糖原合成酶激酶3β过表达心肌干细胞移植治疗心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.019

摘要/Abstract

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文题释义：
糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)：属于高度保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶家族，目前研究发现其参与细胞新陈代谢、细胞的增生、生长、迁移、细胞周期的调节、凋亡、坏死、蛋白质的翻译和基因的转录、胚胎的形成等过程，而在心血管系统中，糖原合成酶激酶3β在心肌肥厚、炎症损伤、能量代谢、心肌细胞凋亡、坏死、缺血再灌注损伤中起关键的作用。
线粒体膜通透性转换孔：是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道，其分子组成尚未完全清楚，多数学者认为其是由外膜的电压依赖的阴离子通道、内膜的腺嘌呤核苷转位蛋白以及亲环素D等组成。线粒体通透性转换孔在细胞生存、凋亡中扮演着重要角色，它涉及缺血再灌注、肿瘤、衰老、神经变性等多个领域。

摘要
背景：糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)与细胞的各项生命活动之间存在密切的联系，关于其在心肌干细胞向心肌细胞分化中的作用机制和效果尚不清楚。
目的：探讨GSK-3β过表达心肌干细胞移植治疗心肌梗死大鼠的效果。
方法：分离培养乳鼠心肌干细胞，使用慢病毒感染心肌干细胞使其过表达GSK-3β或对照基因LacZ。30只SD大鼠制备心肌梗死模型随机分为3组：GSK-3β组、LacZ组、PBS组。模型制备后6周，于梗死心肌内局部注射过表达GSK-3β、LacZ心肌干细胞以及等量PBS。移植后4周，检测心功能及心室胶原生成情况。
结果与结论：①GSK-3β组的左室射血分数显著大于其他两组(P < 0.05)，左室舒张末内径显著小于其他两组(P < 0.05)；②GSK-3β组羟脯氨酸含量、Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA表达显著小于其他两组(P < 0.05)；③经Masson染色发现，GSK-3β组的心室肌蓝染的胶原含量明显低于LacZ组；④GSK-3β组的心肌梗死范围显著小于其他两组(P < 0.05)；⑤实验结果表明，心肌干细胞过表达GSK-3β能提高心肌干细胞移植治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7665-9758(程冠昌)

关键词: 干细胞, 移植, 心肌干细胞, 心肌梗死, 干细胞移植, 糖原合成酶激酶

Abstract:

BACKGROUND: The mechanism and effect of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) in the differentiation of cardiac stem cells into cardiomyocytes are still unclear, although GSK-3β is closely related to the life activities of cells.
OBJECTIVE: To investigate the changes of GSK-3β expression in the treatment of myocardial infarction in rats undergoing cardiac stem cell transplantation.
METHODS: The isolation and culture of cardiac stem cells were performed in 10 neonatal rats. Lentivirus overexpressing GSK-3β or LacZ (control) was constructed and transferred into cardiac stem cells. Animal model of myocardial infarction was made in 30 Sprague-Dawley rats. Six weeks after model preparation, rat models were assigned into GSK-3β, LacZ or PBS group. GSK-3β or LacZ overexpressing cardiac stem cell solution or PBS in equal volume was injected into the rat myocardium, respectively. Four weeks after transplantation, the cardiac function and myocardial collagen production in rats were detected and compared.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other two groups, the left ventricular ejection fraction was significantly higher, and the left ventricular end diastolic diameter was significantly lower in the GSK-3β group (P < 0.05). Hydroxyproline content, type I collagen mRNA, and type III collagen mRNA expression were significantly lower in the GSK-3β group than the other two groups (P < 0.05). Findings from Masson staining showed that the content of blue-stained collagen was significantly lower in the GSK-3β group than the LacZ group. Moreover, lowest myocardial infarction size was found in the GSK-3β group (P < 0.05). All these experimental findings show that GSK-3 overexpression plays a positive role in promoting the therapeutic effect of cardiac stem cell transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, Myocytes, Cardiac, Glycogen Synthase Kinases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵翠花，李彦明，钟晓鸣，何瑞利，程冠昌. 糖原合成酶激酶3β过表达心肌干细胞移植治疗心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6203-6208.

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图/表（结果） 2

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引言

心血管疾病是当今威胁人类健康的主要疾病之一，其中由于心肌梗死引起心肌细胞丢失和瘢痕形成是导致心力衰竭的主要原因，呈发病人群持续增加、年轻化等趋势。心肌梗死是冠心病中的严重类型，由于冠状动脉不稳定斑块破裂，导致血管急性完全闭塞，远端心肌突然被切断血供，如不能及时再通，远端心肌细胞将坏死^[1]。目前仍然认为心肌细胞是不可再生细胞，已经坏死的心肌将永久无法恢复，慢慢形成瘢痕，失去收缩能力，后期导致心力衰竭，预后差^[2]。近年来，干细胞移植开始被应用于临床治疗心肌梗死。心肌干细胞移植后，可以分化为新的心肌细胞，能够有效修复受损心肌，并达到改善心室重构的目的，获得理想的治疗效果。如何动员并促进心肌干细胞向心肌细胞增殖是目前面临的主要问题之一。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是细胞内多种信号转导通路中的重要成分，不仅参与细胞内糖代谢过程，而且还参与细胞增殖、分化和凋亡等多种重要生理过程。GSK-3β受Ser9和Tyr216位点磷酸化的调节，Ser9磷酸化使GSK-3β活性降低，而静息状态时Tyr216磷酸化使GSK-3β活性增高。以往Miura等^[3-5]通过研究发现，GSK-3β在心肌保护中具有非常重要的意义，其Ser9位点的磷酸化抑制其活性，进一步阻止mPTP的开放，是心肌保护的关键，可以减轻再灌注导致的心肌损伤。线粒体是细胞内重要的细胞器，其中线粒体通透性转换孔(mPTP)扮演了关键的角色，抑制mPTP的开放被认为是心肌保护中最有前途的靶位之一。许多具有心肌保护的药物通过多种信号通路最后聚集在GSK-3β这一靶点上，即增加GSK-3β位点Ser9的磷酸化，抑制其活性降低mPTP开放保护心肌^[4-5]。由此可以发现，GSK-3β与细胞的各项生命活动存在密切的联系，并能够影响干细胞向心肌细胞分化^[6-7]。目前关于GSK-3β在心肌干细胞向心肌细胞分化中的作用机制和效果尚不清楚。为此，实验探讨GSK-3β过表达心肌干细胞移植治疗心肌梗死大鼠的效果，以期为临床心肌梗死的治疗提供一定的实验依据。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在河南大学淮河医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康SD乳鼠10只，1-3 d龄，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤) 2010-0015，用于心肌干细胞分离与培养。SPF级雄性SD大鼠30只，2个月龄，体质量200-220 g，由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁) 2014-0006，用于制备心肌梗死模型和分组实验。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 PBS(上海翊圣生物科技有限公司)；Ⅱ型胶原酶(上海惠诚生物科技有限公司)；DMEM(上海北诺生物科技有限公司)；胎牛血清(上海恒远生物技术发展有限公司)；多赖氨酸(上海西唐生物科技有限公司)；倒置显微镜(上海源培生物科技股份有限公司)；反转录试剂盒(上海通善生物科技有限公司)；PCR仪(上海麦仓生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌干细胞分离与培养、鉴定、纯化^[8-9] SD乳鼠10只，麻醉后处死，即刻获得心室肌组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块，PBS洗涤，加入Ⅱ型胶原酶消化，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗，转移至多赖氨酸包被的培养皿中培养，观察细胞生长情况。采用免疫磁珠筛选获得较纯的目的心肌干细胞，细胞培养3-6 d后基本上生长融合，且为单层细胞，用Accutase消化3-5 min，取适量样品，加入anti-c- Kit-PE孵育后行流式细胞术分析，剩余细胞用anti-c-Kit抗体吸附的磁珠进行分选，得到较纯的c-Kit⁺心肌干细胞。收集第3代细胞用于后续实验。

1.4.2 GSK-3β过表达慢病毒穿梭质粒构建与心肌干细胞病毒感染^[10] 使用PCR引物如下：GSK-3β，F：CGG GAT CCG CCA CCA TGT CGG GGC GAC CGA GA；R：CCC CCC AGG AAT TCT CAG GTA GAG TTG GAG GCT GA；LacZ，F：CGG GAT CCG CCA CCA TGT CGT TTA CTT TGA CCA A；R：CCC CCC AGG AAT TCT TAT TTT TGA CAC CAG ACC AAC；Ⅰ型胶原，F：CCC ACC CCA GCC GCA AAG AGT；R：TTG GGT CCC TCG ACT CCT ATG；Ⅲ型胶原，F：CCC ACC CCA GCC GCA AAG AGT；R：TCA ACA CCA TCT CTG CCT CG；GAPDH，F：GCT CCT CCC TGT TCT AGA GAC；R：TGA TGG CAA CAA TGT CCA CT。使用引物扩增大鼠GSK-3β以及β-半乳糖苷酶(LacZ)CDS 区域全序列，纯化PCR产物。构建GSK-3β过表达慢病毒穿梭质粒，按照1︰1的比例对心肌干细胞进行转染，收集 CSCs-GSK-3β与CSCs-LacZ悬液，保存备用。

1.4.3 心肌梗死动物模型制备与分组处理 通过结扎左前降支建立心肌梗死模型^[11-13]，将造模成功的30只SD大鼠随机分为3组：GSK-3β组、LacZ组、PBS组，每组10只，模型制备6周后，梗死心肌内局部注射CSCs-GSK-3β与CSCs-LacZ以及等量PBS。术后给予常规抗生素治疗，并置于相同环境下喂养。

1.4.4 移植后心功能检测^[14] 移植后第4周，采用心脏超声检测左室射血分数(LVEF)、舒张末左室内径(LVEDd)。

1.4.5 心肌胶原生成检测^[15] 移植后4周，每组取5只大鼠，麻醉后处死，获得完整左室心肌组织，取部分组织用多聚甲醛固定后切片，进行Masson染色。取部分心肌组织，剪碎并超声匀浆后置于盐酸中高温酸解，加入氯胺T，检测羟脯氨酸含量。取剩余剪碎组织，进行总RNA提取与反转录，并进行PCR检测Ⅰ型胶原mRNA与Ⅲ型胶原mRNA相对表达^[16]。

1.4.6 心肌梗死范围 移植后4周，每组取5只大鼠，采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围，以心脏梗死范围占缺血区面积的百分比进行表示。

1.5 主要观察指标 ①心肌干细胞培养结果；②移植后4周大鼠心功能检测结果；③移植后4周心肌胶原生成情况；④移植后4周心肌梗死范围。

1.6 统计学分析 利用SPSS 18.0软件进行统计学处理，组内比较予以配对t 检验，组间比较予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞被认为是再生和修复心肌的重要来源之一，已有多种类型的干细胞被证明具有向心肌分化的能力^[17-21]。Makkar等^[22]和Smart等^[23]通过研究发现，在成年人心肌组织中存在一种特殊的干细胞，即心肌干细胞。通过研究发现，心肌干细胞具有很强的自我更新和分化能力，从而打破以往心肌不可再生的观点。Senyo等^[24]和Davis等^[25]通过基础研究和临床试验发现，心肌干细胞移植治疗心肌梗死动物模型，其可通过程序性分化方式分化为多种类型的细胞，包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及心肌细胞等。Bolli等^[26]和Tang等^[27]认为心肌干细胞可以促进新生血管的生成，最终逆转心室恶性重构，达到显著改善心功能的目的。

利用干细胞分化出的心肌细胞修复受损心脏组织，在短期改善心功能方面效果显著，使得干细胞移植成为治疗心肌梗死的重要方式^[28]。为了提高治疗效果，需要对促进心肌干细胞向心肌细胞增殖问题进行研究^[29]。线粒体是重要的细胞器，通常情况下，线粒体是细胞的产能和活性氧产生中心，也是介导细胞死亡的关键部位^[30]。如果出现缺血再灌注损伤等情况，线粒体通透性转换孔开放而导致心肌细胞死亡，而线粒体通透性转换孔抑制剂可以明显减轻缺血再灌注损伤^[31]。Gross等^[32]通过研究报道，在心肌保护机制中，GSK-3β具有非常重要的意义，GSK-3β可以在Ser9位点发挥出磷酸化作用，有效抑制其活性，从而阻止线粒体通透性转换孔开放，达到保护心肌的效果。实验结果显示，移植后4周GSK-3β组的左室射血分数显著大于其他两组(P < 0.05)，左室舒张末内径显著小于其他两组(P < 0.05)。GSK-3β组羟脯氨酸含量、Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA表达显著小于其他两组(P < 0.05)。GSK-3β组的心肌梗死范围显著小于其他两组。GSK-3 β除参与糖代谢外，还参与细胞内其他重要生理过程，作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因子，对细胞的分化、增殖、存活和凋亡等产生调节作用。GSK-3β可以对多种底物蛋白予以磷酸化，起到调节糖原合成代谢的作用，从而改善心功能、缩小心肌梗死范围^[33-35]。实验经Masson染色发现，GSK-3β组的心室肌蓝染的胶原含量明显低于LacZ组，Masson染色法可以对胶原纤维进行染色，蓝染的胶原含量越高，说明细胞胶原的生成量越大^[36-37]。细胞胶原含量的增加，会影响到心脏的收缩和舒张^[38]。实验结果提示，在心肌干细胞GSK-3β过表达的情况下，明显促进了心肌干细胞向心肌细胞的分化过程，从而有效减少了胶原的生成，达到改善心室重构的效果。