不同时期局部移植人脐带间充质干细胞修复脊髓损伤的组织学观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
白细胞介素：最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，与血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。目前已发现38种白细胞介素。
Allen’s打击法建立脊髓损伤模型：由Allen创建的重物坠落致脊髓损伤的方法。即用一定质量的重锤沿一套管垂直落下、精确打击特定脊髓节段而致伤。这种模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律，对研究脊髓损伤后神经元、神经胶质细胞的病理变化、再生规律和相互作用，探索神经保护策略有很大帮助。

摘要
背景：脊髓损伤能造成各种运动、感觉功能障碍，肌张力异常及病理反射等，临床上已通过人脐带间充质干细胞移植对脊髓损伤进行治疗。
目的：探讨大鼠脊髓损伤后不同时期局部移植人脐带间充质干细胞修复脊髓损伤的效果。
方法：选取SPF级雄性成年SD大鼠100只，随机分为5组：空白对照组、单纯脊髓损伤组及3，7，21 d后移植组，各20只。后4组利用Allen’s 打击器制作大鼠T₁₀脊髓损伤模型；3，7，21 d后移植组大鼠分别于脊髓损伤后3，7和21 d在损伤部位周围移植人脐带间充质干细胞。
结果与结论：与单纯脊髓损伤组相比，3，7，21 d后移植组大鼠造模后49 d运动功能评分增加，血清白细胞介素2水平减少，血清白细胞介素10水平增加，脊髓病理损伤明显改善，且7 d后移植组效果最为明显。说明人脐带间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤，改善大鼠运动功能，且在大鼠脊髓损伤7 d后移植效果最佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6849-4823(陈胜)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 脊髓损伤, 人脐带间充质干细胞, 干细胞移植, 损伤修复, 治疗效果, 感觉功能障碍, 病理反射

Abstract:

BACKGROUND: Spinal cord injury (SCI) is a disease causing a variety of motor and sensory dysfunctions, abnormal muscle tone and pathological reflex. Clinically, human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation has become an employed therapy for SCI.
OBJECTIVE: To investigate the effect of local transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells in different time after spinal cord injury in rats.
METHODS: 100 SPF male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: blank control group, SCI group, post-SCI 3-, 7-, 21-day transplantation groups (n=20 per group). Animal models of T₁₀ SCI were made by Allen’s method in the latter four groups, and rats in the three transplantation groups were given HUCMSCs transplantation at 3, 7, 21 days after SCI, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the SCI group, improved motor function scores, decreased interleukin-2 level, and increased serum interleukin-10 level were observed in the three transplantation groups at 49 days after modeling, indicating SCI was improved significantly in the three transplantation groups, especially in the post-SCI 7-day transplantation group. These findings suggest that human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for SCI repair improves the movement function of rats, and cell transplantation at 7 days after modeling has achieved best outcomes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Interleukins, Spinal Cord Injuries, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3至10月在南京医科大学完成。

1.3 材料 SPF级雄性SD大鼠100只，鼠龄85-110 d，体质量175-260 g，由南京医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SYXK(苏)2013-0015。所有大鼠饲养温度在(20±2) ℃，12 h黑暗和照明光线自由交替，固体饲料和饮水自由喂养。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 所有实验动物随机分为5组，空白对照组、单纯脊髓损伤组、3 d后移植组、7 d后移植组和21 d后移植组，各20只。

1.4.2 脊髓损伤模型的建立 体积分数10%水合氯醛对大鼠行腹腔麻醉，剂量3.3×10^-³ mL/g，取俯卧位，以T₁₀为中心将背部皮肤、皮下组织纵向切开，将两侧椎旁肌逐渐剥离，充分暴露T₁₀棘突和椎板后咬除，直至完全显出硬膜。选取HI-0400脊髓打击器(赞德仪器有限公司)，以25 mm高度、10 g质量打击，待大鼠表现一过性鼠尾摆动及后肢痉挛，则造模成功，最后将肌肉、筋膜、皮肤逐层缝合。造模后排尿2次/d，至模型大鼠有正常排尿反射；移植前3 d至实验结束，皮下注射10 mg/kg环孢素A(注册证号H20050433，瑞士Novartis Pharma Stein AG)，1次/d^[6]。空白对照组大鼠只切开皮肤。

1.4.3 人脐带间充质干细胞移植 先将人脐带间充质干细胞(上海华雅思创生物科技有限公司)使用常规无血清培养基进行体外培养至50%融合^[7]，弃去培养基加入10 mg/L溴脱氧尿啼淀核苷(BrdU，武汉博士德生物工程有限公司)，培养72 h。移植前0.5 h滴入0.25%胰蛋白酶后离心，再充分洗涤，使用无血清培养基调制细胞浓度为1×10¹¹ L^-¹的细胞悬液。

3 d后移植组、7 d后移植组和21 d后移植组大鼠分别于脊髓损伤后3，7和21 d行细胞移植，暴露T10部位硬膜后分5个点注射人脐带间充质干细胞至脊髓损伤头、尾侧，每个点均注射剂量为6 μL，总注射细胞1.2×10⁶个，结束后留针3 min，缓慢退出逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤，大鼠复苏后精心喂养。空白对照组和单纯脊髓损伤组注射等量生理盐水。

1.4.4 运动功能评价 对5组大鼠进行运动评分，内容包括行走能力、关节运动、协调性及肢体稳定性^[6]。评分越高，大鼠运动功能恢复越好。

1.4.5 ELISA法检测血清中白细胞介素2和白细胞介素10水平 抽取大鼠尾端静脉血5 mL，滴入干净试管内，离心机内3 200 r/min离心5 min，取上清液滴入干净试管，放入-20 ℃冰箱冷存，7 d内使用ELISA法检测白细胞介素2和白细胞介素10水平，试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司，检测步骤严格按照试剂盒附带说明书操作。

1.4.6 苏木精-伊红染色 大鼠麻醉后，取仰卧位，胸骨正中切口开胸，于左心室插入20 mL注射器针头至升主动脉弓，血管钳固定主动脉根部，右心耳位置剪开放血，生理盐水冲洗干净至观察不到血性液流出，40 g/L多聚甲醛行心内灌注将标本固定30 min。暴露T₁₀脊髓，提取T₄-L₁段脊髓2 cm，放入40 g/L多聚甲醛固定3 d，常规脱水、石蜡包埋、切片，采用苏木精-伊红染色，在奥林巴斯CX23显微镜下观察其组织结构变化。

1.5 主要观察指标 ①大鼠运动功能变化；②大鼠血清中白细胞介素2和白细胞介素10水平；③大鼠脊髓组织病理变化。

1.6 统计学分析 数据分析用SPSS 19.0软件，以x(_)±s表示，多组比较采用方差分析，并用LSD-t 检验进组间两两比较；P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，医学界已经通过脐静脉灌注联合密度梯度离心的方式提取间充质干细胞，对其进行生理学鉴定和细胞分化方面的研究，对脐带间充质干细胞的提取已经比较成熟^[8]。此外通过体外诱导脐带间充质干细胞，可使得其向神经细胞转化，并能够释放相对量的神经标记物，其中包括各类神经元特异性烯醇化酶及酪氨酸羟化酶等生物酶和多种生长性蛋白因子等^[9]，表明通过人工手段能够诱导人脐带间充质干细胞分化为完整、成熟的神经细胞。此外，该细胞具有来源广泛，易从动物中提取的特点，在商业应用不存在伦理问题，且免疫源性相对低，能够进行多向潜能分化，因此成为骨外科治疗中研究重点之一。既往研究中，将人脐带间充质干细胞移植至脊骨全横断模型大鼠的脊髓内，移植细胞能长时间存活，可显著恢复断脊大鼠的后肢功能^[10]。将初次提取的脐带间充质干细胞移植到大鼠脊髓损伤部位中度损伤处后，移植来细胞能够成功存活，并可和损伤处细胞相互融合，有效加快轴突再生^[11]。但迄今为止，关于脐带间充质干细胞最佳移植时间仍处于争论之中。

有研究者认为脊髓损伤后3 d是进行间充质干细胞移植的最佳时间段^[12]，作者选取大鼠损伤后3，7和 21 d进行细胞移植，结果显示，移植后大鼠运动功能评分均明显提高，这验证了人脐带间充质干细胞移植能够显著改善大鼠受损伤脊髓生理功能，促使运动功能恢复。且实验结果还表明大鼠后肢运动功能需要恢复时间，主要因为移植人脐带间充质干细胞存活和分化时一个自然演进的过程。3，7和21 d移植组大鼠在造模后42 d的运动功能评分均高于单纯脊髓损伤组，从该结果显示大鼠损伤脊髓具有自恢复功能，但恢复能力有限，具有时间局限性，因此作者推断为42 d，而临床移植手术的最佳时间应为脊髓损伤后3 d。研究结果显示7 d后移植组高于3 d后移植组和21 d后移植组，说明人脐带间充质干细胞移植能够有效改善脊髓损伤大鼠的神经功能，且改善效果随着时间推移逐渐增强。

既往研究与实验结果均显示，脊髓损伤大鼠行人脐带间充质干细胞移植后，移植细胞分化良好^[13]，能有效修复损伤，这是因为局部移植人脐带间充质干细胞能够增强神经营养因子3、血管内皮生长因子受体3和碱性成纤维生长因子等的表达，而这些细胞因子能够促使血管再生，加快损伤组织生产及生长^[14]。苏木精-伊红染色结果显示，人脐带间充质干细胞移植后大鼠损伤脊髓恢复效果由于自然条件下的恢复。有研究认为，脊髓损伤后能够引起免疫因子出现趋化性反应，造成白细胞介素等炎症因子表达上升，形成急性免疫反应会对毒杀移植人脐带间充质干细胞，不利于损伤脊髓恢复^[15-26]。实验结果显示移植后大鼠白细胞介素10水平明显上升，且7 d后移植组效果最为明显，表明人脐带间充质干细胞移植可加快脊髓的免疫炎性恢复。有研究显示移植能够促使脊髓损伤21 d后出现胶质细胞增生^[27]，但作者并未发现这一现象。

通过研究发现人脐带间充质干细胞移植能够有效治疗大鼠脊髓损伤，改善其运动功能，这移植方式选取也密切相关。作者选取局部注射移植方式，比其他移植方式更能在损伤区内聚集大量“种子细胞”，从而加快脊髓修复。但作者也发现该移植方式能对局部组织产生损伤，但总体而言，局部注射移植人脐带间充质干细胞效果优秀。

综上所述，人脐带间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤疗效显著，并能够有效改善大鼠运动功能，且待造模后7 d，其移植效果最佳，为临床治疗人脊髓损伤具有参考价值。