血瘀证老年大鼠模型；王净净等^[18]采用饥饿、高脂饲料、旋转、颈椎旁注射硬化剂复合方法复制气虚血瘀证血管性眩晕家兔模型；成映霞等^[19]给大鼠饮用甲基硝基亚硝基胍溶液+饥饱失常喂养+盐酸雷尼替丁灌胃建立气虚血瘀型萎缩性胃炎大鼠模型。在中医气虚证研究方面，李军兰等^[20]对1990年以来动物模型中气虚证的造模方法进行了归纳，分析了多种造模方法，如疲劳法、限制日摄食量法、单纯泻下法、耗气破气、苦寒泻下加耗气破气降气、偏食苦昧、食醋、烟熏法、化疗药物、X射线照射、手术、失血等，结果发现造模方法多样，总体上以疲劳法为主，“劳则耗气”，此法符合中医理论，在此基础上加以限食、泻下，可使气更不足，气虚证侯更显著。近年来樊慧杰等^[21]采用苦寒泻下法制备脾气虚动物模型，祝婧等^[22]采用大黄水灌胃、负重及控制饮食三因素复合法亦成功复制脾气虚实验动物模型。但以上造模法尚无针对气虚血瘀型耳聋的动物模型，因此，作者拟建立气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤的动物模型，其对深入研究突发性耳聋的发病机制、中医药治疗该病的疗效评价及作用机制均具有重要的意义。

作为听觉的重要器官，耳蜗往往被认为是实验研究的重点。张学渊等^[23]为建立微循环障碍的耳蜗模型，将四碘四氯荧光素二钠注入豚鼠股静脉中，然后以波长(50±20) nm的绿色光束照射豚鼠耳蜗，诱导耳蜗血管内产生光化学反应，造成血管内皮细胞损伤，而受损的内皮细胞激活血小板，使其黏附、聚集于内皮细胞表面或暴露的基膜上形成微血栓，从而导致豚鼠耳蜗的微循环障碍，进而使耳蜗血管纹、Corti器、螺旋神经节细胞等结构出现不同程度的缺血性改变，类似于病理条件下的耳蜗微循环障碍，此法可为探讨内耳微循环障碍、缺血性损伤机制以及筛选治疗药物建立较理想的动物模型。光化学法做为模拟微循环障碍的方法在多个领域被应用：黄硕等^[24]总结了光化学法建立大鼠脑梗死模型的研究进展，认为该法与人类脑梗死发生机制相似^[25]，有创伤小、稳定性好等优点；卢宝全等^[26]以手持激光器为光源建立了光化学法局灶性脑梗死动物模型；郝春华等^[27]亦用光化学法成功建立大鼠冠状动脉血栓模型；王熠钊等^[28]利用光化学法诱导猫脊髓内产生微血栓，从而使组织发生缺血性坏死；刘岩等^[29]应用倍频532 nm激光通过光化学法建立了视网膜动脉阻塞的动物模型，认为此法成功率高、安全性及重复性均较好。

在关于耳聋的动物模型实验中，近年来有越来越多对耳蜗标本方面的研究。张文丽等^[30]观察大鼠颅脑创伤后对耳蜗功能的影响，发现创伤后耳蜗内积血、充血水肿，内、外毛细胞排列紊乱，胞浆萎缩、空化，细胞核萎缩或消失，尤以第三排外毛细胞损伤严重；王军义等^[31]发现噪声对豚鼠耳蜗造成损伤，可导致耳蜗外毛细胞Prestin蛋白的表达代偿性增高。

实验采用限制并减少豚鼠摄食量来复制中医气虚模型，然后用特定波长的光照射豚鼠耳蜗，诱导豚鼠耳蜗血管内发生光化学反应，造成耳蜗微循环发生障碍，制作气虚血瘀证耳蜗Corti器毛细胞损伤的豚鼠动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料

1.1.1 实验动物、饲养及分组选用健康成年纯白色短毛红目豚鼠12只，体质量250-350 g，雌雄不限，由广东省医学实验动物中心提供，来源于国家啮齿类实验动物种子中心。实验基地位于广东省中医药科学院(中国中医科学院广东分院)动物实验中心。豚鼠采用不锈钢金属笼饲养，每笼3只，饲养环境符合普通级标准，饲养温度(21±2) ℃，相对湿度30%-70%。垫料为玉米芯(由广东省医学实验动物中心提供)。饲料由广东省医学实验动物中心提供，为普通繁殖料(Φ4 mm颗粒)。

12只豚鼠按随机数字表法随机分为2组，正常对照组6只，气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤组(造模组)6只。

1.1.2 实验仪器和材料美国Smart OAE耳声发射系统；日本岛津公司UV-2450紫外分光光度计；深圳奥盛翔电子科技有限公司AO-J11绿光激光笔；南京建成生物工程研究所D-木糖(D-xylose)ELISA试剂盒；山东鼎圣生物工程有限公司D-木糖、四碘四氯荧光素二钠；江阴天江药业有限公司中药配方颗粒厚朴、枳实、大黄。

1.2 造模方法建立气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤动物模型。

建立气虚豚鼠模型：首先采用改良的耗气破气加饥饱失常法行气虚造模。造模前豚鼠常规饲养3 d。造模初10 d，隔日给豚鼠破气苦降药灌胃，破气苦降药为小承气汤，按厚朴︰枳实︰大黄=3︰3︰2 的比例，100%浓度，给药剂量按10 mL/kg，给药当日禁食，次日自由进食；造模后5 d，隔日给予豚鼠破气苦降药灌胃(药物及比例同前，200%浓度，给药剂量按10 mL/kg)，给药当日禁食，次日限制进食，采取“足量给食-限量给食”的循环方法；自由饮水。

建立气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤豚鼠模型：15 d后气虚造模完成，在气虚型豚鼠模型上用光化学反应法再复制耳蜗微循环障碍模型(即气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤动物模型)。以10%的水合氯醛0.4 mL/kg腹腔注射进行麻醉，于豚鼠颈静脉内注射四碘四氯荧光素二钠(10 mg/kg)，暴露听泡，以波长为532 nm绿色光束照射耳蜗，光照强度0.19 mW/cm²，光照时间20 min，光照部位为耳蜗底回。

1.3 造模成功的检测标准造模后豚鼠血清D-木糖水平降低，提示出现气虚特征；耳声发射DPOAE测试显示DPOAE幅值降低，豚鼠耳蜗病理组织切片检查发现耳蜗组织形态出现变化(螺旋韧带、基底膜微血管及蜗轴毛细血管内有血管扩张、微血栓形成，血管纹水肿变性；Corti器内毛细胞变性、坏死或缺失)，提示造模组耳蜗Corti 器毛细胞损伤。

1.4 检测指标

1.4.1 血清D-木糖浓度采血前当天禁食，各组豚鼠给予5%D-木糖溶液灌胃，10 mL/kg，60 min后以10%的水合氯醛0.4 mL/kg腹腔注射进行麻醉，心脏采血， 1 500 r/min，离心30 min，制备血清，紫外分光光度计检测血清中D-木糖浓度。

1.4.2 耳声发射DPOAE测试采用美国Smart OAE耳声发射系统，实验前后测试豚鼠双耳DPOAE，将豚鼠置于电声和磁场的屏蔽室内，将耳声发射系统的声源与接收器置入外耳道，选择两个初始纯音f1和f2，两纯音的固定频比为f2/f1=1.2；以2个初始音频率的几何均数f0为测试频率，叠加150次。刺激声强度为L₁=65 dB SPL，L₂=55 dB SPL；以f0分别为1 560，2 211，3 125，4 416，6 250，8 837 kHz 6个频率点处进行测试，以高于本底噪声5 dB为反应出现的确认标准。

1.4.3 耳蜗病理检查每组豚鼠DPOAE测试完毕后，以断头法处死取出听泡用于光镜标本制作。以三棱针打开听泡暴露耳蜗，在蜗尖钻一小孔，取出镫骨并挑破圆窗膜与蜗窗膜，用40 g/L多聚甲醛(4 ℃，pH=7.4)缓慢灌注耳蜗5遍，然后置于固定液4-6 h，再以0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗，10%EDTA脱钙20 d，石蜡包埋，沿平行蜗轴方向做连续切片，予苏木精-伊红染色后光镜下观察耳蜗组织。

1.5 统计学分析采用SPSS Statistics 18.0统计分析软件包建立数据库，测量指标计算，造模前后指标比较采用配对符号秩和检验，检验水平α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

突发性耳聋是耳鼻喉科的常见急症，近年来发病有逐渐增加的趋势，其病因复杂。临床上一些患者单用活血药物疗效不佳，其中相当一部分患者兼有气虚证候。“气为血帅”，气对血有推动、统摄和化生的作用，气虚则无力推动血行而更易造成血液瘀滞，从而导致疾病的发生。临床中气虚血瘀导致突发性耳聋的患者并不少见。为深入研究突发性耳聋的发病机制，同时探讨中医药治疗本病的切入点及作用机制，有必要建立气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤的动物模型进行深入研究。

《灵枢·五味篇》曰：“谷不入半日则气衰，一日则气少矣”。而过于利下亦会导致耗气。脾气虚弱，脾失健运，不能运化水谷精微，物质代谢即会发生障碍。实验结果证明，给予耗气破气中药灌胃及限制进食后，经过一段时间就会出现体重下降、精神萎靡，蜷卧，行动迟缓，被毛有不同程度的枯槁、脱落，大便稀烂。在糖代谢方面，则会出现小肠D-木糖吸收功能低下^[33^、^34]，实验中造模后豚鼠血清D-木糖含量显著下降，说明其吸收功能减弱。因此耗气破气中药灌胃加饥饱失常法减少进食可用于复制气虚动物模型。

研究中采用的光敏剂为四碘四氯荧光素，是迄今已知的最强的光敏染料，有报道手持式激光器(激光笔)可作为实验光源^[32]。结果表明模型成功模拟了豚鼠气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤的过程，将来可用于研究中医药治疗耳鸣耳聋特别是突发性耳聋的机制。

实验中采用静脉内注射四碘四氯荧光素二钠，以激光笔绿色光束照射耳蜗的方法，诱导豚鼠耳蜗血管内发生光化学反应，从而损伤血管内皮细胞，血小板被受损的内皮细胞激活，黏附、聚集于内皮细胞表面或基膜上形成微血栓，导致耳蜗微循环障碍^[18]。造模组耳蜗病理切片提示耳蜗血管纹、Corti器等结构出现不同程度的缺血性病变，说明复制血瘀模型成功。

DPOAE检测快速灵敏，可直接反映耳蜗毛细胞的功能。研究证明DPOAE 的产生与外毛细胞的功能有关，当外毛细胞排列紊乱、数量减少或缺失时， DPOAE 的幅值可以下降^[35]，张纪帅等^[36]通过研究认为畸变产物耳声发射(DPOAE)可以很好地检测噪声暴露前后豚鼠听觉功能的变化，近年来不少研究者均将DPOAE作为衡量实验动物听功能情况的一项重要的指标^[37-39]。此次实验中，耳声发射结果显示，造模后豚鼠各频率DPOAE幅值降低，同造模组术前及对照组差异显著，说明其耳蜗毛细胞受损，对听力造成了影响。

由于经费及时间限制，实验动物的例数偏少，数据统计结果可能存在一定的偏倚，在今后的研究中应扩大样本量以减少统计学误差。在未来的动物实验中，还可采用ABR(听性脑干反应)检测以更客观体现实验对象的听力情况。随着现代科技的迅猛发展，组织病理学的研究已深入到亚细胞和分子水平，进一步的研究可应用扫描电镜技术等相关方法^[40]，以更直观的体现耳蜗Corti 器内毛细胞的微观变化，为实验研究提供更有利的证据。

根据研究的实验结果，说明耗气破气中药加饥饱失常法，再采用光化学反应法复制模拟气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤动物模型是可行的，其方法简单易行，重复性好，为研究突发性耳聋的发病机理及治疗作用机制提供了客观有效的手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程