肾脂肪囊与腹股沟来源脂肪干细胞体外培养的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.018

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
Ⅱ型胶原：主要分布在透明软骨、玻璃体、髓核、胚胎角膜、视网神经膜，由于Ⅱ型胶原中富含羟赖氨酸，并且羟赖氨酸的羟基几乎全部和糖结合，因而糖化率高，含糖量约为10%。Ⅱ型胶原是软骨和玻璃液中的主要胶原，是构成软骨基质的主要成分之一，能够促进软骨细胞的分化，对类风湿性关节炎有特异性的治疗作用。
聚集蛋白聚糖(aggrecan)：最初从软骨组织分离得到的一种蛋白聚糖，其核心蛋白质由多种结构域组成，并接有大约100条硫酸软骨素链，在软骨细胞合成的细胞外基质中聚集蛋白聚糖所占的比例大于其他蛋白聚糖。

摘要
背景：脂肪组织来源丰富，不同部位脂肪组织分离培养的脂肪干细胞在体外生物学特性上是否存在差异，目前相关研究较少。
目的：观察肾脂肪囊来源与腹股沟来源脂肪干细胞的体外增殖和成软骨诱导分化能力。
方法：收集大鼠肾脂肪囊来源与腹股沟区来源组织进行脂肪干细胞培养与鉴定，MTT法检测两组细胞的体外增殖能力。取第3代细胞进行软骨定向诱导2周，免疫荧光检测诱导后细胞CollagenⅡ表达，RT-PCR检测两组细胞诱导后Aggrecan、Collagen ⅡmRNA表达水平。
结果与结论：①肾脂肪囊来源与腹股沟区来源脂肪干细胞经原代与传代培养，形态基本一致；②经流式细胞仪检测，不同来源脂肪干细胞的CD44阳性率均达到95%以上；③两组细胞的体外生长曲线均呈“S”型；④诱导后两组细胞均表现出CollagenⅡ阳性表达；⑤两组细胞的Aggrecan、Collagen ⅡmRNA表达水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑥结果显示，肾脂肪囊来源与腹股沟区来源脂肪干细胞均在体外生长稳定，迅速增殖，经定向诱导向软骨细胞发生分化，二者无明显区别。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8271-5664(朱永生)

关键词: 干细胞, 培养, 脂肪组织, 脂肪干细胞, 肾脂肪囊, 腹股沟, 体外培养, 细胞增殖, 软骨细胞, 细胞分化, 定向诱导

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells have different sources, but it is unclear whether these cells from different sources have difference in their biological properties.
OBJECTIVE: To detect the in vitro proliferation and chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells derived from renal fat capsule and groin.
METHODS: Adipose-derived stem cells from renal fat capsule and groin of rats were isolated, cultured and identified. MTT assay was used to detect in vitro proliferation ability of these cells. Passage 3 cells were under chondrogenic induction for 2 weeks. After induction, the expression of type II collagen was observed by immunofluorescence detection, and RT-PCR was employed to detect the expression levels of Aggrecan and type II collagen mRNA in the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: After primary culture and passage, adipose-derived stem cells from the renal fat capsule and groin of rats exhibited similar morphology, and over 95% of cells expressed CD44 in the two groups. Adipose-derived stem cells from two sources showed an S-shaped growth curve in vitro and were positive for type II collagen. After RT-PCR detection, the expression levels of Aggrecan and type II collagen mRNA had no difference in adipose-derived stem cells from renal fat capsule and groin (P > 0.05). Experimental results show that adipose-derived stem cells from both renal fat capsule and groin exhibit stable growth, rapid proliferation and chondrogenic differentiation under orient induction in vitro, indicating there is no difference between these cells from two sources.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Kidney, Groin, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

朱永生，邓青富，利军. 肾脂肪囊与腹股沟来源脂肪干细胞体外培养的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6197-6202.

Zhu Yong-sheng, Deng Qing-fu, Li Jun. Biological characteristics of adipose-derived stem cells derived from renal fat capsule and groin in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6197-6202.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] 张慧,郑红光,张德伟,等.雌激素影响冻存肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的成脂分化[J].中国组织工程研究,2013, 17(27):4998-5004.
[2] 常春娟,贾赤宇,胡永亮,等.大鼠肾脂肪囊来源干细胞修复深Ⅱ°烫伤创面的实验研究[C].中国康复医学会修复重建外科专业委员会第19次学术交流会暨中国医师协会烧伤科医师分会2012年年会论文集,2012:357.
[3] 常春娟,贾赤宇,田甜,等.大鼠肾脂肪囊来源干细胞修复深Ⅱ°烫伤创面的实验研究[C].第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会论文集,2012:190.
[4] 訾利影,郑红光,张德伟,等.氯甲基苯甲酰胺标记大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的可行性[J].中国组织工程研究,2012,16(19):3520-3524.
[5] 付勤,王勇,于冬冬,等.外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究[J].中国骨质疏松杂志,2007,13(12):848-853.
[6] 王勇.外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究[D].沈阳:中国医科大学,2008.
[7] 柴仪.BMP-9通过BMP信号通路诱导鼠脂肪源性干细胞分化为成骨细胞及经皮椎体后凸成形术治疗高龄骨质疏松性椎体压缩骨折及并发症的防治[D].石家庄:河北医科大学,2013.
[8] 吴畏,郑红光,张德伟,等.肾脂肪囊来源脂肪千细胞的体外培养及其生物学特性的研究[J].细胞与分子免疫学杂志, 2010,26(11):1078-1081.
[9] Kølle SF, Fischer-Nielsen A, Mathiasen AB, et al. Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2013;382(9898):1113-1120.
[10] 赵建辉,李龙,梁丽华,等.人与家兔脂肪来源干细胞体外培养特性的比较[J].中国组织工程研究,2012,16(14):2540- 2544.
[11] Koh KS, Oh TS, Kim H, et al. Clinical application of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in progressive hemifacial atrophy (Parry-Romberg disease) with microfat grafting techniques using 3-dimensional computed tomography and 3-dimensional camera. nn Plast Surg. 2012;69(3): 331-337.
[12] 江波,廖毅,童庭辉,等.脂肪来源干细胞诱导表皮细胞化的研究现状与进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2011, 15(27):5104-5107.
[13] Han DS, Chang HK, Kim KR, et al. Consideration of bone regeneration effect of stem cells: comparison of bone regeneration between bone marrow stem cells and adipose-derived stem cells. J Craniofac Surg. 2014;25(1):196-201.
[14] 李力群,高建华,鲁峰,等.人脂肪来源干细胞与Ⅰ型胶原支架体外复合培养的研究[J].中华实验外科杂志,2012, 29(3):421-423.
[15] Derby BM, Dai H, Reichensperger J, et al. Adipose-derived stem cell to epithelial stem cell transdifferentiation: a mechanism to potentially improve understanding of fat grafting's impact on skin rejuvenation.Aesthet Surg J. 2014;34(1):142-153.
[16] 杨杰,郭能强,孙家明,等.体外诱导乳房内脂肪来源干细胞向上皮细胞分化的实验研究[J].中华整形外科杂志,2014, 30(3):209-214.
[17] Aarum J, Sandberg K, Haeberlein SL, et al. Migration and differentiation of neural precursor cells can be directed by microglia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(26):15983-15988.
[18] Narazaki G, Uosaki H, Teranishi M, et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 2008;118(5):498-506.
[19] Otsu M, Sai T, Nakayama T, et al. Uni-directional differentiation of mouse embryonic stem cells into neurons by the neural stem sphere method. Neurosci Res. 2011;69(4):314-321.
[20] 徐扬阳,姜南,杨柳,等.重组人碱性成纤维细胞生长因子对人脂肪干细胞分化为脂肪细胞的影响[J].中华医学美学美容杂志,2013,19(2):134-137.
[21] Vergroesen PP, Kroeze RJ, Helder MN, et al. The use of poly(L-lactide-co-caprolactone) as a scaffold for adipose stem cells in bone tissue engineering: application in a spinal fusion model. Macromol Biosci. 2011;11(6):722-730.
[22] 陈冲,闫俊灵,李梁,等.人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法[J].武警医学,2015,26(2):170-174.
[23] 刘学晖,郭澍.脂肪来源干细胞提取、分离、免疫表型及分化的研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2013,24(2): 112-115.
[24] Gentile P, De Angelis B, Pasin M, et al. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet-rich plasma: basic and clinical evaluation for cell-based therapies in patients with scars on the face. J Craniofac Surg. 2014;25(1):267-272.
[25] Kim YJ, Hwang SH, Cho HH, et al. MicroRNA 21 regulates the proliferation of human adipose tissue- derived mesenchymal stem cells and high-fat diet- induced obesity alters microRNA 21 expression in white adipose tissues. J Cell Physiol. 2012;227(1): 183-193.
[26] 郑木平,曾云霞,魏波,等.脂肪干细胞向软骨分化构软骨复合体和移植界面的实验研究[J].牡丹江医学院学报,2014, 35(4):8-12.
[27] Marappagounder D, Somasundaram I, Dorairaj S, et al. Differentiation of mesenchymal stem cells derived from human bone marrow and subcutaneous adipose tissue into pancreatic islet-like clusters in vitro. Cell Mol Biol Lett. 2013;18(1):75-88.
[28] 安荣泽,赵俊延,王兆杰,等.脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较[J].中国组织工程研究,2013,17(32): 5793-5798.
[29] 王和庚,黎洪棉,崔世恩,等.带血管肌筋膜包埋脂肪干细胞载体复合物构建血管化组织工程脂肪[J].中国组织工程研究,2013,17(18):124-132.
[30] Lee RH, Kim B, Choi I, et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 2004;14(4-6):311-324.
[31] Kim WS, Park BS, Kim HK, et al. Evidence supporting antioxidant action of adipose-derived stem cells: protection of human dermal fibroblasts from oxidative stress.J Dermatol Sci. 2008;49(2):133-142.
[32] 陈亮,吴柏霖,吴明珑,等.解剖部位差异对脂肪干细胞生物学行为及成骨分化能力的影响[J].华中科技大学学报:医学版,2013,42(5):564-568.
[33] Toyoda M, Matsubara Y, Lin K, et al. Characterization and comparison of adipose tissue-derived cells from human subcutaneous and omental adipose tissues. Cell Biochem Funct. 2009;27(7):440-447.
[34] Kang SW, Do HJ, Han IB, et al. Increase of chondrogenic potentials in adipose-derived stromal cells by co-delivery of type I and type II TGFβ receptors encoding bicistronic vector system. J Control Release. 2012;160(3):577-582.
[35] 刘元媛,柳大烈,南华,等.Choukroun's PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响[J].中国美容医学, 2013,22(1):40-43.
[36] 察鹏飞,高建华,陈阳,等.人细胞外基质支架联合脂肪干细胞构建脂肪组织[J].中华实验外科杂志,2012,29(6): 1085-1088.
[37] Alharbi Z, Opländer C, Almakadi S, et al. Conventional vs. micro-fat harvesting: how fat harvesting technique affects tissue-engineering approaches using adipose tissue-derived stem/stromal cells. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2013;66(9):1271-1278.
[38] 范开防,王国栋,刘兴龙,等.人上睑眶隔脂肪来源的脂肪干细胞的分离培养及鉴定[J].现代医药卫生,2012,28(19): 2881-2882,2885.
[39] 察鹏飞,高建华,陈阳,等.体外碱性成纤维细胞生长因子聚乳酸纳米缓释微球对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响[J].中华医学美学美容杂志,2012,18(2):132-135.
[40] 赵宝成,赵博,顾蓓,等.猪脂肪来源干细胞分离、培养及多向诱导分化研究[J].中华实验外科杂志,2011,28(7): 1099-1101.

引言

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年8至12月在泸州医学院附属医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 纳入雄性SD大鼠20只，8周龄，体质量300 g左右，健康状况良好，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，许可证号SYXK(京)2015- 0008。研究相关方案均符合动物伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 水合氯醛(上海斯丹赛(干细胞)生物技术有限公司)；PBS (上海翊圣生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Worthington公司)；DMEM培养液(上海源培生物科技股份有限公司)；胎牛血清、山羊血清(上海今迈生物科技有限公司)；胰蛋白酶(上海弘顺生物科技有限公司)；MTT(北京恒奥生物科技有限公司)；二甲基亚砜(生兴生物技术(南京)有限公司)；转化生长因子β1(美国Beckman Coulter公司)；维生素C(海德创业(北京)生物科技有限公司)；地塞米松(美国PeproTech公司)；多聚甲醛(上海威奥生物科技有限公司)；Triton X-100(南京海克尔生物科技有限公司)；Collagen Ⅱ单克隆抗体(北京博润莱特科技有限公司)；山羊抗小鼠二抗(北京百奥莱博科技有限公司)；酶联免疫检测仪(上海揽宝仪器设备有限公司)；离心机(美国Falcon公司)；CO₂培养箱(德国Forma公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(瑞典Mettler Toledo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 不同来源脂肪干细胞分离与培养^[4-5] 腹腔注射10%水合氯醛麻醉处死大鼠，无菌条件下获取肾脂肪囊内脂肪组织与腹股沟区脂肪组织，PBS彻底冲洗血细胞及组织碎屑，剔除肉眼可见的血管和筋膜，用眼科剪剪碎为糊状，添加0.1%Ⅰ型胶原酶在37 ℃水浴箱中消化60 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，100目筛网过滤，在离心机中以1 000 r/min离心5 min，去掉上清液及油脂后用DMEM培养液重悬细胞重新接种在培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养48 h，大部分细胞贴壁，吸弃培养液，PBS洗去红细胞及杂质，继续加入DMEM培养液培养，每3 d换液1次，当细胞生长达80%左右融合时进行传代培养，收集第3代细胞流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原。

1.4.2 不同来源脂肪干细胞增殖情况^[6] 收集不同来源第3代脂肪干细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞悬液浓度为1×10⁷ L^-¹，接种在96孔培养板中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每日取3孔添加20 μL MTT，继续置于培养箱中培养4 h，去掉上清液，添加100 μL二甲基亚砜，充分振荡溶解后用酶联免疫检测仪检测各组在490 nm波长处的吸光度值，连续观察7 d，描绘两组细胞的体外生长曲线。

1.4.3 不同来源脂肪干细胞向软骨方向定向诱导^[7-9] 收集不同来源第3代脂肪干细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，待细胞融合达60%左右，加入软骨定向诱导DMEM培养液(含胎牛血清、转化生长因子β1、维生素C、地塞米松)进行成软骨诱导培养，另设置一对照组，不加入成软骨诱导试剂培养。每3 d进行1次半量换液，连续诱导2周。

1.4.4 免疫荧光检测诱导后细胞CollagenⅡ表达情况^[10-12] 诱导2周后，取2组细胞进行细胞爬片，PBS洗涤后吸干表面液体，多聚甲醛固定10 min，添加Triton X-100反应15 min，PBS洗涤3次，吸干表面液体，添加山羊血清进行封闭，置于室温条件下反应20 min后滤纸吸干，添加Collagen Ⅱ单克隆抗体，置于4 ℃条件下孵育过夜，弃去一抗，PBS洗涤3次，添加山羊抗小鼠二抗，置于室温条件下孵育2 h，弃去二抗，PBS洗涤3次，吸干表面液体，置于荧光显微镜下观察。

1.4.5 RT-PCR检测CollagenⅡ、Aggrecan mRNA表达^[13-15] 诱导2周后，收集细胞，Trizol试剂进行细胞裂解，提取细胞总RNA，用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，最后进行PCR扩增，PCR产物经电泳、DNA吸光度扫描检测，以目的基因与内参基因mRNA比值表示目的基因表达量。

1.5 主要观察指标 ①两组细胞的体外增殖能力；②两组细胞成软骨诱导后免疫荧光鉴定结果；③两组细胞成软骨诱导后CollagenⅡ阳性表达；④两组细胞成软骨诱导后Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA表达水平。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞是一类多潜能细胞，具有自我更新以及多向分化能力。在一定条件下，干细胞可以定向分化为人们所需的不同类型组织细胞^[16-18]。2001年，Zuk等学者从脂肪组织中分离获得一种特殊的成体干细胞，此类干细胞具有一定的多分化潜能。自此，脂肪干细胞开始得到人们的广泛关注。通过大量的分析研究也发现，脂肪干细胞可以分化为软骨细胞等多种类型的细胞^[19-25]。脂肪干细胞具有易于获得和纯度较高等特点，成为重要的组织工学种子细胞之一^[26-29]。以往Lee等^[30]还通过研究报道，在增殖能力方面，脂肪干细胞明显优于骨髓间充质干细胞，具有更高的应用价值。Kim等^[31]也通过研究指出，将脂肪干细胞作为基因治疗的靶细胞，可以发挥出十分理想的抗氧化和抗炎等效果，是一种重要的干细胞移植种子细胞。脂肪干细胞可以来源于不同的脂肪组织^[32]，通过对不同来源脂肪干细胞增殖、分化能力的分析，可以为临床不同疾病的治疗寻找更加准确的细胞来源。

以往有研究证实，人皮下脂肪和网膜脂肪分离的脂肪干细胞增殖能力相似，皮下脂肪干细胞诱导分化能力更强^[33]。但是，关于肾脂肪囊内脂肪干细胞的相关研究，相关的报道较少。实验对肾脂肪囊来源与腹股沟区来源的脂肪干细胞进行培养和诱导分化，并分析其生物性能。两组细胞形态基本一致，CD44阳性率均达到95%以上，细胞曲线均呈“S”型。上述结果表明，肾脂肪囊来源与腹股沟区来源脂肪干细胞均具有良好的体外增殖能力。脂肪干细胞可以分化为不同的组织细胞，其中，软骨细胞是一种重要的类型^[34]。

人的软骨没有血液供应和软骨组织缺乏软骨母细胞，所以关节炎或损伤的软骨部位不能治愈。干细胞移植治疗退行性关节炎所导致的软骨损伤等疾病，可以有效促进软骨再生^[35-38]。实验选择肾脂肪囊来源与腹股沟区来源脂肪干细胞进行软骨定向诱导，并观察其分化结果。免疫荧光检测两组细胞均呈现出CollagenⅡ阳性表达，提示脂肪干细胞均向软骨细胞发生分化。RT-PCR检测还发现，诱导后两组细胞的Aggrecan、Collagen ⅡmRNA表达水平均显著高于空白对照组，且两组之间经比较差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果表明，不同来源脂肪干细胞均可以向软骨细胞发生分化^[39-40]。

综上所述，实验初步对肾脂肪囊来源与腹股沟区来源组织进行培养，均可获得脂肪干细胞，并经定向诱导能够向软骨细胞发生分化。但受研究时间的限制，关于向其他组织细胞分化方面的差异等问题，还有待在今后予以进一步分析。