ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.018

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
表皮干细胞：是能够产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞，具有终身、无限的自我更新能力。表皮干细胞是表皮发生、分化和创面修复的基础，其正常增殖分化是维持皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本要求，也是皮肤组织工程理想的种子细胞。
ERK信号通路：细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)分为ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等磷酸化而激活，进入细胞核作用于E1k-1、c-myc、c-fos、c-jun、ATF、NF-kB和AP-1等转录因子，促进某些基因的转录与表达，与细胞的增殖与分化密切相关。

摘要
背景：表皮干细胞体外培养时易于分化和衰老，增殖能力有限，制约了其在皮肤组织工程的应用和发展，了解表皮干细胞增殖分化的调控机制可以为表皮干细胞的临床应用奠定理论基础。
目的：探索ERK信号通路在人表皮干细胞增殖分化中的作用。
方法：分离培养表皮干细胞，使用ERK通路抑制剂PD98059抑制表皮干细胞ERK通路的活性，转染MEK1重组质粒过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路。通过MTT法检测表皮干细胞的增殖率，克隆形成实验检测表皮干细胞的克隆形成能力，Western blot检测表皮干细胞标志蛋白K19和β1-整合素及分化细胞标志蛋白K10的表达。
结果与结论：①使用PD98059抑制ERK通路后，表皮干细胞增殖率下降，克隆形成减少，细胞分化加强；②过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路后，表皮干细胞增殖率上升，克隆形成能力增强，细胞分化受到抑制；③这些结果表明ERK通路在表皮干细胞的增殖分化中有重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0177-4169(李冰)

关键词: 干细胞, 分化, 表皮干细胞, MAPK, ERK, 增殖, 克隆形成, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Epidermal stem cells (ESCs) cultured in vitro can easily become differentiated and aged, but have limited proliferation ability. These characters limit the application and development of ESCs in skin tissue engineering. Increasing understanding of the regulatory mechanism of ESCs proliferation and differentiation would lay the theoretical foundation for the clinical application of ESCs.
OBJECTIVE: To identify the role of the ERK pathway in the proliferation and differentiation of ESCs.
METHODS: ESCs were isolated and cultured in vitro. The activity of the ERK pathway was blocked by PD98059 and the activation of the ERK pathway was conducted by PMA or transfecting MEK1 recombinant plasmid to enable the overexpression of MEK1. The effect of activation or blockage of the ERK pathway on the proliferation and colony formation ability of ESCs was detected by MTT and colony formation assay, respectively. The expression of ESCs markers K19 and β1-integrin and differentiated cell marker K10 was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: When the activity of the ERK pathway was blocked by PD98059, the proliferation and colony formation abilities of ESCs were inhibited and the differentiation was enhanced. On the contrary, activating the ERK pathway by PMA or upregulation of MEK1 enhanced the proliferation and colony formation abilities of ESCs but inhibited the cell differentiation. These results indicate that the ERK pathway plays an important role in the proliferation and differentiation of ESCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Epidermis, Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李冰，王军爱. ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6807-6813.

Li Bing, Wang Jun-ai . Role of the ERK pathway in the proliferation and differentiation of human epidermal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6807-6813.

图/表（结果） 1

2.1 表皮干细胞标志蛋白的鉴定 为了鉴定分离的细胞是否为表皮干细胞，使用Western blot方法鉴定表皮干细胞表面标志蛋白K19和β1-整合素，细胞分化标志蛋白K10的表达，结果表明分离的表皮干细胞表达K19和β1-整合素，表达极少量K10。

培养7 d后表皮干细胞K19和β1-整合素表达减少，分化标志蛋白K10表达增加，说明在培养过程中表皮干细胞逐渐分化，见图1。

2.2 激活或抑制ERK通路对表皮干细胞增殖的影响 为了研究ERK通路对细胞增殖的影响，使用ERK通路抑制剂PD98059抑制ERK通路的活性，使用ERK通路激活剂PMA或者过表达ERK通路上游激酶MEK1激活ERK通路，MTT法检测细胞增殖情况。结果发现，使用抑制剂PD98059抑制ERK通路后表皮干细胞增殖率下降，使用PMA或过表达MEK1激活ERK通路后细胞增殖率上升，表明ERK通路对表皮干细胞的增殖有促进作用，见图2。

2.3 激活或抑制ERK通路对表皮干细胞克隆形成的影响 为了研究ERK通路对表皮干细胞克隆形成能力的影响，使用抑制剂PD98059抑制ERK通路，克隆形成实验检测表皮干细胞的克隆形成能力。结果发现使用抑制剂PD98059抑制ERK通路后表皮干细胞克隆形成数减少，使用PMA或过表达MEK1激活ERK通路后表皮干细胞克隆形成数增加，表明激活ERK通路可以增强表皮干细胞的克隆形成能力，见图3。

2.4 激活或抑制ERK通路对表皮干细胞分化的影响 使用抑制剂PD98059抑制ERK通路的活性，使用PMA或者过表达MEK1激活ERK通路，继续培养7 d后检测表皮干细胞及分化细胞标志蛋白。结果发现，与对照组相比，抑制ERK通路后表皮干细胞标志蛋白K19和β1-整合素表达降低，分化细胞标志蛋白K10表达升高。激活ERK通路后表皮干细胞标志蛋白K19和β1-整合素表达升高，分化细胞标志蛋白K10表达降低，表明激活ERK通路可以抑制表皮干细胞的分化，见图4。

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引言

皮肤是人体最大的器官，也是人体与外界接触的第一道屏障。皮肤一方面可以保护体内组织器官等免受外界伤害，另一方面可以防止体内电解质和水分的丢失^[1]。烧伤、创伤、手术、皮肤疾病等常造成的皮肤缺损，常规的临床治疗方案有自体和异体皮肤移植^[2]。但是自体皮肤来源有限，异体移植存在一定的免疫排斥，难以满足临床上的需求。皮肤干细胞是皮肤产生、修复的重要源泉^[3]，是修复皮肤缺损的重要种子细胞^[4]。皮肤干细胞在体内通常情况下处于静息状态，分裂缓慢，具有慢周期性^[5]。在体外培养时，皮肤干细胞具有长期生长潜能，呈克隆性生长，具有较强的克隆形成能力^[6]。表皮中存在的皮肤干细胞是维持表皮组织更新和稳态的基础^[7]。

表皮干细胞是皮肤组织特异干细胞，具有自我更新和分化潜能，可增殖分化为各种表皮细胞^[8]，能够维持表皮自我更新、保持正常皮肤结构和进行创面修复等作用^[9]。表皮干细胞包括毛囊间表皮干细胞、毛囊干细胞、皮脂腺前体细胞等^[10]。表皮中的角质形成细胞主要由3种细胞组成，包括干细胞、短暂扩增细胞和分化细胞^[11]。有研究表明，表皮干细胞可逐渐分化为短暂扩增细胞，短暂扩增细胞又可分化为末端分化细胞^[12]。利用表皮干细胞修复皮肤损伤和治疗皮肤疾病具有极大的实用价值^[13]。表皮干细胞体外培养时易于分化和衰老，增殖能力有限^[14]，制约了其在皮肤组织工程的应用和发展。表皮干细胞的增殖分化受其自身和周围环境的调控，如何使表皮干细胞在培养过程中快速增殖而不发生分化，具有积极的临床价值。因此，了解表皮干细胞增殖分化的调控机制可以为表皮干细胞的临床应用奠定理论基础。

目前已经发现多种信号通路在调控表皮干细胞分化过程中有重要的作用，如Wnt/β-catenin^[15]、Notch^[11]、BMP/TGF-β2^[16]、整联蛋白介导的MAPK信号通路等^[17]。MAPK信号通路是介导细胞外信号转导到细胞内的重要信号转导系统，是调控细胞增殖和凋亡的关键通路。MAPK属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族^[18]，广泛存在于哺乳动物细胞质中，参与到细胞生长、存活、凋亡、压力应答及细胞间信号转导等生理过程^[19]。MAPK信号通路包括ERK、p38激酶、JNK、ERK5等^[20]。MAPK信号通路通过三级级联反应(MAPKKK-MAPKK-MAPK)激活转录因子，调控基因的表达^[21]。MAPK可引起细胞核内转录因子的活化，参与信号从细胞表面传递到核内的过程，调控细胞的增殖和分化^[22]。在MAPK信号通路中，ERK通路包括ERK1和ERK2两个激酶，主要通过Ras-Raf-MEK-ERK级联起作用^[22-23]。生长因子与酪氨酸激酶受体结合，活化受体本身的酪氨酸激酶，酪氨酸激酶活化Ras蛋白，Ras蛋白和Raf结合并将其磷酸化，活化的Raf磷酸化下游的MEK，MEK可以使丝/苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，最终激活ERK，ERK转入细胞核，通过活化其他激酶或转录因子调控基因的表达^[22-23]。

实验探索ERK通路在人表皮干细胞增殖分化中的作用，为表皮干细胞的临床应用奠定了理论基础。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3至10月在解放军第451医院病理室完成。

1.3 材料 胰蛋白酶、中性蛋白酶Ⅱ、Ⅳ型胶原、PD98059、PMA、MTT、二甲基亚砜、吉姆萨染液购自Sigma公司；Opti-MEM培养基、K-SFM培养基、胎牛血清、青/链霉素、L-谷氨酰胺购自Gibco公司；lipofectamine 2000购自Introvigen公司；pIRES2-EGFP质粒购自安吉思生物医药科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Scientific公司；鼠抗β1-整合素购自Abcam公司；鼠抗角蛋白K10、K19购自Santa Cruz公司；RIPA裂解液、ECL显色液、鼠抗β-actin、HRP标记的山羊抗鼠购自Beyotime公司。

1.4 实验方法

1.4.1 表皮干细胞的分离培养 经伦理委员会同意，取烧伤整形患者植皮手术后剩余皮片，患者对实验均知情同意。将皮片用含100 U/mL青/链霉素的PBS清洗3次，将冲洗干净的皮片组织剪成0.5 cm×0.5 cm大小，置于0.25%中性蛋白酶Ⅱ中消化20 min，4 ℃过夜。分离表皮和真皮，将表皮置于0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA中，37 ℃消化30 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的培养基终止消化，经200目细胞筛过滤，获得单细胞悬液。离心沉淀细胞并以含5 μg/L表皮生长因子和体积分数为10%胎牛血清的K-SFM培养基重悬细胞，接种于Ⅳ型胶原包被过的96孔板中，37 ℃、体积分数为5% CO₂孵育箱中孵育10-15 min，吸出培养液，吸弃未贴壁细胞成分，清洗2次后加入适量新鲜表皮干细胞培养基培养。次日吸出培养基及未贴壁细胞，再加入新鲜培养基，每两三天换液1次。细胞长至70%-80%融合时用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化培养瓶内细胞，按1∶2比例进行传代，取生长良好的第3代细胞接种于预铺有Ⅳ型胶原的6孔培养板中。

1.4.2 ERK通路的抑制和激活 ERK通路抑制剂PD98059和激活剂PMA溶于二甲基亚砜配成母液，向培养基中加入PD98059和PMA使其终浓度分别为 50 μmol/L和25 nmol/L，加入等量的二甲基亚砜作为溶剂对照，置于含体积分数为5% CO₂的37 ℃培养箱中孵育24 h，更换新鲜的培养基继续培养。

1.4.3 MEK重组质粒转染细胞 构建含MEK1和EGFP的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MEK1，将构建好的重组质粒按lipofectamine 2000的说明书操作方法转染到表皮干细胞中，整个转染过程使用无血清的Opti-MEM培养基。将细胞置于含体积分数为5% CO₂的37 ℃培养箱中转染6 h，转染后换成K-SFM培养基继续培养。

1.4.4 MTT检测细胞增殖 将表皮干细胞接种在96孔板上，转染MEK1质粒或者药物处理，每隔2 d取3个孔进行MTT实验。每孔换成新鲜的培养基，加入10% MTT反应液(5 g/L)，37 ℃反应4 h使细胞形成不溶蓝紫色甲臜。移去培养基，细胞用PBS洗2次，加入150 μL 二甲基亚砜溶解甲臜，将培养板均匀振荡5 min，用酶标仪测定细胞在570 nm处的吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.4.5 克隆形成实验 表皮干细胞经胰酶消化后计数，每200个细胞接种于1个Ⅳ型胶原包被的6孔培养板中，每个处理组设置3个重复样，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中，静止培养14 d。移去培养基，将细胞用甲醇固定10 min，PBS洗2遍，吉姆萨染色10 min，移去染色液，水冲洗后晾干。在显微镜下观察计数>50个细胞的细胞克隆，计算克隆形成率。

克隆形成率(%)=细胞克隆数/接种细胞数×100%

1.4.6 Western blot检测表皮干细胞分化 将刚传代培养或培养7 d后的细胞用PBS洗2次，使用RIPA裂解液(添加1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF)裂解细胞，4 ℃， 1 200×g离心5 min，上清即为细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒定量细胞总蛋白浓度，每组样品取50 μg蛋白，加入SDS上样缓冲液，沸水煮10 min后进行凝胶电泳。电泳完毕后将蛋白从胶转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入鼠抗角蛋白K10、K19、β1-整合素的抗体作为一抗，以β-actin作为内参，4 ℃孵育过夜，HRP标记的山羊抗鼠作为二抗，37 ℃孵育1 h。加入ECL显色液，胶片曝光检测蛋白表达。

1.5 主要观察指标 ①人表皮干细胞标志蛋白的表达；②激活或抑制ERK通路对表皮干细胞增殖的影响；③激活或抑制ERK通路对表皮干细胞克隆形成能力的影响；④激活或抑制ERK通路对表皮干细胞分化的影响。

1.6 统计学分析 实验数据均以x(_)±s表示，使用GraphPad Prism 5软件分析处理数据。组间差异的比较使用t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

表皮干细胞具有较强的克隆形成能力，克隆形成能力和单个细胞的增殖潜能有关^[5]。K19和β1-整合素是被广泛接受的表皮干细胞标志蛋白^[24]，K10是表皮干细胞角质分化的标志蛋白^[25]，通过检测它们的表达可以判断表皮干细胞的分化进程。为了研究MAPK通路中的ERK通路对表皮干细胞增殖分化的影响，使用抑制剂抑制ERK通路的活性，使用激活剂或者过表达MEK1激活ERK通路的活性，检测细胞增殖及克隆形成能力，并探索了激活或抑制ERK通路后表皮干细胞标志蛋白及分化标志蛋白的变化。

有研究表明，MAPK信号通路在多种生理学过程中有重要的作用，如细胞的增殖、分化、迁移、衰老和凋亡等^[26]。在神经干细胞中，高迁移率族蛋白B通过MAPK通路促进神经干细胞的增殖^[27]。LPS通过MAPK通路促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化^[28]。在头颈部鳞状癌细胞中，抑制p38/MAPK通路可以抑制细胞的增殖和肿瘤的生长^[29]。同时，MAPK信号通路对胃肠道上皮细胞的增殖和分化有重要的调控作用^[30]。

ERK通路是MAPK通路中的主要通路之一，ERK通路对细胞的增殖、分化和存活有重要的作用^[31]。使用MEK抑制剂处理骨髓间充质干细胞可以促进细胞向平滑肌细胞分化^[32]。在胚胎干细胞向神经元细胞分化的过程中，ERK1/2起着重要的作用^[33]。胰岛素生长因子1可以通过ERK通路加强人牙周韧带干细胞的增殖和成骨分化^[34]。在果蝇中，p38-MAPK信号通路对维持果蝇肠道干细胞增殖和分化的平衡有重要的作用^[35]。在人胚胎干细胞中，MEK/ERK通路对维持人胚胎干细胞的不分化状态有重要的作用，使用抑制剂或者RNA干扰技术抑制MEK/ERK通路的活性可引起胚胎干细胞自我更新能力的丧失^[36]。

在表皮干细胞的增殖分化过程中，有多种信号通路调控表皮干细胞的生理进程。胚胎干细胞关键蛋白通过促进β-catenin的磷酸化抑制Wnt/β-catenin通路，从而保持表皮干细胞增殖和分化的稳态^[15]。激活Notch信号通路可以促进表皮干细胞增殖并维持细胞的低分化状态^[37]。Kindlin-1蛋白通过调控Wnt和TGF-β两个信号通路的平衡从而调控表皮干细胞的增殖^[38]。β1-整合素通过调控MAPK通路从而调控表皮干细胞的增殖分化^[17]。激活BMP信号通路可以限制表皮干细胞的激活和扩张^[39]。

PD98059可以特异性抑制MAPK通路中的ERK1/ERK2^[40]，常用做ERK通路的抑制剂。使用PD98059抑制ERK通路后，表皮干细胞增殖率下降，克隆形成减少，细胞分化加强。PMA可以诱导ERK的磷酸化，常用作MAPK通路的激活剂^[41]。MEK1是ERK的上游信号，通过构建MEK1重组质粒过表达MEK1激活MAPK通路中的ERK通路。结果表明过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路后，表皮干细胞增殖率上升，克隆形成能力增强，细胞分化受到抑制。这些结果表明ERK通路在表皮干细胞的增殖分化中有重要的作用。

实验发现激活ERK通路可以促进表皮干细胞的增殖，增强表皮干细胞克隆形成能力，并且对表皮干细胞的分化有抑制作用。这些研究为表皮干细胞的临床应用奠定了基础，ERK调控表皮干细胞增殖分化的具体机制还需要进一步研究。