超顺磁氧化铁纳米颗粒标记人端粒酶反转录酶基因修饰神经干细胞及体外MRI成像

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.020

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人端粒酶：是一种核糖核蛋白复合物，由人端粒酶反转录酶、人端粒酶RNA组分以及人端粒酶相关蛋白组成。端粒酶利用其自身人端粒酶RNA组分所携带的RNA为模板，在人端粒酶反转录酶的反转录催化下，将端粒重复序列合成到染色体末端，延长或稳定了随着细胞分裂而进行性缩短的端粒，在细胞永生化及恶性肿瘤的发生和发展中起到了重要的作用。
超顺磁氧化铁纳米颗粒：是一种组织特异性MRI对比剂，多以葡聚糖等包裹氧化铁颗粒而得到，直径一般在纳米级，理化性质稳定，超顺磁氧化铁纳米颗粒分布于组织后，扰乱了内部磁场，引起质子自旋快速失相位，从而缩短了组织的T2值和T1值(对T2更明显)，在MRI上表现低信号影。

摘要
背景：细胞标记与体外MRI成像联合，可无创性活体标记移植的神经干细胞存在部位、存在方式及其一些生物学特性。
目的：探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIO)标记对人端粒酶反转录酶(hTERT)基因修饰神经干细胞生物学特性的影响及标记后MR成像效果。
方法：体外培养大鼠骨髓来源的神经干细胞，将其分为正常神经干细胞组、SPIO标记神经干细胞组、SPIO标记空载病毒组及SPIO标记hTERT转染组。采用电穿孔法将pcDNA3-hTERT 重组质粒转染至神经干细胞，并进行SPIO标记，当神经干细胞标记成功后即行4.7T MR扫描，流式细胞仪、MTT法检测细胞周期、细胞增殖能力，RT-PCR和Western blot检测hTERT基因和蛋白的表达。
结果与结论：①普鲁士蓝染色显示SPIO对神经干细胞的标记率为97%；②MRI成像显示，与正常神经干细胞组相比，SPIO标记神经干细胞组的T2及T2*弛豫时间均显著下降，相应的弛豫率则显著升高(P < 0.01)；③与正常神经干细胞比较，SPIO标记的3组神经干细胞增殖能力相比明显增强，处于G₀-G₁及S期的比例明显增多；④与SPIO标记神经干细胞组、SPIO标记空载病毒组比较，SPIO标记hTERT转染组hTERT mRNA及蛋白的表达均明显增强；⑤结果表明，在体外超顺磁性氧化铁能够高效标记神经干细胞，经hTERT基因修饰后能够稳定表达hTERT基因，细胞增殖能力显著增强，4.7T MR仪能够对标记后的细胞有效进行体外成像。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0465-0900(窦文广)

关键词: 干细胞, 培养, 神经干细胞, 氧化铁标记, 超顺磁性氧化铁粒子, hTERT, 基因修饰, ；磁共振成像

Abstract:

BACKGROUND: Cell labeling in combination with in vitro MRI imaging can be used to noninvasively label transplanted neural stem cells (NSCs), thereby exhibiting the existing site, existing way and some biological properties of the cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles on the biological characteristics of NSCs modified by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene and explore the changes of MRI after labeling in vitro.
METHODS: NSCs from rat bone marrow were cultured in vitro, and then were divided into normal NSCs group, control group (SPIO-labeled NSCs), negative control group (SPIO group) and hTERT transfection group (SPIO-labeled NSCs transfection group). Using electropration method, pcDNA3-hTERT recombinant plasmids were transfected into NSCs, followed by SPIO labeling. Afterwards, 4.7T MRI imaging was used to scan SPIO-labeled NSCs. Cell cycle and proliferation were detected using flow cytometry and MTT assay, respectively. Expression of hTERT at protein and gene levels was detected using RT-PCR and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Prussian blue staining showed 97% of NSCs were labeled by SPIO. MRI results showed that compared with the normal NSCs group, T2 and T2* relaxation time was significantly declined in the control group, and the corresponding relaxation rate was significantly increased (P < 0.01). Compared with the normal NSCs group, SPIO-labeled cells in the other three groups showed stronger proliferation ability, and exhibited a cell cycle rest in G0-G1 and S stages. RT-PCR and western blot results showed that mRNA and protein expressions of hTERT were significantly higher in the hTERT transfection group than the control and negative control groups. These findings indicate that in vitro SPIO can efficiently label NSCs, and SPIO-labeled NSCs under hTERT modification can stably express hTERT gene and strengthen the proliferation ability. Additionally, 4.7T MR is effective for in vitro imaging of labeled cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Telomerase, Organisms, Genetically Modified, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

窦文广，岳军艳，胡莹，吴清武，陈杰. 超顺磁氧化铁纳米颗粒标记人端粒酶反转录酶基因修饰神经干细胞及体外MRI成像[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6821-6826.

Dou Wen-guang, Yue Jun-yan, Hu Ying, Wu Qing-wu, Chen Jie. Neural stem cells modified by human telomerase reverse transcriptase gene: superparamagnetic iron oxide labeling and in vitro MRI imaging[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6821-6826.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓源神经干细胞形态 接种24 h内，倒置显微镜下可见细胞形态呈圆形，悬浮生长(图1A)；4-6 d后可见贴壁细胞明显增加，细胞形态由圆形逐渐变成梭形；两三次传代后，细胞形态趋向一致，大部分呈梭形，伴长轴突样纤维生长，选取第3代神经干细胞进行实验(图1B)。

2.2 普鲁士蓝染色观察神经干细胞的标记率 标记后的细胞胞浆内有蓝染铁颗粒(图2)，未经标记的细胞胞浆内无蓝染颗粒存在，SPIO对神经干细胞的标记率为97%。

2.3 MR成像检测结果 采用4.7 T磁共振成像，扫描序列包括T1WI、T2WI及T2* WI 3种，与未标记的神经干细胞相比，标记的神经干细胞在T2WI序列的信号强度平均下降50.66%，而在T2* WI序列上二者的信号强度相比平均下降53.70%，T2WI序列与T2* WI序列相比后者的信号强度变化明显。未标记神经干细胞和标记神经干细胞的T2弛豫时间分别为510 ms及76 ms，其弛豫率R2(1/T2)分别为1.94 s^-¹及12.98 s^-¹，T2*弛豫时间分别为109.0、22.9 ms，其弛豫率R2*(1/T2*)分别为9.17 s^-¹、43.67 s^-¹，由以上结果可见标记细胞的T2及T2*弛豫时间均显著下降，相应的弛豫率则显著升高。

2.4 各组神经干细胞的细胞周期 与普通神经干细胞组相比较，SPIO标记3组神经干细胞处于G₀-G₁及S期的比例明显增多，处于G₂-M期的比例明显减少，SPIO标记hTERT转染组更为显著(P < 0.05)，见表1。

2.5 各组神经干细胞的增殖能力 细胞于传代后24 h内缓慢生长，48 h后生长迅速，120 h时细胞密度最高，结果表明SPIO标记的3组神经干细胞与正常神经干细胞相比较，增殖能力明显增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.6 各组神经干细胞hTERT mRNA表达 SPIO标记神经干细胞组、SPIO标记空载病毒组及SPIO标记hTERT转染组细胞的hTERT mRNA相对吸光度值分别为0.31±0.02，0.37±0.03，0.39±0.08。SPIO标记hTERT转染组hTERT mRNA的表达显著增强，见图3。

2.7 各组神经干细胞hTERT蛋白的表达 SPIO标记神经干细胞组、SPIO标记空载病毒组及SPIO标记hTERT转染组hTERT蛋白条带灰度分别为23%，25%，78%，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组对照观察。

1.2 时间及地点 实验于2014年2月至2015年8月在河南医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，四五周龄，体质量200-250 g，购于河南医科大学动物实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2005-0008。

1.3.2 主要试剂 神经干细胞培养基(美国Invitrogen公司)，Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen公司)，SPIO (Magnetics公司)，阳离子脂质体Lipofectamine^TM Reagent(Invitrogen公司)，MTT溶液(森贝伽生物公司)，PCR试剂盒(森贝伽生物公司)。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的体外培养及向神经干细胞诱导分化 大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉处死，皮肤消毒，无菌条件下取出双侧股骨及胫骨置于培养皿中，用剪刀将两侧骨骺端剪去，暴露出骨髓腔，用含无血清DMEM培养基注射器反复多次冲洗骨髓腔，收集冲洗液，按2︰1的比例加入淋巴细胞分离液，2 500 r/min离心15 min，吸取交界层的有核细胞，接种在培养瓶中，加入适量神经干细胞培养基，置于37 ℃培养箱中培养，每两三天更换1次培养液。通过与0.25% trypsin孵育使细胞脱落。细胞经两三次传代后，收集细胞悬液备用^[11]。

1.4.2 pcDNA3-hTERT基因重组质粒转染神经干细胞 选择第3代骨髓来源神经干细胞，采用脂质体介导转染法转染hTERT基因，整个操作过程严格按照Lipofectamine^TM 2000说明书进行，转染24 h后，接种到6孔板中，接加入新鲜的完全培养基，次日更换培养液，加入含400 mg/L G418的筛选培养基培养6 d，再更换含200 mg/L G418培养基继续培养，14 d后可观察到阳性克隆形成，从中挑选单个克隆继续进行扩大培养及传代^[12]。

1.4.3 实验分组 将体外培养大鼠骨髓来源的神经干细胞分为4组：正常神经干细胞组、SPIO标记神经干细胞组、SPIO标记空载病毒组及SPIO标记hTERT转染组。

1.4.4 SPIO标记神经干细胞 将50 mg/L的SPIO加入到无血清的神经干细胞培养液中，在振荡器上进行漩涡振荡45 min，然后向其中加入阳离子脂质体Lipofectamine，配制成超顺磁性氧化铁转染介质复合物，加入神经干细胞，轻轻吹打细胞呈悬浮状态，置于37 ℃培养箱中进行培养，24 h后加入胰酶进行消化，1 600 r/min离心5 min，弃上清液，加入PBS吹打细胞至悬浮状态待用^[13]。

1.4.5 体外标记后MRI成像 当神经干细胞标记成功后即行4.7T MR扫描，其扫描序列包括T1WI、T2 WI及T2* WI 3种。测量T2弛豫时间时采用多回波快速自旋回波序列成像，其TE依次为20，40，60，80，100，120 ms。测量T2*弛豫时间时采用多回波梯度回波序列成像，其TE依次为4，14，24，34，44，54 ms。通过MR成像来比较不同序列上标记细胞与未标记细胞的信号强度及其变化。

1.4.6 普鲁士蓝染色 取适量标记和未标记的神经干细胞悬液，接种于预先用多聚赖氨酸处理过的24孔培养板，待细胞贴壁后，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，加入含2%亚铁氰化钾的6%盐酸溶液孵育30 min，PBS洗涤3次，用中性红溶液复染15-30 s，单蒸水冲洗，光镜下观察阳性结果为：核呈红色，Fe³⁺呈蓝色^[14]。

1.4.7 流式细胞仪及MTT法检测细胞周期、增殖情况 取传代后第1天及第6天的细胞，PBS冲洗2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入PBS吹打成细胞悬液，加入体积分数为70%乙醇固定30 min，PBS冲洗，再次离心，加入1 mL DNA染液染色30 min，过300目尼龙滤网，用流式细胞仪检测细胞周期。

将生长良好的神经干细胞悬液接种在96孔培养板上，从接种的第2天开始，每天随机选取1块培养板，加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入200 μL二甲基亚砜，振荡混匀，充分溶解结晶物，酶标仪测定570 nm波长处各孔吸光度值，连续检测5 d，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线^[14]。

1.4.8 RT-PCR检测hTERT mRNA表达^[15] 收集各组神经干细胞，利用Trizol提取细胞的总RNA，使用紫外分光光度仪测定RNA含量，RT-PCR反应按照试剂盒说明书进行。hTERT上游引物：5’-GCA GCG CTG CGT CCT GCT GCG CAC GT-3’，下游引物：3’-AGG ACC GGT GGG CCC GTA CCT-5’；β-actin上游引物：5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物：5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC -3’，用Gel-Doc1000凝胶成像系统扫描，Molecular Analyst图像分析软件检测条带吸光度，计算hTERT与β-actin的相对吸光度值。

1.4.9 Western blot 检测hTERT蛋白的表达 收集各组神经干细胞，用预冷的PBS冲洗，加入蛋白裂解液进行细胞裂解，提取出总蛋白50 μg，常规行SDS-PAGE电脉及蛋白电转，转膜后的PVDF膜用5%脱脂奶粉溶液4 ℃封闭过夜，TBST洗膜3次，滴加相应的一抗稀释液，37 ℃温育1 h，TBST漂洗3次，加入HRP标记的二抗，37 ℃温育1 h，TBST漂洗3次，取等量的ECL发光试剂A，B混匀液均匀加到膜的表面，室温孵育5 min，放到暗盒后显影，以β-actin为内参照^[16]。

1.5 主要观察指标 ①SPIO对神经干细胞的标记率；②MR成像检测结果；③神经干细胞的细胞周期；④神经干细胞增殖能力；⑤hTERT mRNA及蛋白的表达。

1.6 统计学分析 数据用x(_)±s表示，应用SPSS 10.0软件对所有实验数据进行分析，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经干细胞是一种原始的，尚未完全分化的细胞，具有很强的自我分化能力，能够诱导分化为神经细胞^[17-23]。目前已有大量研究证实神经干细胞可以在特定条件下分化成为神经元修复神经损伤，因此神经干细胞为神经系统疾病提供新的治疗方案^[24-26]，目前研究仍处于动物实验阶段。

研究发现使用一种神经干细胞特异性示踪剂结合MRI可以无创监测到其分布及存活情况。SPIO是一种阴性对比剂，超顺磁性氧化铁粒子即使在较弱的磁场中也可产生较大的磁性，而外磁场撤消后磁性也迅速消失，即具有所谓超顺磁性。超顺磁性氧化铁颗粒分布于组织后，造成局部磁场的不均匀，从而加速了质子去相位的T2弛豫，使组织信号降低，而对T1弛豫影响较小。用MRI可在活体上示踪移植到宿主脑内的磁化标记神经干细胞^[27-28]。这种MRI成像显示的神经干细胞的分布及生存情况与组织切片染色后观察到的结果是一致的。

实验经普鲁士蓝染色证实，用SPIO 和Lipofectamine体外磁化标记神经干细胞是一种简便、行之有效的方法，这种磁化标记细胞的方法不需要合成或修饰SPIO微颗粒表面的葡聚糖包被，也不需要形成新的氧化铁合成物来标记干细胞，更不需要通过结合外源性的蛋白。研究结果显示：SPIO对神经干细胞的标记率可达97%，提示其具有高效性。MRI成像结果显示，与正常神经干细胞组相比SPIO标记神经干细胞的T2及T2*弛豫时间均显著下降，相应的弛豫率则显著升高(P < 0.01)。与正常神经干细胞比较，SPIO标记的hTERT转染组神经干细胞增殖能力相比明显增强，处于G₀-G₁及S期的比例明显增多。SPIO标记hTERT转染组的hTERT mRNA及蛋白的表达均明显增强，说明SPIO标记神经干细胞体外hTERT基因修饰后能够稳定表达hTERT基因。