miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.019

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
P19细胞：是从小鼠畸胎瘤中分离得到的多功能干细胞，目前已被广泛用于心脏发育的分子机制研究中。P19细胞具有自我复制能力和分化潜能，在体外不同培养条件下，它可分化成多种类型的细胞，例如低浓度二甲亚砜可诱导其分化成心肌细胞。
MicroRNA：是内源性的非编码的单链小RNA，它通过与靶基因mRNA 3’UTR区域结合，诱导mRNA的降解或阻止其翻译调控基因的表达。一个miRNA可以调控众多基因的表达，几个miRNA也可以组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调控人类一半以上的基因。miRNA高度保守性与其功能重要性有着密切关系。

摘要
背景：既往研究发现，向心肌分化P19细胞中的miR-2135表达水平显著高于未分化P19细胞，但miR-2135对P19细胞增殖、向心肌细胞分化和心脏发育的影响尚不明确。
目的：探索miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的影响。
方法：分别以miR-2135沉默及空载质粒转染P19细胞，培养0-4 d，MTT法检测细胞增殖；培养0，24，48 h，流式细胞仪检测细胞周期。诱导两组转染的P19细胞向心肌细胞分化，诱导第0，10天，采用qRT-PCR检测P19细胞中miR-2135的表达；诱导第10天，采用蛋白免疫印迹检测心肌分化相关标志物心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子的表达。
结果与结论：①转染结果：转染miR-2135沉默质粒的P19细胞低表达miR-2135；②细胞增殖与周期：miR-2135沉默质粒转染P19细胞的增殖速度快于空载质粒转染P19细胞(P < 0.05)，培养24，48 h的S期细胞比例明显高于空载质粒转染P19细胞(P < 0.05)；③qRT-PCR检测结果：miR-2135沉默质粒转染P19细胞诱导10 d的miR-2135表达明显高于诱导0 d水平(P < 0.01)；④蛋白免疫印迹检测结果：诱导 10 d，miR-2135沉默质粒转染P19细胞心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子的表达明显低于空载质粒转染P19细胞；⑤结果表明：miR-2135抑制P19细胞的增殖，可促进其向心肌细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8966-879X(李辉)

关键词: 干细胞, 分化, 增殖, miR-2135, P19细胞, 细胞周期, 先天性心脏病

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-2135 in differentiated P19 cells is significantly higher than that in undifferentiated P19 cells. However, the effects of miR-2135 on P19 cell proliferation and differentiation into cardiomyocytes as well as cardiomyogenesis remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of miR-2135 on P19 cell proliferation and differentiation into cardiomyocytes.
METHODS: P19 cells were transferred with miR-2135 knockdown plasmid or vector plasmid. After 4 days of culture, cell proliferation was detected by MTT assay. Flow cytometry was used to detect cell cycle at 0, 24, 48 hours of culture. P19 cells in the two groups were induced to differentiate into cardiomyocytes. The expression of miR-2135 in differentiated and undifferentiated P19 cells was detected by quantitative real-time PCR at 0 and 10 days of induction. Levels of cardiac troponin T, atrial natriuretic peptide and myocardial transcription factor were detected using western blot assay at 10 days of induction.
RESULTS AND CONCLUSION: Expression level of miR-2135 in miR-2135-downexpressed P19 cells was obviously reduced. Compared with control cells, miR-2135 knockdown significantly upregulated P19 cell proliferation (P < 0.05) as well as induced a cell cycle rest in S stage after 24 and 48 hours of culture (P < 0.05). PCR findings showed that in the miR-2135 knockdown group, the expression level of miR-2135 at 10 days of induction was significantly higher than that at 0 day of induction (P < 0.01). Western blot assay showed that miR-2135-downexpressed P19 cells had obvious decreases in the protein levels of cardiac troponin T, atrial natriuretic peptide and myocardial transcription factor at 10 days of induction. Our findings confirm that miR-2135 inhibits P19 cell proliferation, but promotes the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Myocytes, Cardiac, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李辉. miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6814-6820.

Li Hui. Effect of miR-2135 on the P19 cell proliferation and differentiation into cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6814-6820.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Zaffran S,Frasch M.Early signals in cardiac development.Circ Res.2002; 91(6):457-469.
[2] 王春梅,姜涛,周春燕.诱导心脏发生的早期信号通路[J].中国生物化学与分子生物学报, 2004,20(5):572-577.
[3] Miyazono K,Kamiya Y,Morikawa M.Bone morphogenetic protein receptors and signal transduction. J Biochem.2010;147(1):35-51.
[4] Bajolle F,Zaffran S,Bonnet D.Genetics and embryological mechanisms of congenital heart diseases.Arch Cardiovasc Dis.2009;102(1):59-63.
[5] Kajstura J,Rota M,Cappetta D,et al.Cardiomyogenesis in the aging and failing human heart. Circulation. 2012; 126(15):1869-1881.
[6] Aguilar JS,Begum AN,Alvarez J,et al.Directed cardiomyogenesis of human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin and BMP signalling with small molecules. Biochem J.2015;469(2):235-241.
[7] Müller M,Stockmann M,Malan D,et al.Ca2+ activated K channels-new tools to induce cardiac commitment from pluripotent stem cells in mice and men.Stem Cell Rev.2012;8(3):720-740.
[8] Zhao Y,Ransom JF,Li A,et al.Dysregulation of cardiogenesis, cardiac conduction, and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2.Cell.2007;129(2):303-317.
[9] Morton SU,Scherz PJ,Cordes KR,et al.microRNA-138 modulates cardiac patterning during embryonic development.PNAS.2008;105(46):17830-17835.
[10] Qin DN,Qian L,Hu DL,et al.Effects of miR-19b overexpression on proliferation, differentiation, apoptosis and Wnt/β-catenin signaling pathway in P19 cell model of cardiac differentiation in vitro. Cell Biochem Biophys.2013;66(3):709-722.
[11] Hoffman JI,Kaplan S.The incidence of congenital heart disease.J Am Coll Cardiol.2002;39(12):1890-1900.
[12] Yutzey KE,Colbert M,Robbins J.Ras-related signaling pathways in valve development: ebb and flow. Physiology. 2005;20(6):390-397.
[13] Bruneau BG.The developmental genetics of congenital heart disease.Nature.2008; 451(7181):943-948.
[14] Olson EN.Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 2006; 313 (5795):1922-1927.
[15] van der Heyden MA,Defize LH.Twenty one years of P19 cells: what an embryonal carcinoma cell line taught us about cardiomyocyte differentiation. Cardiovasc Res.2003;58(2):292-302.
[16] van der Heyden MA,van Kempen MJ,Tsuji Y,et al. P19 embryonal carcinoma cells: a suitable model system for cardiac electrophysiological differentiation at the molecular and functional level.Cardiovasc Res. 2003; 58(2):410-422.
[17] 万楠,刘培燕,邱广蓉,等.miR-324-5p 在先天性心脏病患者血浆中的表达[C].第十二次全国医学遗传学学术会议论文汇编,2014.
[18] 夏曦.儿童先天性心脏病心力衰竭与血清 miR-30a水平的关系[J].临床儿科杂志,2014, 32(7):607.
[19] Sluijter JP,van Mil A,van Vliet P,et al.MicroRNA-1 and-499 regulate differentiation and proliferation in human-derived cardiomyocyte progenitor cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2010;30(4):859- 868.
[20] Cheng Y,Ji R,Yue J,et al.MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart: do they play a role in cardiac hypertrophy? Am J Pathol.2007;170(6): 1831-1840.
[21] Ventura A,Young AG,Winslow MM,et al.Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17∼ 92 family of miRNA clusters.Cell.2008; 132(5):875-886.
[22] Li Q,Song XW,Zou J,et al.Attenuation of microRNA-1 derepresses the cytoskeleton regulatory protein twinfilin-1 to provoke cardiac hypertrophy.J Cell Sci. 2010;123(14):2444-2452.
[23] Wong S,Ritner C,Ramachandran S,et al.miR-125b promotes early germ layer specification through Lin28/let-7d and preferential differentiation of mesoderm in human embryonic stem cells.PLoS One.2012;7(4):e36121.
[24] Li X,Wang J,Jia Z,et al.MiR-499 regulates cell proliferation and apoptosis during late-stage cardiac differentiation via Sox6 and cyclin D1.PLoS One. 2013;8(9):e74504.
[25] Rajala K,Pekkanen-Mattila M,Aalto-Setälä K.Cardiac differentiation of pluripotent stem cells.Stem Cells Int. 2011;2011:383709.
[26] Yao CX,Wei QX,Zhang YY,et al.miR-200b targets GATA-4 during cell growth and differentiation.RNA Biol.2013;10(4):465-480.
[27] Knezevic I,Patel A,Sundaresan NR,et al.A novel cardiomyocyte-enriched MicroRNA, miR-378, targets insulin-like growth factor 1 receptor implications in postnatal cardiac remodeling and cell survival.J Biol Chem.2012;287(16):12913-12926.
[28] Clément T,Salone V,Rederstorff M.Dual Luciferase Gene Reporter Assays to Study miRNA Function.Methods Mol Biol. 2015;1296:187-198.
[29] Meng J,Shi GL,Luan YS.Plant miRNA function prediction based on functional similarity network and transductive multi-label classification algorithm. Neurocomputing.2015;179:283-289.
[30] Enlund E,Fischer S,Handrick R,et al.Establishment of Lipofection for Studying miRNA Function in Human Adipocytes.PLoS One.2014;9(5):e98023.
[31] Schöniger C,Arenz C.Perspectives in targeting miRNA function.Bioorg Med Chem. 2013;21(20):6115-6118.
[32] DeCastro AJ,DiRenzo J.miRNA function and modulation in stem cells and cancer stem cells. Microrna Diagn Ther.2014;1(1):222-227.
[33] Chen X,Liu MX,Yan GY. RWRMDA: predicting novel human microRNA–disease associations. Mol Biosyst. 2012;8(10):2792-2798.
[34] Lau P,Bossers K,Salta E,et al.Alteration of the microRNA network during the progression of Alzheimer's disease.EMBO Mol Med.2013; 5(10): 1613-1634.
[35] Hudson RS,Yi M,Esposito D,et al.MicroRNA-106b-25 cluster expression is associated with early disease recurrence and targets caspase-7 and focal adhesion in human prostate cancer. Oncogene. 2013;32(35): 4139-4147.
[36] van Rooij E,Olson EN.MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles.Nat Rev Drug Discov.2012;11(11):860-872.
[37] Li A,Yu J,Kim H,et al.MicroRNA array analysis finds elevated serum miR-1290 accurately distinguishes patients with low-stage pancreatic cancer from healthy and disease controls.Clin Cancer Res.2013; 19(13): 3600-3610.
[38] Patel V,Williams D,Hajarnis S,et al.miR-17~92 miRNA cluster promotes kidney cyst growth in polycystic kidney disease. PNAS. 2013;110(26): 10765-10770.
[39] Pirola CJ,Gianotti TF,Castaño GO,et al.Circulating microRNA signature in non-alcoholic fatty liver disease: from serum non-coding RNAs to liver histology and disease pathogenesis.Gut.2015;64(5):800-812.
[40] Dangwal S,Thum T.microRNA therapeutics in cardiovascular disease models.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2014;54:185-203.
[41] Alvarez-Erviti L,Seow Y,Schapira AH,et al.Influence of microRNA deregulation on chaperone-mediated autophagy and α-synuclein pathology in Parkinson's disease. Cell Death Dis.2013;4(3):e545.
[42] Gong Y,Lu J,Yu X,et al.Expression of Sp7 in Satb2-induced osteogenic differentiation of mouse bone marrow stromal cells is regulated by microRNA-27a. Mol Cell Biochem.2016;417(1-2):7-16.
[43] Qiu J,Zhou XG,Zhou XY,et al.Characterization of microRNA expression profiles in 3T3-L1 adipocytes overexpressing C10orf116.Mol Biol Rep.2013; 40(11): 6469-6476.
[44] Hu DL,Liu YQ,Chen FK,et al.Differential expression of microRNAs in cardiac myocytes compared to undifferentiated P19 cells.Int J Mol Med.2011;28(1): 59-64.
[45] Mishaly D,Ghosh P,Preisman S.Minimally invasive congenital cardiac surgery through right anterior minithoracotomy approach.Ann Thorac Surg.2008; 85(3):831-835.
[46] Iribarne A,Easterwood R,Chan EY,et al.The golden age of minimally invasive cardiothoracic surgery: current and future perspectives.Future Cardiol.2011; 7(3):333-346.
[47] Omran A,Elimam D,Webster KA,et al.MicroRNAs: a new piece in the paediatric cardiovascular disease puzzle.Cardiol Young.2013;23(5):642-655.

引言

脊椎动物的心脏是胚胎发育最早形成并发挥功能的器官，主要来源于早期胚胎心肌细胞与心内膜细胞的前体细胞中胚层间充质细胞^[1-2]。经过复杂、精密的调控程序，这些细胞特化、形成管状结构，最终组装成有4个成熟心腔的健康心脏，这个过程中涉及到大量相关基因的顺序表达、多条信号通路(如FGF信号通路、BMP信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路等)及一系列包括细胞分化、迁移等在内的重要形态事件发生^[3-7]。越来越多的研究发现，任何环节中的关键基因缺失、突变、表达异常等都可能造成心脏发育畸形，导致每年1%的先天性心脏病罹患率，给家庭和社会带来了沉重负担^[8-12]。尽管多数学者认为超过85%先天性心脏病的发生是胚胎周围环境与基因相互作用的结果，但因环境因素引发的先天性心脏病仅占2%-5%，大多数仍然与遗传或基因缺陷有关^[13-14]。因此，从基因水平探索胚胎心脏的形成与发育机制，为先天性心脏病的防治提供了新思路。

P19细胞是从小鼠畸胎瘤中分离得到的多功能干细胞，目前已被广泛用于心脏发育的分子机制研究中。P19细胞具有自我复制能力和分化潜能，在体外不同培养条件下，它可分化成多种类型的细胞，例如低浓度二甲亚砜可诱导其分化成心肌细胞^[15]。在P19细胞向心肌细胞分化过程中，发育相关基因的表达以及电生理学特征均基本模拟了正常小鼠心肌细胞的发育过程，因此被认为是心肌细胞发育的良好体外模型^[16]。

近年来，越来越多的微小RNA(microRNA，miRNA)被发现在先天性心脏病中功能活跃^[17-27]。miRNAs是一类由19-25个核苷酸组成的内源性非编码小RNA，广泛存在于植物和动物细胞中，它通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’UTR)互补配对，介导mRNA降解或抑制其翻译，导致靶蛋白表达减少，从而参与并调控时序发育、细胞增殖、凋亡、分化、激素分泌等一系列生理进程，影响生物体的生长发育，并与人类多种疾病的发生密切相关^[28-41]。miR-2135是近期新发现的miRNA，微阵列杂交鉴定发现，miR-2135在Satb2诱导的骨髓基质细胞成骨分化中低表达^[42]，而在过表达C10orf116的3T3-L1脂肪细胞中高表达^[43]，另外其在P19细胞分化成的心肌细胞中的表达水平明显高于未分化的P19细胞，但其对P19细胞增殖、向心肌细胞的分化和心脏发育的影响尚未有报道^[44]。

因此研究首先检测miR-2135在未分化的和二甲亚砜诱导分化第10天P19细胞中的表达水平，接下来转染构建稳定低表达miR-2135的P19细胞，采用MTT法检测miR-2135对P19细胞增殖的影响，流式细胞检测其对P19细胞周期的影响，蛋白免疫印迹检测其对心肌分化相关标志物心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子表达的影响，鉴定其对P19细胞向心肌细胞分化的作用。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1至12月在商丘市第一人民医院病理科完成。

1.3 材料 P19细胞购自美国菌种保藏中心；α-MEM完全培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素、链霉素、二甲亚砜、MTT、琼脂糖(美国Sigma公司)；pcDNATM-6.2-GW/EmGFPmiR-2135-knockdown、pcDNATM-6.2-GW/EmGFPmiR-vector(上海吉玛公司)；胰酶(德国Miltenyi公司)；Trizol提取试剂盒，One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit、All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit、超敏ECL化学发光试剂盒(美国GeneCopoeia公司)；紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；U6(上海诺伦生物医药技术有限公司)；恒温培养箱(上海茸研仪器公司)；实时PCR仪(西安天隆科技有限公司)；嘌呤霉素(江阴齐氏生物科技有限公司)；酶标仪(美国Molecular Devices公司)；流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)；兔抗人Ki67、cTnT、ANP和GATA4抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(英国Abcam公司)。

1.4 实验方法

P19细胞培养：将P19细胞置于α-MEM完全培养基(含体积分数10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)中，于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，每隔2 d更换1次新鲜培养液，待细胞融合度达到90%左右时，用胰酶进行消化，并依据细胞的生长状况按一定比例进行传代培养。

细胞转染：将P19细胞进行胰酶消化后，以3×10⁵/孔的密度接种到加有α-MEM完全培养基的6孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养。待细胞融合度为50%-60%时，将miR-2135沉默及空载质粒(pcDNATM-6.2-GW/EmGFPmiR-2135-knockdown、pcDNATM-6.2-GW/EmGFPmiR-vector)以2 μg/孔的浓度转染P19细胞，8 h后更换为新鲜的α-MEM完全培养液。待细胞长满六孔板后，加入嘌呤霉素至终质量浓度为2 mg/L，筛选稳定株，用qRT-PCR验证miRNA-2135的低表达，建立稳定低表达miR-2135的P19细胞系。

MTT检测细胞增殖：将稳定低表达miR-2135及空载的P19细胞，以2×10³/孔的密度接种到加有α-MEM完全培养基的96孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中进行培养。每次检测时加入10 μL/孔MTT(5 g/L)溶液，于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱继续孵育4 h，然后换液，去除原来的培养基和MTT，加入150 μL/孔DMSO，放置摇床中轻微振荡溶解MTT还原生成的紫色甲臜。完全溶解后，上酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光度。每24 h检测一板，连续检测4 d。

流式细胞仪检测细胞周期：将稳定低表达miR-2135及空载的P19细胞分别接种到加有α-MEM完全培养基的6孔板中，待生长至约70%融合度时，用不含胎牛血清的α-MEM培养基饥饿细胞24 h，使细胞均处于G₀期。然后恢复胎牛血清，收集自恢复胎牛血清的第0，24，48小时的细胞，并上流式细胞仪检测各时间点的细胞周期分布。

P19细胞向心肌细胞的诱导分化：将转染有miR-2135沉默及空载质粒的P19细胞消化后，分别加入到诱导培养基中(在α-MEM完全培养基中加入1% DMSO即为诱导培养基)，调整其细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，取10 mL细胞悬液加入到直径10 cm的预先铺有5%琼脂糖的培养皿中，于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，每隔2 d更换1次新鲜的诱导培养液。诱导当天记为第0天。诱导6 d后，去除诱导培养基，换成α-MEM完全培养基，继续培养，每隔2 d更换1次新鲜的α-MEM完全培养液。

实时反转录PCR(qRT-PCR)检测miR-2135的表达：按照Trizol说明书提取诱导0，10 d的细胞总RNA，用紫外分光光度计测其纯度和浓度。然后严格依照One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit说明执行反转录，合成cDNA，将其稀释4倍，加入到All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit，以U6为内参基因，在实时PCR仪上进行定量，反应模式为预变性95 ℃ 10 min；变性95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 20 s；延伸 72 ℃ 1 min，共40个循环。采用Opticon-3软件对结果进行分析。
免疫检测检测蛋白表达：诱导10 d后，按照蛋白提取试剂盒操作说明提取细胞的总蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min。配胶，每孔加等量的蛋白，恒压40 V进行电泳，待Marker跑出上层胶后将电压调至80-100 V，待Marker跑至距玻板底部1 cm时结束电泳。然后250 mA 恒流转印蛋白至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1.5 h，以兔抗人Ki67、cTnT、ANP和GATA4抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min，再加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次10 min。之后采用超敏ECL化学发光试剂盒检测蛋白条带，以β-actin作为内参。

1.5 主要观察指标 miR-2135在未分化和已分化P19细胞中的表达差异；构建稳定低表达miR-2135及空载的P19细胞；用qRT-PCR验证miR-2135的低表达；检测miR-2135对P19细胞增殖、细胞周期和分化的影响。

1.6 统计学分析 应用GraphPad Prism 5统计软件处理数据，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05、P < 0.01或P < 0.001为差异有显著性意义。

讨论

先天性心脏病是胚胎时期心脏发育缺陷或部分停顿导致的心血管畸形，患儿出生时已存在心血管结构异常，是婴幼儿最常见、危害较大的心血管疾病，在活产婴儿中的发生率约为1%，是导致婴幼儿非感染性疾病死亡的最主要原因^[11-12]。目前主要采用外科手术来修复心脏发育缺陷，该手术经正中开胸，在全麻体外循环下灌注心脏停搏液，在心脏停搏下进行，虽然明显提高了先天性心脏病的临床治疗效果，但心脏停搏存在心脏心肌缺血再灌注损伤，而正中开胸存在失血过多，胸骨破坏、切口瘢痕明显，影响美观等一系列问题^[45-46]。因此，减少先天性心脏病的发病率和寻找新的安全有效治疗手段是非常重要的。

先天性心脏病作为一种多基因遗传疾病，已发现一些与心脏发育畸形相关的miRNAs，比如miR-1、miR-20b等在心脏发育过程中发挥的作用不容小觑^[47]。万楠等^[17]报道miR-324-5p在先天性心脏病患者血浆中表达减少，可能影响了转录因子GLI1的表达，造成先天性心脏病的发生。夏曦^[18]发现miR-30a与先天性心脏病患儿的心功能相关，可作为先天性心脏病合并心力衰竭的检测指标之一。miR-1被报道具有促进心肌细胞分化的作用，其下调解除了对细胞骨架调节蛋白twinfilin-1的抑制作用，导致心肌肥厚的发生^[19，22]。Cheng等^[20]报道一些microRNA在小鼠肥厚心肌组织中异常表达，而且体外培养的肥大心肌细胞也证实了这一结果，此外，他还发现抑制肥厚心肌组织中上调的miRNA-21和miRNA-195的表达可抑制心脏肥大。Ventura等^[21]报道缺乏miR-17-92基因簇(包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a和miR-92-1)的小鼠，存在肺发育不全及室间隔缺损，导致新生小鼠体积较小并且很快死亡。有研究发现miR-320在缺血心肌细胞中表达下调，其过表达促进心肌细胞的坏死与凋亡，增加缺血/灌注心脏的凋亡与缺血范围，沉默miR-320可对细胞起到保护作用。miR-494也被发现具有保护心肌再灌注损伤的作用。虽然近几年来，越来越多的miRNAs被发现与心脏发育畸形有关，但具体的致畸机制尚未完全阐明。

miR-2135是近期新发现的miRNA，有研究报道其在分化的P19细胞中的表达水平显著高于其在未分化P19细胞中的表达水平，推测其可能对心肌分化和心脏发育具有一定的影响，但目前尚未有报道。因此研究首先检测miR-2135在诱导分化第0，10天 P19细胞中的表达水平，证实miR-2135确实在诱导分化第10 天P19细胞中的表达水平显著高于其在未分化细胞中的表达水平。通过转染miR-2135沉默质粒构建miR-2135稳定低表达P19细胞，qRT-PCR检测证实了miR-2135稳定低表达P19细胞系成功建立。在此基础上，进一步探讨miR-2135低表达对P19细胞增殖和向心肌细胞分化产生的影响。

由于在脊椎动物的器官发育中，细胞增殖与凋亡是心脏形态建成的两个重要进程，两者相互平衡是心脏正常发育的前提，平衡一旦打破会直接或间接导致心脏发育畸形。因此，在研究中，不仅探究miR-2135对P19细胞分化的影响，也研究了其对细胞增殖、细胞周期的影响。MTT检测结果显示，miR-2135抑制P19细胞增殖。流式细胞仪检测结果表明，miR-2135可能通过将P19细胞阻滞于G₁/S期，达到抑制P19细胞增殖的目的。心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子是心肌细胞的标志性基因，常用来鉴定心肌细胞的形成。免疫印迹结果显示，在1%DMSO的刺激下，miR-2135低表达使这3种基因的mRNA表达水平在分化过程中明显下降，说明miR-2135低表达具有抑制P19细胞向心肌细胞分化的作用，但具体机制仍待研究。

综上所述，研究发现miR-2135在分化的P19细胞中高表达，miR-2135的沉默抑制P19细胞的增殖和向心肌分化，阻滞细胞周期，但miR-2135对P19细胞增殖和向心肌细胞分化产生影响的机制尚不清楚，有待进一步研究。