神经生长因子干预实验性自身免疫性脑脊髓炎幼年大鼠脑神经干细胞的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.021

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
神经生长因子：是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。
神经干细胞：具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。需要强调的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。

摘要
背景：神经生长因子是一种具有神经元营养作用的细胞调节因子，对神经干细胞的增殖具有促进作用。
目的：观察神经生长因子对实验性自身免疫性脑脊髓炎幼年大鼠脑神经干细胞的影响。
方法：将3周龄Wistar幼鼠随机分为对照组、脑脊髓炎模型组、脑脊髓炎神经生长因子治疗组，后2组建立实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型，脑脊髓炎神经生长因子治疗组在发病当天起腹腔注射神经生长因子(1 000 U/kg)，共7 d，对照组和模型组幼鼠不予处理。观察神经生长因子对实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠临床症状的影响，以及各组幼鼠室管膜下区Brdu(神经干细胞标记物)、皮质区Brdu⁺/GFAP⁺(星形胶质细胞标记物)的表达变化。
结果与结论：①模型鉴定：实验性自身免疫性脑脊髓炎模型幼鼠在免疫后10 d开始陆续出现脑脊髓炎症状，对照组未出现脑脊髓炎症状；模型组幼鼠脑组织中胶质细胞增生，炎症细胞浸润，血管内皮细胞增生破坏，炎症细胞集中在血管周围；对照组脑组织表现正常；②临床症状：脑脊髓炎神经生长因子治疗组的症状持续时间低于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)，平均神经功能评分低于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)；③室管膜下区Brdu的表达：脑脊髓炎模型组幼鼠高于对照组(P < 0.05)，发病后7，21 d脑脊髓炎神经生长因子治疗组室管膜下区Brdu的表达显著高于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)；④皮质区Brdu+/GFAP+表达：脑脊髓炎模型组高于对照组(P < 0.05)，发病后7，21 d脑脊髓炎神经生长因子治疗组皮质区Brdu⁺/GFAP⁺的表达显著高于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)；⑤结果表明，自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型被成功建立，神经生长因子治疗能够改善实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠的临床症状，促进神经干细胞的增殖，并分化为星形胶质细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2941-5977(王雪君)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 神经生长因子, 实验性自身免疫性脑脊髓炎, 幼鼠, 星形胶质细胞, 治疗

Abstract:

BACKGROUND: Nerve growth factor is a neurotrophic factor that is involved in the cell regulation and promotes the proliferation of neural stem cells.
OBJECTIVE: To observe the effect of nerve growth factor on neural stem cells of experimental autoimmune encephalomyelitis rats.
METHODS: Wistar rats, 3 weeks of age, were randomly divided into control group, encephalomyelitis model group, nerve growth factor treatment group. Rat models of experimental autoimmune encephalomyelitis were made in the latter two groups. On the day of onset, rats in the nerve growth factor treatment group were given intraperitoneal injection of 1 000 U/kg nerve growth factor for 7 continuous days, and rats in the other two groups given no treatment. Effects of nerve growth factor on clinical symptoms of model rats were observed. Expression of Brdu in the subependymal zone and Brdu⁺/GFAP⁺ expression in the cortex were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Rat models of experimental autoimmune encephalomyelitis appeared to have encephalomyelitis symptoms successively at the beginning of 10-day immunization, while rats in the control group had no symptoms of encephalomyelitis. In the model group, glial cell hyperplasia, inflammatory cell infiltration, damage to vascular endothelial cell proliferation, and perivascular aggregation of inflammatory cells in the rat brain were found, while no abnormal changes in the rat brain were found in the control group. Compared with the model group, the expression of Brdu in the subependymal zone and Brdu⁺/GFAP⁺ expression in the cortex were both higher in the model group (P < 0.05), and these expressions were also higher in the nerve growth factor treatment group than the model group at 7 and 21 days after onset (P < 0.05). To conclude, these findings suggest that the rat model of autoimmune encephalomyelitis can be successfully established, and nerve growth factor treatment can improve clinical symptoms of experimental autoimmune encephalomyelitis rats by promoting the proliferation and differentiation of neural stem cells into astrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Neural Stem Cells, Nerve Growth Factor, Encephalomyelitis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王雪君，李茂. 神经生长因子干预实验性自身免疫性脑脊髓炎幼年大鼠脑神经干细胞的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6827-6833.

Wang Xue-jun, Li Mao. Nerve growth factor intervention triggers changes in the neural stem cells of experimental autoimmune encephalomyelitis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6827-6833.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 纳入Wistar幼鼠42只，随机分为3组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型的建立和鉴定

行为学改变：实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠在免疫后出现食欲减退，体质量下降，在免疫后10 d出现第1例发病，随后幼鼠陆续发病，发病时间集中在免疫后12-13 d，发病的表现一般为先出现活动不灵活，步态笨拙，症状不断加重，最后出现后肢瘫痪。对照组大鼠体质量随着生长不断增加，观察1个月没有出现脑脊髓炎症状。

苏木精-伊红染色结果：实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠的脑组织中胶质细胞增生，出现炎症细胞浸润，血管内皮细胞增生破坏，炎症细胞呈“袖套”状集中在血管周围(见图1)。对照组的脑组织表现正常。

2.3 神经生长因子对实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠临床症状的影响 在神经生长因子治疗后第21天时对脑脊髓炎模型组幼鼠和脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠的临床症状进行比较，发现脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠的症状持续时间明显低于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)，脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠的平均神经功能评分明显低于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)，见表1。表明神经生长因子治疗能够改善实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠的临床症状。

2.4 脑脊髓炎模型组和对照组幼鼠室管膜下区神经干细胞标记物Brdu表达情况比较 由表2看出，脑脊髓炎模型组幼鼠的室管膜下区Brdu的表达均高于对照组(P < 0.05)，其中以脑脊髓炎发病后3 d组幼鼠的室管膜下区Brdu的表达最高，明显高于脑脊髓炎发病7 d组、脑脊髓炎发病21 d组和对照组(P < 0.05)。

2.5 脑脊髓炎模型组和脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠室管膜下区神经干细胞标记物Brdu表达情况比较 由表3看出，脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠脑脊髓炎发病7 d和21 d组时室管膜下区Brdu的表达均显著高于脑脊髓炎模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠以脑脊髓炎发病后7 d组的室管膜下区Brdu表达最高，显著高于脑脊髓炎发病3 d组和21 d组(P < 0.05)。

2.6 脑脊髓炎模型组和对照组幼鼠皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达情况比较 由表4看出，脑脊髓炎模型组幼鼠的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达高于对照组(P < 0.05)，其中以脑脊髓炎发病后3 d组幼鼠的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达最高，明显高于脑脊髓炎发病21 d组和对照组(P < 0.05)。

2.7 脑脊髓炎模型组和脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达情况比较 由表5看出，脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠脑脊髓炎发病7 d组和21 d组的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达均显著高于脑脊髓炎模型组(P < 0.05)，其中脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠以脑脊髓炎发病后7 d组的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达最高，显著高于脑脊髓炎发病3 d组和21 d组(P < 0.05)。

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引言

多发性硬化是中枢神经系统疾病的一种，病理特点为髓鞘发生炎症损伤，并伴有轴索的丢失^[1-3]，随着医疗水平的发展，多发性硬化的诊断率越来越高，多发性硬化是一种年轻人比较常见的一种神经系统疾病，给家庭和社会造成严重的经济负担^[4-6]，多发性硬化的发生可能是环境因素和患者的遗传易感性共同作用的结果，是一种中枢神经系统的自身免疫性疾病^[7-9]。实验性自身免疫性脑脊髓炎是自身免疫性脱髓鞘病变的一种中枢神经系统模型，其病理特征和免疫特征和多发性硬化相似，被作为多发性硬化的一种动物模型^[10-13]，多发性硬化的发生可能原因为：激活外周针对中枢神经系统的自身攻击性细胞而诱发多发性硬化的启动；正常的免疫调节功能失调；发生炎症反应引起中枢神经系统的损伤^[14-15]。因此，治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的途径有以下几种：①抑制炎症反应；②调节趋化分子；③影响炎症因子的释放和免疫细胞的激活；④增加神经保护因子^[16]。神经生长因子是一种具有神经元营养作用的细胞调节因子，对神经元的发育和生长具有调控作用，减少神经细胞的凋亡，保护神经元细胞免受损伤，对神经元的再生和修复具有重要作用^[17-18]。神经生长因子对免疫系统也具有调节作用，对神经干细胞的增殖具有促进作用^[19]，可用于难治性神经系统疾病的治疗。

文章构建急性实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，通过观察幼鼠脑组织神经干细胞标记物Brdu及星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达变化，探讨神经生长因子对实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠脑神经干细胞的影响，为临床治疗提供基础依据。

材料方法

1.1 设计 随机对照实验。

1.2 时间及地点 于2013年10月至2015年4月在青海省妇女儿童医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级、3周龄、健康Wistar大鼠42只，体质量80-100 g，雌性；豚鼠10只，体质量340-380 g，雌性。实验动物均购自山东省实验动物中心。实验前正常饲养1周，饲养于实验室幼鼠专用鼠笼，按照实验幼鼠标准进食和饮水，实验方法经过动物伦理学委员会批准。

主要试剂和仪器：神经生长因子(武汉海特生物制药股份有限公司)；水合氯醛(美国Sigma公司)；PBS(北京中山生物技术公司)；完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；百日咳疫苗(北京生物制品研究所)；Brdu(美国Sigma公司)；多聚甲醛(北京中山生物技术有限公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；正常马封闭血清(美国Sigma公司)；小鼠抗Brdu单克隆抗体(美国Sigma公司)；马抗小鼠IgG抗体(美国Sigma公司)；辣根酶标记链酶卵白素工作液(美国Sigma公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；碱磷酶标记亲和素(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BICP/NBT显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；正常山羊非免疫血清(美国Sigma公司)；兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(美国Sigma公司)；超净工作台(上海博讯实业公司)；图像分析系统(江苏捷达科技公司)；恒冷箱切片机(英国 SHANDON公司)；恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 制备完全抗原 将豚鼠用水合氯醛麻醉后，备皮，消毒，切开皮肤，剥离皮肤和肌肉，剪开椎管和枕骨，取出脊髓，去掉脊膜和马尾，加入生理盐水制成脊髓匀浆，再和相同体积的完全弗氏佐剂混合制成油包水乳剂。

1.4.2 建立实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型 将Wistar幼鼠麻醉成功后，将百日咳疫苗注射至幼鼠的左后足背(0.05 mL/只)，然后在幼鼠的4足足垫注射豚鼠脊髓匀浆和完全弗氏佐剂混合液(0.02 mL/只)。造模成功标准为体质量下降、皮毛不光滑、食欲不振、双后肢步态笨拙、活动不灵活。

1.4.3 实验性自身免疫性脑脊髓炎模型幼鼠的神经功能评分 将免疫接种的当天算免疫接种0 d，接种后幼鼠给予自由饮水和进食，每天对所有实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型进行神经功能评分，神经功能评分获2分以上者为发病。5分法评分标准分级如下^[2-3]：0分为不发病，1分为尾巴无力，2分为轻微后肢无力，3分为严重后肢麻痹，4分为四肢麻痹，5分为濒死或死亡。

1.4.4 实验幼鼠分组 将42只幼鼠按随机数字表法分为3组，对照组6只，脑脊髓炎模型组18只，脑脊髓炎神经生长因子治疗组18只；其中脑脊髓炎模型组又分为发病3 d组(6只)、发病7 d组(6只)、发病21 d组(6只)；脑脊髓炎神经生长因子治疗组也分为发病3 d组(6只)、发病7 d组(6只)、发病21 d组(6只)。脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠在发病当天起腹腔注射神经生长因子(1 000 U/kg)，连用7 d，对照组和模型组幼鼠不予处理。

1.4.5 标本采集和增殖细胞标记 脑脊髓炎模型组及脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠均在发病3，7，21 d时取材。增殖的神经干细胞采用Brdu标记，将Brdu经生理盐水稀释后，在幼鼠处死前2 d给予腹腔注射Brdu(60 mg/kg)，1次/d，共2 d。取材方法为：将幼鼠麻醉成功后，打开胸腔，剪开右心耳，灌注生理盐水只流出液清亮，再灌注多聚甲醛至幼鼠尾巴和四肢僵直，1 h后取出脑组织，在多聚甲醛中固定，石蜡包埋，制成4 μm厚的切片。

1.4.6 脑组织苏木精-伊红染色 将脑组织标本经二甲苯脱蜡，乙醇脱水，明矾苏木精染色，蒸馏水冲洗，盐酸乙醇分红，蒸馏水冲洗反蓝，伊红复染，乙醇分红，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4.7 脑组织室管膜下区Brdu免疫组化染色 二甲苯脱蜡，乙醇脱水，PBS洗涤，H₂O₂孵育，PBS洗涤，HCl孵育，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，PBS洗涤，加入正常马封闭血清孵育，加入小鼠抗Brdu单克隆抗体过夜孵育，PBS洗涤，加入马抗小鼠IgG抗体孵育，PBS洗涤，加入辣根酶标记链酶卵白素工作液孵育，PBS洗涤，DAB显色，苏木精复染，乙醇进行脱水，二甲苯进行透明，中性树胶进行封固。阴性对照组取PBS替代一抗。

1.4.8 脑组织皮质区Brdu/GFAP免疫组化染色 二甲苯脱蜡，乙醇脱水，PBS洗涤，HCl孵育，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，PBS洗涤，加入正常马封闭血清孵育，加入小鼠抗Brdu单克隆抗体过夜孵育，PBS洗涤，加入马抗小鼠IgG抗体孵育，PBS洗涤，加入碱磷酶标记亲和素孵育，PBS洗涤，BICP/NBT显色，PBS洗涤，H₂O₂孵育，PBS洗涤，加入正常山羊非免疫血清孵育，加入兔抗大鼠GFAP多克隆抗体孵育，PBS洗涤，加入山羊抗兔IgG抗体孵育，PBS洗涤，加入辣根酶标记链酶卵白素工作液孵育，PBS洗涤，AEC显色，PBS洗涤，Clearmount^TM封固。

1.4.9 图像采集 用显微摄影图像分析系统采集图片，每只幼鼠选择5张标本，每个标本选择5个视野进行观察，计算阳性细胞数，取平均值。

1.5 主要观察指标 ①神经生长因子对实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠临床症状的影响；②各组幼鼠室管膜下区Brdu表达情况；③各组幼鼠皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，取P=0.05为显著性标准。

讨论

多发硬化症是一种T细胞引起一种自身免疫性疾病^[20]，主要发生在青少年人群中，女性多于男性，发病多与患者的自身免疫调节功能异常有关^[21]，目前尚没有非常有效的治疗方法。目前认为多发性硬化症的发病有两个时期：炎症反应时期和变性时期^[22]，调节患者体内的免疫性T淋巴细胞，可以纠正机体的免疫功能异常，达到治疗多发性硬化的目的^[23]，遗传因素在多发性硬化症的发病中也发挥着一定作用^[24-25]，双胞胎人群的发病率高于正常人群^[26-28]，多发性硬化症的发病可能为免疫功能异常和遗传因素共同作用的结果。多发性硬化症的发病率和寒冷程度有关，在比较寒冷的地区发病率比较高^[29]，多发病硬化症和分子遗传也有一定的关系，分子遗传因素在多发硬化症患者的免疫调节和自我识别方面发挥重要作用^[30-31]。实验性自身免疫性脑脊髓炎是比较理想的多发硬化症的动物模型，被广泛应用于多发硬化症的实验研究。

神经生长因子是神经营养因子家族成员之一，神经生长因子可以和相应的受体结合促进神经细胞的生长和增殖，减少神经细胞的凋亡^[32-34]。神经生长因子的功能主要为维持胆碱能神经元的存活，调节中枢神经元和外周神经元的发育和生长，并维持神经元的活性^[35]。神经生长因子为水溶性，分子量比较大，正常情况下难以通过血脑屏障，采用纳米技术制备的神经营养因子能够通过血脑屏障，并且能够改善学习和记忆能力^[36]，甘露醇静脉滴注能够暂时开放血脑屏障，提高神经营养因子的疗效^[37]。神经生长因子可以用于治疗中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默病，神经生长因子治疗阿尔茨海默病能够改善患者的临床症状，副反应比较小^[38]，神经生长因子对外周神经损伤有具有一定的治疗效果^[39]，可以治疗糖尿病引起的周围神经病变。Brdu是一种胸腺嘧啶脱核尿苷类似物，在细胞增殖州的S期嵌入细胞核的DNA，是有增殖活性细胞的标志物，故其阳性细胞表示新生成的神经干细胞。

本实验通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型，观察神经生长因子对实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠临床症状的影响，并动态观察各组幼鼠室管膜下区Brdu表达及皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达变化。结果发现，实验组幼鼠在免疫后出现食欲减退，体质量下降，在免疫后10 d出现第1例发病，随后幼鼠陆续发病，表现为先出现活动不灵活，步态笨拙，症状不断加重，最后出现后肢瘫痪。对照组幼鼠没有出现脑脊髓炎症状。苏木精-伊红染色结果发现实验性自身免疫性脑脊髓炎幼鼠的脑组织中胶质细胞增生，出现炎症细胞浸润，血管内皮细胞增生破坏，炎症细胞呈“袖套”状集中在血管周围；而对照组的脑组织表现正常。脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠的症状持续时间明显低于脑脊髓炎模型组，脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠的平均神经功能评分明显低于脑脊髓炎模型组。室管膜下区Brdu的表达方面，脑脊髓炎模型组幼鼠的室管膜下区Brdu的表达高于对照组；脑脊髓炎发病后3 d组幼鼠的室管膜下区Brdu的表达高于脑脊髓炎发病7 d组、脑脊髓炎发病21 d组和对照组；脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠脑脊髓炎发病7 d组和21 d组室管膜下区Brdu的表达均明显高于脑脊髓炎模型组，脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠以脑脊髓炎发病后7 d组的室管膜下区Brdu表达水平最高。脑脊髓炎模型组幼鼠脑脊髓炎发病3 d组、7 d组和21 d组的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达均明显高于对照组，以脑脊髓炎发病后3 d组幼鼠的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达水平最高；脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠脑脊髓炎发病3 d组和7 d组的皮质区Brdu⁺/GFAP⁺表达均明显高于脑脊髓炎模型组，脑脊髓炎神经生长因子治疗组幼鼠以脑脊髓炎发病后7 d组的Brdu⁺/GFAP⁺表达水平最高。

由此可见，自身免疫性脑脊髓炎幼鼠模型被成功建立，神经生长因子治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎能够改善模型幼鼠的临床症状，促进神经干细胞的增殖并分化为星形胶质细胞。