骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的优选浓度

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的因素：主要有化学、生物、物理三大因素。化学因素主要指常规诱导剂；生物因素指各种生长因子，如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、核心结合因子α1 等；物理因素有脉冲电磁场等，应用相对较少。
骨形态发生蛋白2：骨形态发生蛋白能够调控细胞的增殖、存活、分化以及凋亡等，其最主要的功能是促进骨骼和软骨的生成。骨形态发生蛋白2是具有特殊生物学活性的细胞因子，能诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化并抑制骨髓脂肪形成，促进骨形成并表达分泌特异性成骨细胞产物，在间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中具有重要的调控作用，可能是间充质干细胞向脂肪细胞发育的关键调控因子。但骨形态发生蛋白促使间充质干细胞向脂肪细胞的诱导分化作用根据细胞所处阶段及骨形态发生蛋白剂量的不同而有所差异，高浓度骨形态发生蛋白2可能会抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。

摘要
背景：骨形态发生蛋白2既可以促进成骨，在不同浓度范围又可以调控骨髓间充质干细胞成脂分化的趋势。因此，骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞后，如果能够发现抑制其成脂的浓度范围，对于防治骨质疏松症具有重要意义。
目的：确定骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的优选浓度。
方法：①抽取大鼠股骨及胫骨的骨髓，体外用贴壁培养法获得原代骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测第2代细胞表面抗原标志物；②取第2及3代细胞，分为0.5，5，50，100，200 μg/L骨形态发生蛋白2组及对照组。0.5，5，50，100，200 μg/L骨形态发生蛋白2组骨髓间充质干细胞用成脂诱导液诱导3 d后，加入0.5，5，50，100，200 μg/L骨形态发生蛋白2继续诱导14 d；对照组骨髓间充质干细胞成脂分化3 d，使用骨髓间充质干细胞培养基培养，未加骨形态发生蛋白2处理。
结果与结论：①流式细胞仪鉴定培养的细胞为骨髓间充质干细胞；②油红O染色显示，5-50 μg/L骨形态发生蛋白2诱导后，随骨形态发生蛋白2质量浓度的增加，脂滴数量增加；而100-200 μg/L骨形态发生蛋白2诱导17 d后，随骨形态发生蛋白2质量浓度的增加，脂滴数量减少。说明100 μg/L骨形态发生蛋白2可以抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，从而减少大鼠脂肪细胞的形成，可以作为抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的优选浓度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8056-9824(陈明)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨形态发生蛋白2, 骨髓间充质干细胞, 骨质疏松, 细胞诱导, 成脂分化, 生物学特性

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 cannot only promote osteogenesis, but also at different concentration ranges regulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes. Therefore, it is very important for the prevention and treatment of osteoporosis, if the range of concentrations of bone morphogenetic protein 2 can be found to regulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes, after the induction of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To determine the optimal concentration of bone morphogenetic protein 2 to inhibit the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes.
METHODS: Bone marrow samples were obtained from the femur and tibia of rats. Primary cultured bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by adherent culture method in vitro. Flow cytometry was used to identify the surface antigens of passage 2 bone marrow mesenchymal stem cells. Cells at passages 2 and 3 were taken and cultured in adipogenic induction medium for 3 days followed by the addition of 0.5, 5, 50, 100, 200 μg/L bone morphogenetic protein 2, or culture medium of bone marrow mesenchymal stem cells (control group), respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells cultured were identified by the flow cytometry. Oil red O staining results showed that the increasing number of lipid droplets was shown in bone marrow mesenchymal stem cells induced by bone morphogenetic protein 2 under the increasing concentration of 0.5 to 50 μg/L; while the number of lipid droplets in bone marrow mesenchymal stem cells decreased after 17 days of induction with bone morphogenetic protein 2 under the concentration of 100 to 200 μg/L. These findings indicate that 100 μg/L bone morphogenetic protein 2 can inhibit adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cell, so as to reduce the formation of adipocytes in rats. Therefore, 100 μg/L bone morphogenetic protein 2 is better to inhibit adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Adipogenesis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈明，张涛，刘俊，李志云，闵燕. 骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的优选浓度[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6720-6725.

Chen Ming, Zhang Tao, Liu Jun, Li Zhi-yun, Min Yan. Optimal concentration of bone morphogenetic protein 2 used to inhibit adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6720-6725.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] López García-Franco A. Osteoporosis: How, when and how far. Aten Primaria. 2016;48(4):215-216.
[2] 王思成,杨雪骅,苏佳灿,等.抗骨质疏松药物临床应用的进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(46): 9163-9166.
[3] Farahmand P, Spiegel R, Ringe JD. Male osteoporosis. Z Rheumatol. 2016;75(5):459-465.
[4] Kaur U, Chakrabarti SS, Gambhir IS. Zoledronate Induced Hypocalcemia and Hypophosphatemia in Osteoporosis: A Cause of Concern. Curr Drug Saf. 2016;11(3):267-269.
[5] 刘异香.糖尿病骨质疏松的健康干预[J].中国实用医药, 2009,4(14):50-51.
[6] 陈明,喻恒锋,韩智敏,等.体位复位?围手术期鲑鱼降钙素及延期经皮椎体后凸成形术治疗骨质疏松性腰椎爆裂骨折[J].中国骨质疏松杂志,2013,19(10):1059-1068.
[7] 党莉.综合治疗骨质疏松椎体压缩性骨折腰背痛的疗效观察和护理[J].护士进修杂志,2011,26(7):664-665.
[8] 李鹏,龙洁,汤炜,等.bFGF和BMP-2联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响[J].现代生物医学进展,2008,8(6):1011-1015.
[9] Crisan M, Solaimani Kartalaei P, Neagu A, et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 2016;6(3): 383-395.
[10] 邓云贞,李珏丹,魏虹,等.BMP-2促进人炎症牙髓干细胞骨向诱导分化的体外研究[J].口腔生物医学,2015,6(2): 71-77.
[11] 章军辉,陈永强,汤亭亭,等.透明质酸复合BMP-2转染骨髓间充质干细胞修复兔桡骨干骨缺损[J].中华骨科杂志, 2005,25(10):37-41.
[12] 孙欣,曾荣,郭伟韬,等.BMP-2和p38MAPK在小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用[J].广东医学院学报,2012,30(1):1-4.
[13] 周诺,麦华明,梁飞新,等.BMP-2?bFGF在牵引成骨中的表达及意义[J].口腔医学研究,2004,20(5):465-468.
[14] Zhang Z, Yang M, Wang Y, et al. Autophagy regulates the apoptosis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells under hypoxic condition via AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin pathway. Cell Biol Int. 2016;40(6):671-685.
[15] 苗忠澄,高航.BMP-2预诱导骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠再灌注后心肌梗死的实验研究[J].解放军医学杂志, 2014,39(8):601-608.
[16] Bandara N, Gurusinghe S, Chen H, et al. Minicircle DNA-mediated endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances angiogenic responses of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 2016;7:48.
[17] 陆斌,汤亭亭,岳冰,等.BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞修复羊股骨头坏死的生物力学研究[J].医用生物力学, 2005,20(2):71-75.
[18] 张雁儒,马辉,张辉,等. BMP-2转染BMSCs修复兔股骨头坏死模型的实验研究[J].中国临床解剖学杂志,2013, 31(4):447-452.
[19] Wang M, Zhang X, Xiong XI, et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Reverse Liver Damage in a Carbon Tetrachloride-induced Mouse Model of Chronic Liver Injury. In Vivo. 2016;30(3):187-193.
[20] Nakano M, Nagaishi K, Konari N, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve diabetes-induced cognitive impairment by exosome transfer into damaged neurons and astrocytes. Sci Rep. 2016;6:24805.
[21] Zhang LT, Fang XQ, Chen QF, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit the proliferation of hepatic stellate cells by inhibiting the transforming growth factor β pathway. Mol Med Rep. 2015;12(5):7227-7232.
[22] Zhou J, Jiang L, Long X, et al. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit gastric aspiration lung injury and inflammation in rats. J Cell Mol Med. 2016; 20(9):1706-1717. [23] Beaudoin C, Jean S, Bessette L, et al. Denosumab compared to other treatments to prevent or treat osteoporosis in individuals at risk of fracture: a systematic review and meta-analysis. Osteoporos Int. 2016;27(9):2835-2844.
[24] Zheng S, Yang J, Tang Y, et al. Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the serum and liver HMGB1 expression in rats with acute liver failure. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(12):15985-15992.
[25] Lang H, Dai C. Effects of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells on Plasminogen Activator Inhibitor-1 and Renal Fibrosis in Rats with Diabetic Nephropathy. Arch Med Res. 2016;47(2):71-77.
[26] Lin GH, Lim G, Chan HL, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein 2 outcomes for maxillary sinus floor augmentation: a systematic review and meta-analysis. Clin Oral Implants Res. 2016;27(11): 1349-1359.
[27] Kim JS, Cha JK, Lee JS, et al. Increased osteoinductivity and mineralization by minimal concentration of bone morphogenetic protein-2 loaded onto biphasic calcium phosphate in a rabbit sinus. J Periodontal Implant Sci. 2016;46(5):350-359.
[28] Goto F, Kakinuma S, Miyoshi M, et al. Bone morphogenetic protein-4 modulates proliferation and terminal differentiation of fetal hepatic stem/progenitor cells. Hepatol Res. 2016. in press.
[29] Allison SE, Chen Y, Petrovic N, et al. Activation of the pro-migratory bone morphogenetic protein receptor 1B gene in human MDA-MB-468 triple-negative breast cancer cells that over-express CYP2J2. Int J Biochem Cell Biol. 2016;80:173-178.
[30] Qian C, Zhu C, Yu W, et al. Bone morphogenetic protein 2 promotes osteogenesis of bone marrow stromal cells in type 2 diabetic rats via the Wnt signaling pathway. Int J Biochem Cell Biol. 2016;80: 143-153.
[31] Tellier LE, Miller T, McDevitt TC, et al. Hydrolysis and Sulfation Pattern Effects on Release of Bioactive Bone Morphogenetic Protein-2 from Heparin-Based Microparticles. J Mater Chem B Mater Biol Med. 2015; 3(40):8001-8009.
[32] Stiel N, Hissnauer TN, Rupprecht M, et al. Evaluation of complications associated with off-label use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in pediatric orthopaedics. J Mater Sci Mater Med. 2016;27(12):184.
[33] Merino D, Villar AV, García R, et al. BMP-7 attenuates left ventricular remodelling under pressure overload and facilitates reverse remodelling and functional recovery. Cardiovasc Res. 2016;110(3):331-345.
[34] Kim S, Choe S, Lee DK. BMP-9 enhances fibroblast growth factor 21 expression and suppresses obesity. Biochim Biophys Acta. 2016;1862(7):1237-1246.
[35] Villar AV, García R, Llano M, et al. BAMBI (BMP and activin membrane-bound inhibitor) protects the murine heart from pressure-overload biomechanical stress by restraining TGF-β signaling. Biochim Biophys Acta. 2013;1832(2):323-335.
[36] Wang S, Sun A, Li L, Zhao G, et al. Up-regulation of BMP-2 antagonizes TGF-β1/ROCK-enhanced cardiac fibrotic signalling through activation of Smurf1/Smad6 complex. J Cell Mol Med. 2012;16(10):2301-2310.
[37] Kaipel M, Schützenberger S, Hofmann AT, et al. Evaluation of fibrin-based gene-activated matrices for BMP2/7 plasmid codelivery in a rat nonunion model. Int Orthop. 2014;38(12):2607-2613.

引言

骨质疏松病理机制与激素、营养、运动及免疫因素等均有关^[1]。研究发现骨质疏松患者的骨骼成分正常，但单位体积中骨矿含量减少，往往以其他物质取代，大多数是脂肪^[2]。由于骨质疏松患者骨密度下降^[3]，单位体积内骨组织量减少^[4]，并且海绵骨小梁数量和体积均减低^[5]，导致骨腔变大，承受负荷有限，脆性增大，患者症状以疼痛为主，负重部位容易继发畸形甚至骨折^[6]，且其导致的骨折致残率极高^[7]。因此目前骨质疏松的治疗方法主要是增加骨量。

骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族的成员之一^[8]，在调控细胞的增殖、存活、分化以及凋亡等方面具有重要作用^[9]。

骨形态发生蛋白2信号通路参与成骨细胞分化和骨细胞细胞外基质合成与分泌、促进骨形成、增加骨量也已经得到大量基础及临床研究证实^[10-11]。骨形态发生蛋白2可以促进骨髓间充质干细胞分化，并且该过程与p38MAPK通路具有相关性，进一步证实了p38MAPK通路在成骨分化过程中具有重要的作用^[12]。骨形态发生蛋白2在成肌方面未见报道。

其中骨形态发生蛋白2能诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化并抑制脂肪形成^[13]，促进骨形成，并能表达特异性产物，如Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨钙蛋白等^[14]。同时骨形态发生蛋白2在间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中也具有重要的调控作用^[15]，但具体机制尚不清楚。

骨形态发生蛋白促间充质干细胞成脂分化与剂量有关，且高浓度的骨形态发生蛋白会抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化^[16]。

骨髓间充质干细胞可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肝细胞等^[17]，且易于获取，移植排斥反应较弱^[18]。

因此作者拟将大鼠股骨和胫骨中提取的骨髓间充质干细胞为研究对象，确定骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的最优浓度，为采用骨形态发生蛋白2防治骨质疏松症提供实验依据。

材料方法

1.1 设计 随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年6月至2016年3月在南昌大学第一附属医院实验中心完成。

1.3 材料 清洁级雌性10周龄SD大鼠10只，体质量250-300 g，购自南昌大学医学院实验动物科学部，许可证号：江西医动证字第02196-02。实验取得南昌大学第一附属医院伦理委员会的同意。

主要试剂和仪器：重组人骨形态发生蛋白2、骨髓间质干细胞完全培养基、PBS、Trypsin-EDTA、间质干细胞成脂诱导分化完全培养基、油红O染色液、茜素红染液、蛋白浓度测定试剂盒购自Cyagen公司；多聚甲醛购自碧云天公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司公司；倒置显微镜购自OLYMPUS公司；倒置相差显微镜购自北京奥特伟业光学仪器有限公司公司；离心机、冷冻离心机购自EPPENDORF公司；酶标仪购自Bio-rad公司；二氧化碳孵箱购自Nuaire公司；CO₂培养箱购自上海力康医疗设备有限公司；细胞瓶购自美国Wheaton celstir公司；细胞培养板购自广州赛业生物科技有限公司；冻存管购自北京优尼康生物科技有限公司；37 ℃恒温水浴箱购自上海实贝仪器设备厂；液氮罐购自杭州富阳全通空分设备制造有限公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离及培养 抽取大鼠股骨及胫骨骨髓0.4 mL，加入9.6 mL的骨髓间充质干细胞完全培养基培养液，充分混匀，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养。平均接种于培养瓶中培养48 h，观察骨髓间充质干细胞生长状态。

将间充质干细胞完全培养基、1×PBS、0.25%于Trysin-0.04%EDTA溶液预热至细胞所需最适温度。去培养基，PBS洗涤，适量Trypsin–EDTA溶液消化。吸管轻轻吹打，1 000 r/min 室温离心4 min，去上清。用间充质干细胞的完全培养液重悬细胞。按照22 000个细胞/cm²的密度接种。加入足量间充质干细胞的完全培养液，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养。流式细胞仪鉴定。

1.4.2 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的纯度 取第2代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，Trypsin–EDTA溶液充分消化，反复吹打使细胞悬浮， 1 000 r/min 室温离心4 min，去上清液，完全培养液重悬，于单细胞悬液中各加入CD44、CD105、HLA-ABC、CD34、CD45抗体及其同型对照充分吹打混匀。37 ℃避光孵育，测试前加PBS，流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度。

1.4.3 骨髓间充质干细胞分组及干预 取第2及3代骨髓间充质干细胞，接种密度为10 000个细胞/cm²。将细胞分为0.5，5，50，100，200 μg/L骨形态发生蛋白2组及对照组。0.5，5，50，100，200 μg/L骨形态发生蛋白2组骨髓间充质干细胞用成脂诱导液诱导3 d后，加入0.5，5，50，100，200 μg/L骨形态发生蛋白2继续诱导14 d；对照组骨髓间充质干细胞成脂分化3 d，使用骨髓间充质干细胞培养基培养，未加骨形态发生蛋白2处理。

1.4.4 油红O染色 诱导后17 d后，吸去细胞培养液，PBS洗3次，甲醛室温固定1 h，蒸馏水洗3次，油红O染色，显微镜观察。以标准曲线定量油红O测定结果。

1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞成脂分化结果。

1.6 统计学分析 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件(SPSS公司)分析，结果以x(_)±s表示，使用配对t 检验来分析组间差异，P < 0.05 为差异有显著性意义。

讨论

目前，骨髓间充质干细胞的体外分离方法已较为成熟，主要方法包括贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分选法等^[19]。密度梯度是离心分层获得骨髓间充质干细胞层的细胞悬液，去除其余层次的成分，这种方法要求相对严格，外来干扰因素多，误差大，所以更要严谨细致操作^[20]。而流式细胞术和免疫磁珠是通过分选法获得，此两种方法是依据细胞表面的特异性标志来获得所要的干细胞，但是目前骨髓间充质干细胞表面标志物缺乏特异性，而且此法会损伤大量细胞，所以在实际实验中很少应用^[21]。贴壁法应用范围广泛，是依据其贴壁生长的特性，容易分离出来。由于贴壁法获得细胞损伤较小，数量大，且获得的细胞干性好，操作简单易行^[22]，来源也广泛，所以综合以上，实验采用细胞贴壁培养法。

所获得的贴壁细胞需进一步鉴别，通过观察细胞形态及生长特征来区分，但此种方法过于主观，可信度较低。免疫学研究显示骨髓间充质干细胞表面表达CD105、CD44、HLA-ABC等，不表达 CD45、HLA-DR等^[23]；所以可以通过鉴定细胞表面标记物来分析骨髓间充质干细胞的纯度。作者采用流式细胞仪检测细胞表面抗原结果显示，获得的骨髓间充质干细胞中杂质细胞较少，纯度较高。

骨形态发生蛋白是具有多功能性及高度保守的蛋白^[24-32]，能够参与多种物质代谢，在骨髓间充质干细胞的分化过程扮演着重要的角色^[33-36]。前期研究结果显示，单独用骨形态发生蛋白2来诱导，实验难以得到脂肪蛋白及其基因的表达^[37]，因此实验预先使用成脂诱导液诱导3 d，继而以骨形态发生蛋白2诱导14 d，油红O染色结果显示，骨形态发生蛋白2浓度为0.5-50 μg/L时具有促进成脂分化的能力，而浓度为100-200 μg/L时具有抑制脂肪分化的能力。但骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的具体信号机制目前还不清楚，推测可能骨形态发生蛋白2基因的单核苷酸多态性位点与脂肪的形成有关，较高浓度骨形态发生蛋白2可以使单核苷酸多态性位点关闭，脂肪细胞标记基因C/EBPα表达量下降。

实验尚存在一定的不足之处，比如抑制成脂后可以导致脂肪细胞减少，相应的成骨细胞数量如何变化，需进一步实验探索。下一步的实验还将检测相关成脂标记基因的表达变化，来探讨骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的相关信号机制。