miR-1231对结肠癌干细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.009

摘要/Abstract

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文题释义：
结肠癌干细胞：是一小部分存在于结肠癌中具有自我更新、无限增殖和多项分化潜能的肿瘤干细胞，它与结肠癌的复发、转移和治疗耐受有着密切的联系。通过结肠癌细胞表面表达的标志分子如CD133、CD44、CD29、ALDN1和Wnt等从结肠癌中分离得到少部分具有干细胞特性的结肠癌细胞即结肠癌干细胞。
Bcl-2/Bax：Bcl-2 和Bax 在体内通常以二聚体形式发挥作用，两者的比例决定了细胞在体内遭到某些刺激后对凋亡的敏感性。如Bax的表达量少，Bcl-2即可拮抗Bax的作用而阻止肿瘤细胞凋亡，细胞趋于生存；如Bax过多的表达，则细胞对外界凋亡诱导因素十分敏感，细胞趋于凋亡。

摘要
背景：前期研究发现miR-1231在结肠癌干细胞中表达明显下调，但是其具体的作用机制尚不明确。
目的：探讨miR-1231对结肠癌干细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。
方法：采用免疫磁珠分选技术从结肠癌细胞株SW1116中分选出结肠癌干细胞(CD133⁺CD44⁺)和双阴性细胞(CD133^-CD44^-)。qRT-PCR检测miR-1231在这2种细胞中的表达水平。将CD133⁺CD44⁺细胞通过脂质体转染miR-1231模拟物(miR-1231 mimics)或miRNA模拟物对照(miR-control)。采用MTT、流式细胞仪、Transwell小室实验检测miR-1231对CD133⁺CD44⁺细胞增殖、凋亡、侵袭的影响；免疫印迹法检测miR-1231对CD133⁺CD44⁺细胞中Ki67、Bax、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。
结果与结论：①采用免疫磁珠分选技术得到CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-细胞；②miR-1231在CD133⁺CD44⁺细胞中的表达水平显著低于CD133^-CD44^-细胞；③miR-1231抑制CD133⁺CD44⁺细胞增殖和侵袭，促进其凋亡；④相对于转染miRNA模拟物对照组，miR-1231高表达的CD133⁺CD44⁺细胞具有较低的Ki67、Bcl-2，MMP-2和MMP-9蛋白表达和较高的Bax蛋白表达，进一步证实miR-1231抑制CD133⁺CD44⁺细胞增殖和侵袭，促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0674-484X(阎立昆)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 结肠癌干细胞, miR-1231, 增殖, 凋亡, 侵袭

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that miR-1231 is down-regulated in colon cancer stem cells (CCSCs), but the effect of miR-1231 on CCSCs remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of miR-1231 on the proliferation, apoptosis and invasion of CCSCs (CD133⁺CD44⁺).
METHODS: CD133⁺CD44⁺ cells and CD133^-CD44^- cells were separated from SW1116 cells by immunomagnetic bead separation. The expression level of miR-1231 in CD133⁺CD44⁺ and CD133^-CD44^- cells was detected by qRT-PCR. miR-1231-overexpressing CD133⁺CD44⁺ cells were transfected with miR-1231 mimics or miR-control by lipofection transfection. The effects of miR-1231 on CD133⁺CD44⁺ cell proliferation, apoptosis and invasion were investigated by MTT, flow cytometry and Transwell assays, respectively. In addition, the expression levels of Ki67, Bax, Bcl-2, MMP-2 and MMP-9 protein in miR-1231-overexpressing CD133+CD44+ cells and control cells were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: CD133⁺CD44⁺ and CD133^-CD44^- cells were obtained by the immunomagnetic bead separation. The expression level of miR-1231 in CD133⁺CD44⁺ cells was significantly lower than that in CD133^-CD44^- cells. miR-1231 suppressed CD133⁺CD44⁺ cell proliferation and invasion, but promoted the apoptosis in these cells. Western blot analysis showed that miR-1231-overexpressing CD133⁺CD44⁺ cells had obvious decreases in Ki67, Bcl-2, MMP-2 and MMP-9 protein expression and a significant increase in Bax protein expression compared with control cells. All these results further confirm that miR-1231 inhibits the proliferation and invasion but promotes the apoptosis in CD133⁺CD44⁺ cells. These findings suggest that miR-1231 can be a suppressor of CCSCs, which offers a novel potential therapeutic target for CCSCs and colon cancer.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Colonic Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, MicroRNAs, Transfection, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

阎立昆，李伟，姚建锋，毛智军. miR-1231对结肠癌干细胞增殖、凋亡和侵袭的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6746-6752.

Yan Li-kun, Li Wei, Yao Jian-feng, Mao Zhi-jun . Effect of miR-1231 on proliferation, apoptosis and invasion of colon cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6746-6752.

图/表（结果） 2

2.1 miR-1231在CD133⁺CD44⁺结肠癌干细胞中表达下调 利用免疫磁珠分选技术，从人结肠癌细胞株SW1116中分选获得CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-2种细胞，利用qRT-PCR检测miR-1231在这2种细胞中的表达水平，结果显示miR-1231在CD133⁺CD44⁺细胞的表达水平显著低于其在CD133^-CD44^-细胞的表达水平，见图1。

2.2 miR-1231抑制CD133⁺CD44⁺细胞增殖 与miR-1231模拟物对照相比，miR-1231模拟物显著提高了miR-1231的表达量(图2A)。MTT检测结果发现，转染miR-1231模拟物的CD133⁺CD44⁺细胞的增殖速度明显低于转染miRNA模拟物对照组(图2B)。此外，采用免疫印迹检测增殖相关蛋白Ki67在细胞中的表达水平，发现miR-1231高表达的CD133⁺CD44⁺细胞中Ki67蛋白的表达水平明显低于对照组(图2C)。上述这些结果表明高表达miR-1231抑制结肠癌干细胞增殖。

2.3 miR-1231促进CD133⁺CD44⁺细胞凋亡 流式细胞仪检测结果发现，转染miR-1231模拟物的CD133⁺CD44⁺细胞的凋亡率明显高于对照组(图3A)。免疫印迹结果显示，促凋亡蛋白Bax在转染miR-1231模拟物的CD133⁺CD44⁺细胞中的表达水平显著高于对照组，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则相反(图3B)。上述这些结果表明高表达miR-1231促进CD133⁺CD44⁺细胞凋亡。

2.4 miR-1231抑制CD133⁺CD44⁺细胞侵袭 Transwell小室实验结果显示，转染miR-1231模拟物的CD133⁺CD44⁺细胞的侵袭能力明显低于对照细胞(图4A)。免疫印迹结果显示，侵袭标志物MMP-2和MMP-9蛋白在转染miR-1231模拟物的CD133⁺CD44⁺细胞中的表达水平明显低于其在对照细胞中的表达水平(图4B)。上述这些结果表明高表达miR-1231抑制CD133⁺CD44⁺细胞侵袭。

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引言

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在西方国家位列恶性肿瘤致死因素的第2位，在中国位列第4位^[1]。据报道全球范围内每年约新发100万结肠癌患者，其中有50余万患者因之而死亡^[2]。早期结肠癌患者通过手术切除及辅助性放化疗，预后较好，但是中晚期患者5年生存率仅为20%左右，治疗效果不显著，其死亡的主要原因是肿瘤远处转移或复发^[3]。

肿瘤干细胞理论认为，肿瘤干细胞是肿瘤远处转移和复发的主要原因，它们具有无限增殖、自我更新、多系分化、耐药性、高度致瘤性等干细胞特性，是常规治疗后残存下来的肿瘤转移和复发的种子细胞^[4-5]。因此，如果能有效抑制肿瘤干细胞，将给肿瘤治疗带来突破性进展。事实上，目前已有很多学者致力于肿瘤干细胞的研究，希望通过抑制肿瘤干细胞来治疗癌症。Singh等^[6]报道CXCR1/2表达降低显著抑制乳腺癌干细胞的活性。Boumahdi等^[7]发现SOX2具有调控皮肤癌干细胞的功能。萝卜硫素被报道通过抑制声波刺猬信号通路进而抑制胰腺癌干细胞的自我更新^[8]。尹晓玲等^[9]报道白细胞介素12可能通过调节IL-4/STAT6通路降低结肠癌干细胞的自我更新及侵袭能力，促进其分化和凋亡。魏丽慧等^[10]报道了片仔癀能够抑制结肠癌细胞株HT-29和SW620细胞的增殖，并且能够减少这2种细胞株中干细胞的数量。

miRNA是一类长度为19-25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，能够通过与靶mRNA 3’端非翻译区(3’UTR)完全或不完全互补配对，使靶mRNA直接发生降解或者翻译受阻，从而在转录后水平负调控靶基因的表达^[11]。很多miRNAs已被报道调控结肠癌干细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程，例如miR-140-5p、miR-203、miR-21、miR-145、miR-93等^[12-15]。miR-1231作为一种新发现的miRNA，其在结肠癌干细胞中的表达水平显著低于非肿瘤干细胞中的表达水平，但是下调的miR-1231对结肠癌干细胞的影响却尚未有报道^[16]。

结肠癌干细胞表面会表达特定的抗原分子，例如CD44、CD133、CD24、CD66、CD166等，CD44和CD133是2个公认度比较高的细胞表面标志物^[17-19]。利用CD133和CD44联合免疫表型进行流式细胞分选或免疫磁珠分选，将CD133和CD44双阳性细胞即结肠癌干细胞(CD133⁺CD44⁺)和双阴性细胞(CD133^-CD44^-)分选出来。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是由多种细胞分泌的一种肽链内切酶家族，被认为在肿瘤的传播上起到了至关重要的作用。分泌明胶酶A的MMP-2和分泌明胶酶B的MMP-9能够降解细胞外基质和基底膜的主要成分Ⅳ型胶原，与肿瘤细胞模型的侵袭和转移潜能密切相关^[20]。MMP-2和MMP-9在肿瘤侵袭中的作用在多种癌症中已被广泛研究，尤其是在结肠癌、直肠癌、乳腺癌和肾癌中^[21-23]。

实验采用免疫磁珠分选技术从人体结肠癌细胞系SW1116中分离出CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-细胞，检测miR-1231在2种细胞的表达水平，通过脂质体转染构建过表达的miR-1231 CD133⁺CD44⁺干细胞，观察miR-1231对结肠癌干细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年11月至2015年10月在陕西省人民医院完成。

1.3 材料 结肠癌细胞系SW1116购自美国菌种保藏中心。RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素、链霉素、二甲基亚砜、甲醇、结晶紫、MTT(美国Sigma公司)；碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子(PeproTech，美国)；细胞培养箱(北京福意电器有限公司)；CD133、Ki67、Bax、Bcl-2、MMP-2、MPP-9和GAPDH兔抗人单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)；小鼠抗人CD44抗体IgG1(美国Bio-Legend公司)；TRITC标记的羊抗兔二抗，FITC标记的羊抗小鼠二抗(美国Southern Biotech公司)；0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA，小鼠抗人CD133磁珠、大鼠抗小鼠IgG1磁珠(德国Miltenyi公司)；Taqman MicroRNA反转录试剂盒，All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒，Lipofectamine 2000转染试剂盒，Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，总蛋白提取试剂盒(美国GeneCopoeia公司)；U6(上海诺伦生物医药技术有限公司)；紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；miR-1231模拟物，miRNA模拟物对照(西安沃尔森生物技术有限公司)；Matrigel基质胶(上海威奥生物科技有限公司)；倒置显微镜(郑州南北仪器设备有限公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 将液氮冻存的SW1116细胞于37 ℃水浴中复苏，培养在RPMI1640完全培养液中(含有体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素)，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养。待细胞生长至80%左右融合时，使用混合消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA)进行消化，然后离心(800 r/min，5 min)收集细胞，进行传代培养。磁珠分选后的细胞加入到干细胞培养基中(含10 μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L重组人表皮细胞生长因子的RPMI1640培养基)，置于体积分数为5% CO₂、37 ℃恒温条件培养。

1.4.2 CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-细胞的分选 将处于对数生长期的SW1116细胞进行消化重悬，然后用包被小鼠抗人CD133抗体的磁珠进行孵育，过分选柱分选获得CD133⁺和CD133^-细胞。再用小鼠抗人CD44抗体孵育收获CD133⁺和CD133^-细胞，之后用包被大鼠抗小鼠IgG1抗体的磁珠进行孵育，最后过分选柱分选获得CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-细胞。

1.4.3 实时反转录PCR检测miR-1231的表达 按照Trizol说明书提取CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^- 2种细胞的总RNA，紫外分光光度计测其浓度。然后严格依照Taqman MicroRNA反转录试剂盒说明执行反转录，合成cDNA，将cDNA加入到All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒，在实时PCR仪上进行定量，U6为内参，反应模式为预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s；退火60 ℃ 20 s；延伸 72 ℃ 15 s，共40个循环。采用2^-^??Ct方法分析miR-1231在2种细胞中的相对表达水平。

1.4.4 细胞转染 将CD133⁺CD44⁺细胞以3×10⁵/孔的密度接种于6孔培养板中。待细胞生长至60%左右融合时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书执行转染，每孔添加150 μL转染试剂混合物miR-1231模拟物(miR-1231 mimics)或miRNA模拟物对照(miR-control)，转染24 h后更换新鲜的干细胞培养液，48 h后收集细胞，供后续实验使用。利用qRT-PCR检测miR-1231模拟物转染CD133⁺CD44⁺细胞后的转染效率。

1.4.5 MTT检测细胞增殖 取转染miRNA模拟物对照和miR-1231模拟物的CD133⁺CD44⁺细胞，以2×10³/孔的密度接种到加有干细胞培养基的96孔板中，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃的恒温培养箱培养4 d。每天检测细胞活性，检测时每孔先加入10 μL (5 g/L)MTT溶液，于37 ℃继续孵育4 h，然后换液，去除原来的培养基和MTT，每孔加入150 μL二甲基亚砜，轻微振荡直至完全溶解MTT还原生成的紫色甲臜。采用酶标仪检测各孔在波长570 nm处的吸光度。

1.4.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取转染miR-1231模拟物和miRNA模拟物对照的CD133⁺CD44⁺细胞用于实验。实验按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，将2×10⁵个细胞加入到100 μL 1×Binding缓冲液中重悬，然后添加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料，充分混匀，暗处放置15 min进行染色，最后上流式细胞仪检测，计算凋亡细胞的数量。

1.4.7 Transwell小室检测细胞侵袭 取转染miR-1231模拟物和miRNA模拟物对照的CD133⁺CD44⁺细胞用于实验，在接种细胞前，将用无血清培养基按8︰1稀释的Matrigel基质胶加到小室的上室面，于37 ℃放置30 min水化基底膜，然后按照Transwell小室说明，将2种细胞加入到无血清RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，取200 μL细胞悬浮液加入上室，下室加500 μL 含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基作为趋化因子，然后将侵袭小室置于37 ℃、体积分数为5% CO₂细胞培养箱中培养 22 h。小心取出上室，用棉签擦去基质胶和上室内未侵袭的细胞，用冰预冷的甲醇进行固定，结晶紫染色，PBS清洗后风干，于倒置显微镜下进行观察，100倍视野下取9个视野计数移至微孔膜下层的细胞，取平均值进行统计学分析。

1.4.8 免疫印迹检测蛋白表达 采用总蛋白提取试剂盒提取转染miR-1231模拟物和miRNA模拟物对照的CD133⁺CD44⁺细胞的总蛋白，经10%SDS-PAGE电泳后，电转法转膜，将膜放置于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭2 h，加一抗兔抗人单克隆抗体(Ki67抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、MMP-2抗体或MMP-9抗体) 4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗3次，然后加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，TBST缓冲液洗3次，运用ECL化学发光法检测蛋白条带，GAPDH作为内参。

1.5 主要观察指标 ①miR-1231在CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-细胞中的表达水平；②miR-1231对CD133⁺CD44⁺细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 5软件进行分析。计量资料用x(_)±s表示，采用t 检验比较组间差异， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，近几年来，随着人民生活水平的提高及饮食习惯的改变，结肠癌的发病率呈明显上升趋势^[24]。随着手术水平的提高、辅助放化疗药物的进步以及多学科协作治疗的快速发展，近几年来结肠癌的预后和生存率均有明显改善，但远处转移和复发依然是结肠癌致死的最主要原因^[3]。因此，要从根本上提高结肠癌的治疗水平，就必须对其发生与发展机制进行深入研究。

近几年来，国内外越来越多的学者认同肿瘤干细胞理论，并对肿瘤干细胞进行大量的研究，进一步加深了人们对肿瘤发生与发展的认识。肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的很少一部分具有干细胞性质的细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力，是肿瘤发生与扩散的根源^[25-26]。目前已从多种实体瘤和血液系统肿瘤(如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、白血病、恶性胶质瘤等)中分离和筛选出各自的肿瘤干细胞，其性能也被充分研究，证实了肿瘤干细胞的存在和其理论的合理性和可信性^[27-33]。

miRNAs是近年来发现的一类具有基因调控功能的小RNA，对多种生物学过程具有重要的调控作用。越来越多的miRNAs被报道能够调控肿瘤干细胞的自我更新、增殖、多向分化与肿瘤形成等。对于miRNAs对结肠癌干细胞的作用，也有很多研究报道。例如miR-140-5p通过抑制Smad2的表达和自我吞噬从而抑制结肠癌干细胞的侵袭和转移，miR-203通过靶向Tcf4抑制结肠癌干细胞的生长，miR-21和miR-145合作调控结肠癌干细胞的生长，miR-93抑制结肠癌干细胞的生长和菌落形成^[12-15]。miR-1231是一个最近新发现的miRNA，被报道在多种肿瘤中低表达，抑制肿瘤的生长和转移，包括结肠癌^[34-36]。此外一个近期研究报道了miR-1231在结肠癌干细胞中的表达明显下调，但是其对于结肠癌干细胞的作用，目前尚无报道^[16]。实验主要探究miR-1231对结肠癌干细胞的作用。目前有多种方法用于筛选结肠癌干细胞，例如单一细胞表面分子筛选，2种或多种细胞表面分子筛选等^[37-38]。为了保证干细胞的纯度，采用2种细胞表面分子进行联合筛选。CD133为人体干细胞所公认的细胞表面分子，多数实验利用CD133来筛选结肠癌干细胞。CD44也被广泛报道用于多种肿瘤干细胞的筛选，包括结肠癌干细胞。因此，利用CD133和CD44这2个细胞表面分子作为筛选分子来筛选CD133和CD44双阳性细胞(CD133⁺CD44⁺)和双阴性细胞(CD133^-CD44^-)。通过qRT-PCR检测证实了miR-1231在结肠癌干细胞中的表达水平显著低于其在非肿瘤干细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建miR-1231高表达的结肠癌干细胞和对照细胞，研究miR-1231对结肠癌干细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，发现miR-1231能够抑制结肠癌干细胞增殖和侵袭，促进其凋亡。

综上所述，实验成功分选出结肠癌干细胞CD133⁺CD44⁺细胞，证实了miR-1231在结肠癌干细胞中表达下调，进一步发现miR-1231抑制结肠癌干细胞增殖和侵袭，促进其凋亡。这些发现揭示了miR-1231是结肠癌的一个抑制子，可作为治疗结肠癌的一个潜在靶点，但其作用机制还需进一步研究。