脐血干细胞移植干预妊娠期高血压模型大鼠的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
内皮素：是一种内源性长效血管收缩调节因子。内皮素还有强大的正性肌力作用，并且缩血管升血压效应可反射性引起心率抑制，造成心肌供血不足，还可诱发心肌细胞糖超载，心律失常以及心肌能量代谢障碍。目前大量研究表明严重心绞痛、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、经皮腔内成形术的机体内皮素合成和释放明显增加，或血管对内皮素反应性亢进，都可能促进上述病理过程的发生发展，而应用内皮素抗体或内皮素阻断剂则可防治缺血性心脏病。
血管紧张素Ⅱ：是已知最强的缩血管活性物质之一。人体的血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞以及脑的一些部位、心脏和肾脏器官的细胞上存在血管紧张素受体。血管紧张素Ⅱ与血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应。血管紧张素作用于血管平滑肌，可使全身微动脉收缩，动脉血压升高。血管紧张素Ⅱ作用于外周血管，使静脉收缩，回心血量增加。

摘要
背景：随着对间充质干细胞认识的不断加深，人们发现间充质干细胞在免疫调节和抗炎方面有突出的治疗效果。
目的：探讨脐血干细胞对内毒素诱导的妊娠期高血压模型大鼠的治疗作用。
方法：将24只妊娠SD大鼠随机分为3组：对照组、模型组及实验组，每组8只。模型组和实验组建立内毒素诱导的妊娠期高血压模型，造模同时实验组静脉注射脐血干细胞悬液1 mL，对照组和模型组静脉注射等量生理盐水。通过检测各组大鼠收缩压、尿蛋白浓度及白细胞数量，内皮相关因子AngⅡ及ET-1的表达，观察脐血干细胞治疗妊娠期高血压疾病模型的疗效。
结果与结论：①与对照组比较，模型组大鼠收缩压、尿蛋白及血清白细胞数量明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，并且随着内毒素作用时间的延长，模型组大鼠收缩压、尿蛋白和血清白细胞数量不断升高；②与模型组比较，实验组大鼠收缩压、尿蛋白和白细胞数量均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与对照组比较，模型组内皮损伤因子AngⅡ和ET-1均有明显升高，与模型组相比，实验组大鼠内皮损伤因子AngⅡ和ET-1表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，脐血干细胞对妊娠期高血压模型大鼠有一定的治疗作用，可能是通过是调节内皮损伤相关因子的表达来实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1402-9029(崔雪梅)

关键词: 干细胞, 移植, 脐血干细胞, 大鼠, 妊娠期高血压疾病, 血压, 尿蛋白, 白细胞, AngⅡ, ET-1

Abstract:

BACKGROUND: With the depth understanding of mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells are found to exert a prominent effect on immune regulation and anti-inflammation.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of umbilical cord blood stem cell transplantation on endotoxin-induced hypertension in pregnant rats.
METHODS: Twenty-four pregnant Sprague-Dawley rats were randomized into three groups with eight rats in each group: control, model and experimental groups. Endotoxin-induced hypertension models were made in the model and experimental groups. Meanwhile, rats were given intravenous injection of umbilical cord blood stem cell suspension (1 mL) in the experimental groups and the same volume of normal saline in the control and model groups. Therapeutic effects of umbilical cord blood stem cell transplantation were observed through detection of systolic blood pressure, urine protein level, serum white blood cell quantity and Ang II and ET-1 expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the systolic blood pressure, urine protein level and serum white blood cell quantity of rats were increased significantly in the model group, and over time, endotoxin continuously promoted these parameters in the model group. After cell transplantation, a significant reduction in systolic blood pressure, urine protein level and serum white blood cell quantity of rats was found in the experimental group compared with the model group (P < 0.05). After modeling, the expression levels of Ang II and ET-1 were decreased significantly, while these levels were increased significantly after cell transplantation (P < 0.05). These findings indicate that umbilical cord blood stem cell transplantation may have a certain therapeutic effect on gestational hypertension in rats, which may be realized by regulating the secretion of endothelial injury-related factors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Hypertension, Pregnancy-Induced, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

崔雪梅，景笑笑. 脐血干细胞移植干预妊娠期高血压模型大鼠的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6795-6800.

Cui Xue-mei, Jing Xiao-xiao. Interventional effect of umbilical cord blood stem cell transplantation in rats with gestational hypertension[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6795-6800.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 健康SPF级10周龄SD雄性大鼠15只，SD雌性大鼠30只，妊娠大鼠共28只，随机取24只妊娠期大鼠随机分为3组：对照组、模型组和实验组，均进入结果分析。

2.2 脐血干细胞形态学观察及鉴定结果 培养第1天，显微镜下可见细胞迅速贴壁，细胞形态为梭形或卵圆形；培养第2天，脐血干细胞均匀分布，体积较大，形态为长梭形或多角状(图1A)。传代后细胞生长迅速，数量明显增多，生长较均匀一致，培养3 d细胞融合成片状，排列紧密、整齐有序，长满培养瓶底部。传5代仍可保持基本生物学特性不变(图1B)。流式细胞仪检测脐血干细胞表面标记物CD105、CD90、CD44、CD29、CD49、HLA-Ⅰ呈阳性表达，CD14、CD34、CD45、CD38、CD133、CD31和HLA-Ⅱ呈阴性表达，见表1，图2。

2.3 脐血干细胞移植后各组大鼠收缩压测定结果 从表2数据分析可知：细胞移植后第1天，3组大鼠收缩压比较差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植后第7天，3组大鼠收缩压比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与对照组比较，模型组大鼠收缩压明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，并且随着内毒素作用时间的延长，模型组大鼠收缩压不断升高，与模型组比较，实验组大鼠收缩压明显有所降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，且血压较稳定。细胞移植后第13天，模型组大鼠收缩压已经达到(137.91±5.35) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 脐血干细胞移植后各组大鼠24 h尿蛋白测定结果 从表3数据分析可知：细胞移植第2天，3组大鼠24 h尿蛋白比较差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植第8天，与对照组相比，模型组大鼠24 h尿蛋白明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，并且随着内毒素作用时间的延长，24 h尿蛋白不断升高，说明内毒素可造成正常妊娠大鼠尿蛋白升高；到第14天，与模型组相比，实验组大鼠24 h尿蛋白有所降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 脐血干细胞移植后各组大鼠白细胞计数结果 从表4数据分析可知：细胞移植第1天，3组大鼠白细胞数量比较差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植第13天，与对照组相比，模型组大鼠白细胞数量明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，实验组大鼠白细胞数量有明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 各组胎盘组织内皮损伤相关因子AngⅡ及ET-1表达 由表5数据分析可知：模型组及实验组大鼠静脉注射内毒素后，内皮损伤因子AngⅡ及ET-1与对照组比较均有明显升高，这可能是大鼠注射内毒素后通过诱发炎症反应，损伤了内皮细胞功能，导致内皮损伤因子AngⅡ和ET-1分泌的增加，进而导致血管收缩，大鼠收缩压增高。与模型组相比，实验组大鼠内皮损伤因子AngⅡ和ET-1表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机动物分组实验。

1.2 时间及地点 于2015年3至11月在郑州大学附属郑州中心医院完成。

1.3 材料

1.3.1 脐血来源 封闭式采血法采集健康、正常足月分娩胎儿的脐血，由郑州大学附属郑州中心医院产科协助完成，均已征得产妇及家属授权同意和医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验动物 健康SPF级10周龄SD雄性大鼠15只，体质量(250±30) g，SD雌性大鼠30只，体质量(220±30) g，由中国医学科学院实验动物中心提供，饲养于河南省实验动物中心，于温度为(25±2) ℃，湿度为(50±5)%，自动调控昼夜各12 h的环境条件下，适应饲养1周。实验过程中对动物处置符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.3.3 主要试剂及设备 无菌磷酸盐缓冲液(上海麦莎生物科技有限公司)；低糖培养基(美国Gibco公司)；各标志物抗体(BD公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)；SNA.320D型培养箱(Thereto Forma公司)；超洁净实验操作台(苏州净化设备公司)；IX71倒置显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(日本Nikon公司)；离心机(德国Heraeus公司)；EPICS-XL型流式细胞仪(Beckman Corlter公司)。

1.4 方法

1.4.1 脐血干细胞的分离、培养及鉴定 取30 mL脐血，置于50 mL EP离心管(带盖)中，再精密加入羟乙基淀粉(HES)10 mL，振摇混匀，静置1 h；取上层液体20 mL，置于50 mL EP离心管中，加入20 mL PBS，振摇混匀，以2 000 r/min低温离心20 min；弃去上清液，再加入溶血素50 mL，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，置于37 ℃、体积分数50%CO₂培养箱中培养30 min，加DMEM/F12完全培养液重悬细胞，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，计数后，接种于细胞培养瓶中，培养3 d后换培养液，细胞贴壁生长融合约90%时，加0.25%胰蛋白酶溶液消化传代，于显微下观察细胞生长状态，取第3-5代细胞用生理盐水调整细胞悬液浓度为1.0×10¹⁰ L^-¹，备用。

1.4.2 脐血干细胞表面分子标记物检测 分别用藻红蛋白标记的CD29，CD44，CD73，CD105鼠抗人单克隆抗体，异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD34，CD45，HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ，标记第5代脐血干细胞，充分混匀后，4 ℃低温避光培养20 min，加入1 mL PBS洗涤，以3 000 r/min低温离心5 min，弃去上清液，再以PBS洗涤1次，再重悬，用流式细胞仪检测干细胞标记物。

1.4.3 妊娠期高血压疾病模型建立及分组、治疗 大鼠适应性饲养1周后，按雄性︰雌性(1︰2)合笼共养，次日清晨8：30采集雌性大鼠阴道分泌物显微镜下检查，以发现精子为妊娠第0天。在大鼠妊娠第2周，随机分为3组：对照组、模型组及实验组，每组8只。模型组和实验组大鼠以体质量1 μg/kg静脉注射2 mL内毒素，而对照组注射等体积生理盐水。同时实验组8只妊娠期大鼠静脉推注脐血干细胞悬液1 mL，对照组及模型组大鼠静脉推注1 mL生理盐水。

1.4.4 各组大鼠收缩压测定 分别于治疗后第1，7，13天上午8：30-11：00用无创血压测量仪测量大鼠收缩压，在大鼠呼吸平稳状态下，5 min内测量5次，取平均值。

1.4.5 各组大鼠24 h尿蛋白测定 分别于治疗后第2，8，14天，用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，记录尿液体积，检测尿蛋白浓度。

1.4.6 各组大鼠白细胞计数 分别于治疗后第1，13天，快速割去大鼠尾尖约2 mm，采血约60 μL，对白细胞进行计数。

1.4.7 各组内皮损伤相关因子AngⅡ及ET-1测定 于治疗后第15天，剖宫取胎，将胎盘组织放入冻存管液氮中冻存。采用Real-Time PCR检测胎盘组织AngⅡ及ET-1 mRNA表达。

1.5 主要观察指标 各组大鼠收缩压、尿蛋白浓度、白细胞计数以及胎盘组织内皮相关因子AngⅡ及ET-1 mRNA表达。

1.6 统计学分析 实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较釆用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

妊娠期高血压疾病是发生于妊娠期的特有并发症，严重威胁孕产妇及围生儿的健康。目前临床对该病的研究一直是妇产科的难点及热点，但治疗方式有一定的局限性，同时也不能从根本上解决问题。大量研究认为，妊娠期高血压疾病的发病机制主要与免疫抑制反应减弱、释放大量炎症因子，直接或间接导致血管内皮损伤有关。血管损伤相关因子AngⅡ和ET-1与妊娠期高血压疾病密切相关，对血管收缩具有很强的作用，临床甚至发现有许多患者的肾素-血管紧张素系统基因存在缺陷。

实验根据参考文献，用内毒素来诱发炎症，制备妊娠期高血压疾病模型^[21]。与对照组大鼠比，模型组大鼠收缩压、尿蛋白及血清白细胞数量明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，并且随着内毒素作用时间的延长，模型组大鼠收缩压、尿蛋白和血清白细胞数量不断升高，说明内毒素可造成正常妊娠大鼠尿蛋白和白细胞数量升高，引起大鼠炎症反应，与文献研究结果类似^[22]。

研究认为，脐血干细胞具有免疫调节功能，其可分泌诱导T细胞增殖的抑制剂，同时也可促进CD4⁺T细胞的分化，还可以改变细胞因子分泌谱，上调或下调炎症因子的表达，增加抗炎因子的产生^[23-30]。实验给予妊娠期高血压疾病模型大鼠静脉移植脐血干细胞，移植后第7天，与模型组相比，实验组大鼠收缩压、尿蛋白和白细胞数量均明显有所降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组及实验组大鼠静脉注射内毒素后，内皮损伤因子AngⅡ和ET-1与对照组比较均有明显升高。内皮损伤因子AngⅡ和ET-1分泌增加，导致血管收缩，进而导致大鼠收缩压增高，与模型组相比，实验组大鼠内皮损伤因子AngⅡ和ET-1表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。脐血干细胞对妊娠期高血压疾病大鼠有一定的治疗作用，可能是通过是调节内皮损伤相关因子的表达来实现的。