CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性探讨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (45): 6726-6732.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.006

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CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性探讨

张雅妮¹，于美娟²，冯善伟²，王淑辉²，李美山²，熊符²，张成²

1广州市妇女儿童医疗中心小儿神经科，广东省广州市 510623
2中山大学附属第一医院神经科，广东省广州市 510080

修回日期:2016-08-26 出版日期:2016-11-04 发布日期:2016-11-04
通讯作者: 张成，教授，中山大学附属第一医院神经科，广东省广州市 510080
作者简介:张雅妮，女，1977年生，山东省人，汉族，2006年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事神经系统遗传病方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30370510)；广东省科技计划项目(2011A030400006)

Effect of CM-Dil labeling on biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Ya-ni¹, Yu Mei-juan², Feng Shan-wei², Wang Shu-hui², Li Mei-shan², Xiong Fu², Zhang Cheng²

1Department of Pediatric Neurology, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China
2Department of Neurology, First Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2016-08-26 Online:2016-11-04 Published:2016-11-04
Contact: Zhang Cheng, Professor, Department of Neurology, First Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Zhang Ya-ni, M.D., Attending physician, Department of Pediatric Neurology, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30370510; the Scientific Research Plan of Guangdong Province, No. 2011A030400006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞标记：在多细胞系统中，为了追踪调查某特定细胞(群)的作用和行为，把作为对象的细胞(群)加以标记。
CM-Dil：氯甲基-1，1’-双十八烷基-3，3，3’，3’ -四甲基-吲哚-羰花青-高氯酸盐(Chloromethylbenzamido derivatives of 1，1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindo- carbocyanine perchlorate)是一种亲脂性荧光染料，易嵌入生物质膜内并在膜内作侧向扩散运动，从而标记整个细胞。无细胞毒性，不影响细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢，而且不会扩散到其它未标记细胞。在标记后不会影响其荧光，适合长期观察追踪。

摘要
背景：目前已有部分实验采用CM-Dil标记间充质干细胞开展体内外实验，取得良好成果。
目的：观察CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及其定向迁移能力。
方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，通过流式细胞技术分析其特异性细胞表面标记抗原(CD29，CD44，CD11b，CD45)的表达。用CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞，继续培养细胞，观察细胞的形态及增殖情况，及传代后荧光的强度与持久性。采用Transwell小室进行标记后大鼠骨髓间充质干细胞向mdx鼠腓肠肌匀浆液的迁移实验。
结果与结论：所培养细胞均一性好，均表达CD29和CD44，不表达CD11b和CD45，符合骨髓间充质干细胞的特点。经CM-Dil标记后对大鼠骨髓间充质干细胞的形态、增殖无明显影响，传代后仍可保持荧光强度，但随传代有所减弱。标记前后大鼠骨髓间充质干细胞的迁移能力无显著性差异(P > 0.05)。结果说明，CM-Dil标记过程安全、简单、高效，对大鼠骨髓间充质干细胞的形态、增殖及迁移能力无明显影响，体外细胞传代后仍可保持荧光，是大鼠骨髓间充质干细胞标记与示踪的理想试剂。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6404-6524(张雅妮)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 细胞标记, CM-Dil, 假肥大型肌营养不良, 大鼠, 骨髓, 间充质干细胞, 生物学特性, 迁移, mdx, Transwel, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Existing evidence has shown that CM-Dil-labeled mesenchymal stem cells have delivered better results in experiments in vivo and in vitro.
OBJECTIVE: To investigate the effect of in vitro CM-Dil labeling on biological characteristics and directed migration of rat bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from the bone marrow of Sprague-Dawley rats. The specific surface antigens, CD29, CD44, CD11b, CD45, were detected by flow cytometry. The rat bone marrow mesenchymal stem cells were labeled with CM-Dil, and then were cultured and passed continually. Thereafter the morphology and proliferation ability of labeled cells were assessed. The strength and duration of fluorescence after CM-Dil labeling were detected. Transwell chambers were used to investigate the migration ability of labeled cells towards the homogenate of the gastrocnemius muscles of mdx mice.
RESULTS AND CONCLUSION: The cultured cells were markedly positive for CD29 and CD44, but negative for CD11b and CD45, which were in accordance with the features of bone marrow mesenchymal stem cells. CM-Dil-labeled cells were not different from unlabeled cells in the aspect of morphology and proliferation. Fluorescence was still visible after passage; however, a reduction in fluorescent intensity was observed under an inverted fluorescent contrast phase microscope after labeling. The labeled cells showed no different migration ability from the unlabeled cells (P > 0.05). In conclusion, the procedure of CM-Dil labeling is safe, simple and effective. CM-Dil could be a good choice for labeling and tracing rat bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Bone Marrow, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张雅妮，于美娟，冯善伟，王淑辉，李美山，熊符，张成. CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性探讨[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6726-6732.

Zhang Ya-ni, Yu Mei-juan, Feng Shan-wei, Wang Shu-hui, Li Mei-shan, Xiong Fu, Zhang Cheng. Effect of CM-Dil labeling on biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6726-6732.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态与生长特点 以差速贴壁法原代培养的大鼠骨髓细胞，在刚分离接种时镜下可见大量密集悬浮细胞，接种后三四小时，细胞开始少量贴壁，在瓶底散在分布；8-12 h细胞约60%贴壁；24 h后约80%细胞贴壁，多呈扁平形、梭形或多角形，其中有大鼠骨髓间充质干细胞也有杂质细胞，悬浮细胞多呈圆形，大部分为造血干细胞和血细胞，生存寿命较短，两三次换液后可基本清除。3 d后细胞增殖明显，形态趋于纺锤状，5-7 d可见细胞集落，10-14 d细胞融合，多数呈均一典型的“纺锤状”成纤维样细胞形态；细胞间排列呈“旋涡状”、“辐射状”或“栅栏状”。刚传代的细胞呈圆形，6-8 h内又可贴壁、伸展重新成为梭形细胞；24 h后开始增殖，细胞集落增多；7-10 d后可传代，每传一代细胞数量可增加约2.5倍。P3代以上的大鼠骨髓间充质干细胞趋于纯化，细胞呈均质状，细胞增殖融合密集排列呈束，有一定方向性，呈集落形式生长。一般应用P5代作后续实验(图1)。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的检测结果 流式细胞检测显示，体外培养传代贴壁生长的P5代大鼠骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达95%以上。大鼠骨髓间充质干细胞表面CD11b和CD45检测阴性，而CD29和CD44表达阳性。

2.3 CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞后的形态观察及荧光强度追踪 在相差显微镜下观察5 μmol/L浓度标记P5代细胞后其形态与未标记细胞相比未见明显差异。荧光显微镜下以绿色荧光激发标记细胞后，可见胞浆均匀发出强烈的红色荧光，细胞核无荧光发出，经流式细胞仪检测标记率>98%。体外传代至P6，P7代仍可检测到红色荧光，但随着体外传代荧光强度出现一定程度减弱(图2)。

2.4 标记后大鼠骨髓间充质干细胞的细胞生长曲线 经CM-Dil标记与未经标记的P3代细胞生长曲线大致相似，在培养1 d时细胞量稍有减少，为细胞适应期，3 d后细胞数迅速增长，至第8天进入平台期，细胞增殖减慢(图3)。

2.5 体外Transwell细胞迁移能力 CM-Dil标记后的P5代大鼠骨髓间充质干细胞[(407±20)个/视野]向mdx鼠腓肠肌匀浆液的迁移能力与未标记细胞[(417±27)个/视野]相比差异无显著性意义(P > 0.05)，标记细胞向mdx鼠腓肠肌匀浆液的迁移能力[(407±20)个/视野]显著高于其向空白液迁移能力[(378±16)个/视野，P < 0.01]。

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引言

间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能等特性，加之取材方便、来源丰富、易培养、分化能力强等优点已成为干细胞研究的重要种子细胞之一^[1-3]。在进行体内实验时，如何实现安全、有效、方便的标记细胞，又可长期追踪细胞在体内的存活、生长和分化过程，已成为亟待解决的问题。间充质干细胞的标记方法众多，包括Y染色体标记、报告基因转染、BrdU标记、活染料染色如Dil，DAPI，Hoechst等^[4-7]，不同方法各有优缺点。其中，1，1’-双十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(1,1’-dioctadecyl-1 -3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，Dil)是一种亲脂性碳花青荧光染料，易嵌入生物质膜并在膜内作侧向扩散运动^[8]，从而标记整个细胞膜，还可以通过活体细胞的胞饮作用进入胞浆，标记整个细胞浆。多项研究显示该染料具有无毒、快捷、有效的标记能力，而且其荧光性可在宿主体内存留数月之久，便于移植后的追踪研究^[9-10]。CM-Dil是进一步改良的Dil产品，加强了水溶性，并在固定、破膜以及石蜡包埋后仍可保持荧光^[7]。目前已有部分实验采用CM-Dil标记间充质干细胞开展体内外研究，取得良好成果，但作者尚未检索到关于标记后细胞迁移能力的研究，或标记后间充质干细胞向DMD模型-mdx鼠骨骼肌迁移能力的报道。

实验采用CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞，通过体外实验进一步了解该染料对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响，包括向mdx鼠骨骼肌的迁移能力的影响，希望为后续体内实验摸索理想条件奠定基础。

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2004年7月至2006年4月在中山大学附属第一医院神经病学实验室完成。

1.3 材料 原代纯合子mdx配种鼠(C57BL/10ScSn- DMDmdx)，购于美国Jackson实验室。实验所用mdx鼠为原代配种所生的纯合子mdx鼠，种鼠和实验用鼠均饲养于中山大学中山医学院实验动物中心Ⅱ级动物室。正常三四周龄的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(体质量60-80 g)及C57鼠购于上述动物室，实验过程中对动物的处置遵守1988年国家科委《实验动物管理条例》的规定，先予体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉后引颈处死。其中SD大鼠10只用于大鼠骨髓间充质干细胞培养，8周龄雌性mdx鼠3只用于制备骨骼肌匀浆液，8周龄雌性C57鼠3只用于制备空白液。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 参考文献[11]的方法，将三四周龄60-80 g的SD大鼠用体积分数10%水合氯醛麻醉后引颈法处死，于体积分数75%乙醇中浸泡消毒1 min，在超净工作台(SW-CJ-IF，苏州净化设备厂)无菌条件下取出后肢股骨、胫骨骨髓，置入完全培养液中，制成细胞悬液，离心后去除上清液，用胎牛血清(浙江杭州四季青生物制品公司)终体积分数为10%的DMEM低糖完全培养液将细胞浓度调整至1×10⁹ L^-¹，接种于25 cm²的塑料培养瓶(美国Corning公司)中，略旋松瓶口，放入37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内静置培养。每隔三四天全量换液1次，当原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞贴壁生长增殖至接近90%融合时，去除培养液，PBS洗涤2次，体积分数0.25%胰酶37 ℃消化、传代，每隔三四天换液1次。此时得到第1代细胞(P1)，当细胞生长至90%融合时，用上述方法再传代，使细胞不断纯化和扩增。用胰酶消化P5代细胞，PBS洗涤3次，大鼠骨髓间充质干细胞加入饱和浓度FITC荧光标记的小鼠抗大鼠CD11b-FITC，CD29-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC(美国Santa-Cruz公司)，室温下避光孵育30-45 min，再以PBS清洗去除未结合抗体，10 g/L多聚甲醛固定15 min，流式细胞仪(FCM，Beckman，CA，USA)检测细胞表面抗原表达。

1.4.2 CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞 取生长良好的P5代细胞用体积分数0.25%胰酶消化，PBS重悬，调整细胞浓度为1.0×10⁹ L^-¹，按照试剂说明，以终浓度为5 μmol/L标记细胞。将相应量的CM-Dil(美国Molecular Probes公司)与细胞悬液混匀后先于37 ℃孵育5 min，然后4 ℃孵育15 min，用PBS洗涤、离心，重复2次后待用。将标记好的大鼠骨髓间充质干细胞通过流式细胞仪检测标记率，CM-Dil的吸收波长为553 nm(绿色荧光)，发射波长为570 nm(红色荧光)。相差显微镜下观察标记后细胞生长情况，并连续传代通过荧光显微镜(日本Olympus公司)观察细胞荧光的保持情况。

1.4.3 CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞后的生长曲线测定 取生长良好的P3代细胞用体积分数0.25%胰酶消化，PBS重悬，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，设两组分别为CM-Dil标记组与非标记组，每组分别接种于2个24孔板，每孔接种0.5 mL，置于CO₂培养箱，每天随机选取3个培养孔，胰酶消化，用血球计数板计算每孔细胞数，取均值，连续观察10 d。未计数细胞每隔3 d换液1次。以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

1.4.4 CM-Dil标记后的大鼠骨髓间充质干细胞体外Transwell细胞迁移实验 取生长状况良好的P5细胞消化，并用无血清L-DMEM洗涤重悬，用CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞，终浓度为5 μmol/L，调整细胞浓度为2.4×10⁹ L^-¹。

取3只8周龄mdx鼠的腓肠肌，每只取等量肌组织相混合，浸泡于无血清的冷L-DMEM中(质量浓度150 g/L)，无菌条件下匀浆，匀浆液用考马斯亮蓝方法测定蛋白浓度后用L-DMEM调整匀浆液到一致浓度待用。C57鼠腓肠肌匀浆液取材制作方法同上。

共设标记细胞向匀浆液、未标记细胞向匀浆液、标记细胞向空白液的迁移3组实验。将特制的48孔Transwell培养板的中间膜用无血清的L-DMEM预处理 6 h，吸去处理液，将调整好浓度的各种匀浆液加到培养板下腔，每孔0.6 mL(每份标本重复3孔，另设仅注有等量无血清L-DMEM的空白孔3孔)，放好小室，向上腔内加入0.1 mL的细胞悬液。将Transwell培养板(美国Corning公司)置入细胞培养箱，孵育5 h后将迁移小室取出，25 g/L多聚甲醛室温固定15 min后用棉签小心除掉膜上层的细胞，用体积分数0.5%Triton X-100常温孵育膜3 min，进行苏木精染色，凉干后将膜取下，中性树胶封固，200×倒置相差显微镜下观察，每张膜随机选取10个视野计数细胞，每个处理组共选取30个视野，通过计数迁移到膜下的细胞数衡量匀浆液的趋化能力以及细胞的迁移能力。

1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓间充质干细胞的形态与生长特点；②CM-Dil标记后大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及荧光强度追踪；③标记后细胞的迁移能力。

1.6 统计学分析 计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学处理，每组数据采用单样本K-S检验方法检验其正态分布性，两组间数据比较采用t检验分析，P < 0.05时差异有显著性意义。

讨论

目前有多种间充质干细胞标记方法，包括Y染色体标记、报告基因转染、BrdU标记、活染料染色如DAPI及Hoechst等，每种标记方法各有利弊^[12-13]。例如，GFP标记是目前最广为接受的标记方法，其稳定性强，安全性高，但标记率相对低，植入受体后荧光强度会有所衰减，某些脏器如海马自身即可发出绿色荧光，易导致假阳性^[14]。BrdU标记细胞后可能被转移至宿主细胞导致假阳性，而且后期标本需变性处理，导致抗原破坏，使免疫组化等实验难以完成；且BrdU荧光持久性较差，不适合体内实验的长期追踪^[15]。活染料如DAPI及Hoechst等，易侵染宿主细胞，不适合体内实验。染色体标记法操作复杂。Dil是一种亲脂性荧光染料，无细胞毒性，不影响细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢。有研究在动物体内植入Dil标记的间充质干细胞，分别在3，6个月检测到了荧光信号^[9-10]。实验使用的CM-Dil是进一步改良的Dil衍生物，在其基础上导入硫醇氯甲基基团，从而得以在醛类物质中保持稳定，加强了水溶性，标记后进行固定、破膜以及石蜡包埋等操作不会影响其荧光，更适合长期的观察追踪。CM-Dil可用于标记原代或传代细胞，在553 nm的激发光下发出红色荧光，可直接在荧光显微镜下观察，已被广泛用于各种细胞的标记，包括生殖干细胞、神经干细胞、内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞等^[16-22]。通常认为CM-Dil不会扩散到未标记细胞，但也有人提出标记后的移植细胞可将部分染料传递给宿主细胞^[23]，Dil的浓度过高时，具有一定的细胞毒性，所产生的死细胞碎片可能被宿主细胞吸收。实验采用CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞，操作流程简单易行，标记率>98%，对细胞影响小，荧光保持较持久。标记后细胞的形态、生长、增殖情况良好，与对照组相比无明显差异，说明CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞便捷、安全。标记后的P5代细胞在体外连传2代后，仍可发出荧光，但荧光的强度有所减弱，这与陈朝等^[24]的研究结果类似，他们发现CM-Dil 标记24 h的骨髓间充质干细胞标记率为100%，21 d后经传代培养的骨髓间充质干细胞荧光强度与24 h时点相近，但30 d后荧光有所淬灭。标记后细胞的生长、增殖特性未受影响，形态无改变。李朝中等^[25]报道，标记后的细胞体外连续传代仍可保持较强荧光，并无明显衰减，该研究将CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞植入心梗大鼠心肌，4周后在倒置荧光显微镜下观察心肌组织冰冻切片，可见标记细胞。另有研究用CM-Dil标记P5代人脐带血间充质干细胞，体外连续传8代后，荧光才基本消失^[26]。而Ji等^[27]发现通过流式细胞仪检测经CM-Dil标记的P1代人脐带血间充质干细胞荧光标记率达到(95.0±12.2)%，传代至P5代降为(9.9±5.0)%。作者认为，细胞传代后荧光衰减的速度差异可能与细胞培养方法等因素有一定关系，这值得今后进一步加以研究。实验不足之处在于，未进行CM-Dil标记后大鼠骨髓间充质干细胞的定向分化实验，但以往多项研究显示，标记后间充质干细胞仍可保持多向分化能力^[27]。Transwell是国际上通用的体外研究细胞迁移性等功能的特制培养板，通过体外Transwell定向迁移实验，实验发现经CM-Dil标记的大鼠骨髓间充质干细胞向mdx鼠腓肠肌匀浆液的迁移能力显著高于向空白液的迁移能力，这提示细胞对匀浆液具有一定的定向迁移能力。多项研究发现间充质干细胞具有向病灶的定向迁移性，这种迁移运动的机制可能与病灶环境释放的细胞因子有关^[28-43]，实验的后续研究也有类似发现(尚未发表)。实验发现CM-Dil标记对大鼠骨髓间充质干细胞向mdx鼠腓肠肌匀浆液的迁移能力未造成明显影响，而经检索暂未发现此类研究，该实验结果为未来研究提供了重要的理论依据。

CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性探讨

Effect of CM-Dil labeling on biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells

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