促红细胞生成素基因修饰内皮祖细胞移植治疗下肢动脉闭塞：磁标记MR成像评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.016

摘要/Abstract

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文题释义：
内皮祖细胞：是存在于外周血及骨髓中的重要前体细胞，是能够特异性归巢于血管新生组织并进行分化、增殖成为成熟内皮细胞的一群祖细胞，其在不同环境中可向不同的方向进行分化。
促红细胞生成素：是糖蛋白中的一种，可对哺乳动物中红细胞的生成进行调节，主要由肾小管周细胞产生，也有少部分来自于肝脏，主要功能是使延缓细胞凋亡，其可以协同其他生长因子加速红系组细胞的增殖及成熟，并能促进骨髓中红细胞的释放。

摘要
背景：促红细胞生成素及内皮祖细胞移植均对下肢动脉闭塞有一定的治疗作用。
目的：探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒(super paramagnetic iron oxide，SPIO)标记的内皮祖细胞体外促红细胞生成素基因修饰效果及体外磁共振成像的可行性。
方法：将对数生长期的大鼠骨髓来源内皮祖细胞分4组培养，内皮祖细胞组，SPIO标记转染组将pcDNA3-EPO 重组质粒并转染至内皮祖细胞，随后进行SPIO标记；SPIO标记空载病毒组将空质粒转染至内皮祖细胞，随后进行SPIO标记；SPIO标记内皮祖细胞组直接进行SPIO标记。采用4.7 T MR成像SPIO标记的内皮祖细胞；检测4组细胞增殖、细胞周期分布及促红细胞生成素蛋白表达。
结果与结论：①MR成像：T1WI、T2WI、T2*WI序列均见细胞信号降低，随着细胞数目增多，信号降低逐渐明显；相同数量级细胞，T1WI信号降低最弱，T2*WI信号降低最明显；T1WI、T2WI、T2*WI所能检测到的最小细胞数分别为2×10⁴、1×10⁴、0.5×10⁴；②细胞增殖、细胞周期分布：3组标记内皮祖细胞增殖、细胞周期分布与内皮祖细胞组比较差异均无显著性意义；③促红细胞生成素蛋白表达：仅SPIO标记转染组可见促红细胞生成素蛋白表达；④结果表明：SPIO标记的内皮祖细胞体外促红细胞生成素基因修饰后对细胞增殖、细胞周期无影响，4.7 T MR能够在体外对SPIO标记的促红细胞生成素基因修饰内皮祖细胞成像。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2568-7449(徐广宇)

关键词: 干细胞, 移植, 内皮祖细胞, 超顺磁性氧化铁粒子, 促红细胞生成素, 基因修饰, MR, 下肢动脉闭塞

Abstract:

BACKGROUND: Erythropoietin and progenitor cell transplantation both have therapeutic effects on lower extremity arterial occlusive disease.
OBJECTIVE: To investigate the erythropoietin modification effect and magnetic resonance imaging feasibility of superparamagnetic iron oxide (SPIO)-labeled endothelial progenitor cells in vitro.
METHODS: Rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells at logarithmic growth phase were randomized into four groups: endothelial progenitor cell group, SPIO labeled transfection group (pcDNA3-EPO transfection followed by SPIO labeling), SPIO labeled empty vector group (empty plasmid transfection followed by SPIO labeling), and SPIO labeling group (only SPIO labeling). 4.7T MRI was used to observe SPIO-labeled endothelial progenitor cells. Cell proliferation, cell cycle distribution, and expression of erythropoietin protein in the four groups were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: MRI findings showed with the increasing cell number, gradually lowered signal intensity on T1-weighted imaging (T1WI), T2WI and T2*WI was seen, and the reduction in the signal intensity was the maximum on T2*WI sequence and the minimum on T1WI sequence. For T1WI, T2WI and T2*WI sequences, the minimum number of cells was 2×10⁴, 1×10⁴ and 0.5×10⁴, respectively. Cell proliferation and cell cycle distribution showed no significant difference among three SPIO labeling groups. In addition, the expression of erythropoietin protein was only found in the SPIO-labeled transfection group. These findings showed that under SPIO labeling, erythropoietin gene-modified endothelial progenitor cells show no changes in cell proliferation and cell cycle, and the 4.7T MR is capable of imaging SPIO-labeled erythropoietin gene-modified endothelial progenitor cells in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Magnetic Resonance Imaging, Endothelial Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

徐广宇，田素红，周士琦. 促红细胞生成素基因修饰内皮祖细胞移植治疗下肢动脉闭塞：磁标记MR成像评价[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6183-6189.

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图/表（结果） 1

2.1 内皮祖细胞形态学观察 培养48 h后，内皮祖细胞开始贴壁生长，细胞形态主要为小圆形，之后可见小的细胞集落形成，细胞体积逐渐增大、拉长，呈长梭状或线状，其他混杂细胞大部分逐渐脱落；培养10 d左右，可见索条样结构形成；培养20 d左右，细胞长满培养瓶底壁，形成典型“鹅卵石样”外观(图1A，B)。细胞按1∶2比例传代培养4-6 d长满瓶底。流式细胞术检测内皮祖细胞免疫表型。培养至第7天的内皮祖细胞分析细胞表面标志物CD31、CD34、VEGFR-2的阳性表达率分别为53.68%、11.62%和64.82%，空白对照管结果均小于1%。

2.2 内皮祖细胞的SPIO标记率测定 SPIO标记内皮祖细胞后，鲁士蓝染色前细胞质内可见大量褐色颗粒物质，即标记的SPIO颗粒(图2A)；行普鲁士蓝染色后，光学显微镜下可见细胞胞质内蓝染的铁颗粒(图2B)，镜下随机计数5个视野显示标记率达97%。

2.3 体外MR成像 分别对不同数量级标记内皮祖细胞行4.7T MR，T1WI、T2WI、T2*WI扫描，3种序列均见细胞信号降低，随着细胞数目增多，信号降低逐渐明显；相同数量级细胞，T1WI信号降低最弱，T2*WI信号降低最明显；T1WI、T2WI、T2*WI所能检测到的最小细胞数分别为2×10⁴、1×10⁴、0.5×10⁴(图3)。

2.4 CCK-8检测结果 普通内皮祖细胞、SPIO标记内皮祖细胞组、SPIO标记空载病毒组、SPIO标记转染组的A₄₉₀值分别为0.20±0.05、0.19±0.03、0.18±0.03与0.21±0.04，3组细胞与普通内皮祖细胞A₄₉₀值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明SPIO标记的内皮祖细胞体外促红细胞生成素基因修饰后对内皮祖细胞的增殖无明显影响。

2.5 细胞生长曲线 3组标记细胞与普通内皮祖细胞生长曲线比较差异无显著性意义(P > 0.05），表明SPIO标记的内皮祖细胞体外促红细胞生成素基因修饰后对内皮祖细胞的增殖无明显影响，见表1。

2.6 细胞周期分布 3组标记细胞与普通内皮祖细胞的细胞周期分布比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明SPIO标记的内皮祖细胞体外促红细胞生成素基因修饰后对内皮祖细胞的细胞周期分布无明显影响，见表2。

2.7 Western blot检测结果 pcDNA3-EPO重组质粒稳定转染促红细胞生成素基因在转染48 h后，SPIO标记转染组内皮祖细胞检测到促红细胞生成素蛋白表达明显，而内皮祖细胞组、SPIO标记内皮祖细胞组与SPIO标记空载病毒组的促红细胞生成素蛋白无表达，说明了促红细胞生成素基因已稳定整合入SPIO标记转染组内皮祖细胞中，且可以行目的蛋白的稳定表达，见图4。

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引言

内皮祖细胞是存在于外周血及骨髓中的重要前体细胞^[1-5]，是能够特异性归巢于血管新生组织并进行分化、增殖成为成熟内皮细胞的一群祖细胞^[6-10]，其在不同环境中可向不同的方向进行分化。迄今为止对于内皮祖细胞的来源仍存在争议，但已有研究发现，其主要来源包括外周血、骨髓及脐血等，并且外周中内皮祖细胞的最初来源亦是骨髓^[11-14]。当给予某一特定刺激时，内皮祖细胞可被动员并向血管损伤部位进行定向迁移及分化、修复等。近几年的诸多研究发现，内皮祖细胞在血管性及缺血损伤性疾病等方面有重要作用^[15-16]。因此，内皮祖细胞有巨大的研究潜力。

促红细胞生成素是糖蛋白中的一种，可对哺乳动物中红细胞的生成进行调节，主要由肾小管周细胞产生，也有少部分来自于肝脏^[17-18]，主要功能是使延缓细胞凋亡，其可以协同其他生长因子加速红系组细胞的增殖及成熟，并能促进骨髓中红细胞的释放^[19-21]。早先Jacobs等通过基因重组得到重组促红细胞生成素，并将其应用于贫血的治疗。目前，促红细胞生成素的基因治疗技术引起了人们的广泛关注。

随着分子影像学的出现，应用无创性方法对体外干细胞进行示踪已不再是难事^[22]。对比各种影像学手段，在细胞及分子示踪成像中，MR以其多序列成像及高分辨率而略胜一筹。实验采用超顺磁氧化铁纳米颗粒(super paramagnetic iron oxide，SPIO)标记内皮祖细胞，并用促红细胞生成素对其进行修饰，对其标记内皮祖细胞并促红细胞生成素修饰的MR成像做出贡献。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年11月在河北省中心动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：三四周龄雄性SD大鼠，体质量(120±10) g，SPF级，购买于河北省实验动物中心，实验动物许可证编号：SCXK(冀)2011-0012。

主要试剂与仪器：SPIO(Feridex，美国)；EGM-2 MV BuIletKit(美国Clonetics公司)；胰蛋白酶(Sigma，美国)；HRP、大鼠淋巴细胞分离液(上海士锋生物科技有限公司)；Feridex(American Advanced Magnetic，美国)；多聚左旋赖氨酸、G418(Sigma)；0.5%琼脂糖溶液(Invitrogen 公司，美国)；肠杆菌DH5a和pAAV-hrGFP、pcDNA3(-)质粒(Invitrogene公司)；质粒pXL-4-hEPO (Origene公司)；限制性内切酶NotⅠ和KpnⅠ、T₄ DNA连接酶(Takara公司)；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(Qiagen公司)；Epo ELISA检测试剂盒(R&D公司)；离心机(山东鲁信科技有限公司)；流式细胞仪(北京维欣仪奥科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

内皮祖细胞的分离、培养及鉴定：将大鼠进行固定、麻醉，对其皮肤进行消毒，并依次切开皮肤、皮下组织，直至暴露股骨及胫骨，去掉周围粘连组织并将其取出，去掉骨的干骺端，使骨髓腔充分显露，吸取少量淋巴细胞分离液，对骨髓腔进行反复冲洗，将冲洗液收集于试管中备用，进行离心，分离单个核细胞；取1支洁净的离心管，用注射器吸取6 mL大鼠淋巴细胞分离液并注入离心管，然后加入6 mL单个核细胞悬液，将离心管的盖子盖好置并于离心机中，2 500 r/min离心25 min，离心完毕后将其轻柔取出，用事先准备好的PBS对细胞进行冲洗，共进行2次；再次将离心管置入离心机中，1 500 r/min离心10 min，取出离心管，弃去其中的上清液，将EGM-2 MV完全培养基加入离心管中，对细胞进行反复吹打使其悬浮，吸取少量细胞悬液按照接种细胞浓度为1×10⁹ L^-¹的标准将其接种到培养皿中，将接种完好的培养皿放入培养箱中进行培养。至第4天末对旧培养液进行更换，并丢弃其中未贴壁的细胞。培养液的更换频率为每3 d 1次。当细胞贴壁数达80%时，用胰酶进行消化，并按1∶2-1∶3的比例进行传代。参照文献[23]中的方法对内皮祖细胞进行鉴定。

pcDNA3-EPO重组质粒转染内皮祖细胞：用Not Ⅰ对质粒pXL-4-hEP0进行消化，随后进行电泳，将片段长度约为600 bp的hEPO进行回收；与此同时，用NotⅠ对pcDNA3进行经酶切，随后进行去磷酸化处理。用T₄ DNA连接酶将上述得到的两种片段进行连接，并将其转染到处于感受态的大肠杆菌DH5a，进行扩增，对质粒进行提取，用酶切法对其行验证，并送测序公司进行鉴定。将符合要求的序列定义为pcDNA3-EPO。将内皮祖细胞接种于培养液中，进行培养。

用电穿孔的方法转染细胞：取对数生长期的内皮祖细胞，将其制成单细胞悬液，用PBS进行冲洗后胰酶消化，放入离心机中进行离心，完毕后对内皮祖细胞进行收集。加入电穿孔缓冲液使其重悬，再次进行离心、静置，吸取液体对细胞进行冲洗。再次进行离心，加入到电转液中使细胞重悬，将得到的悬液置于电击杯中，加入质粒DNA 20 μg，轻轻混匀，静置于冰上30 min后，进行电穿孔，其中电穿孔参数设置为0.9 ms、350 V/cm、25 μF。将转染后的pcDNA3-EPO在室温中放置30 min，随后移植入DMEM培养基中，放置于培养箱中进行培养。依据pcDNA3-EPO的转染与否，将细胞分为内皮组细胞组、SPIO标记转染组、SPIO标记空载病毒组、SPIO标记内皮祖细胞组。

SPIO标记内皮祖细胞：用EGM2完全培养基将SPIO稀释为25 mg/L，向其中注入多聚左旋赖氨酸，放于37 ℃条件下进行温育1 h，向第3代内皮祖细胞中添加上述所得溶液以进行标记，依据国内外参考文献[23-24]及预实验结果，确定Fe的最终质量浓度为25 mg/L。将上述3组细胞培养24 h后，用普鲁士蓝染色对标记情况进行观察，其具体步骤为：在6孔板上行细胞爬片，向其中添加含SPIO质量浓度为7 mg/L的培养基，培养过夜，丢弃其中的培养基，反复用PBS进行冲洗，共3遍，随后进行固定，共计20 min，向其中添加Perl’s并放置30 min，用双蒸水缓慢清洗，进行饱和的复染并再次用双蒸水冲洗。将所得标本置于镜下进行观察，并对标记情况进行计算。

MR成像SPIO标记的内皮祖细胞：将SPIO标记的内皮祖细胞(1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶个)制成琼脂糖凝胶细胞模型进行4.7 T MR成像。首先，建立SPIO标记内皮祖细胞模型：配制质量分数0.5%琼脂糖溶液(加热1 min)，消化、收集标记和未标记的内皮祖细胞，用40 g/L多聚甲醛将细胞固定20 min，随后加入PBS进行清洗，置于离心机中，1 300 r/min离心3 min，弃上清，再次加入PBS，用移液管反复吹打细胞直至混匀，进行计数。分别取不同细胞数内皮祖细胞(1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶个)于离心管内，同上法离心弃上清后，在60 ℃的恒温水浴缸用0.5%琼脂糖溶液分别配成不同浓度细胞凝胶，并充分混匀细胞(配成400 μL置于500 μL离心管中)，置于4 ℃冰箱凝固。将制好的细胞模型行MR成像：采用4.7 T MR，300 mT/m的最大梯度强度及16 cm的孔径。T1WI：TR/TE 1 300 ms/9 ms，层间距1 mm，层厚1 mm，激励次数4，FOV 3.0 cm，矩阵 256×256，翻转角180°，T2WI：TR/TE 2 500 ms/ 33 ms，其余参数同上；T2*WI：TR/TE 408 ms/3.5 ms，层间距1 mm，层厚1 mm，激励次数8，FOV 3.0 cm，矩阵256×256，翻转角30°；DWI：TR/TE 3 750 ms/302 ms，激励次数1，单次激发EPI序列，矩阵128×128，翻转角90°。

1.5 主要观察指标

细胞生长曲线：对4组细胞进行观察，当处于对数生长期时，去掉各组中的旧培养基，并向其中添加新的培养基，按照100 μL/孔的标准接种到96孔板上，从第2天起，每天同一时间每组细胞中的3个孔中加入10 μL/孔 CCK-8，培养2 h，随后应用酶标仪在490 nm处测定各孔细胞的吸光度。连续5 d，绘制各组细胞的生长曲线图。

流式细胞术观察内皮祖细胞增殖和细胞周期：对4组细胞进行观察，48 h后收集细胞，并把其浓度调整到1.5×10⁶ L^-¹，用冷PBS冲洗2次，再用体积分数70%冷乙醇将其固定24 h。将细胞再次进行冲洗，完毕后向其中添加Tris-HCl缓冲溶液，进行温育处理30 min。进行DNA染色，随后避光放置1 h，用流式细胞仪进行测定DNA分布情况，并对处于不同时期的细胞所占的比例进行计算。

Western blot检测促红细胞生成素基因的表达：对4组细胞进行观察，48 h后，提取组织中的总蛋白，并用BCA蛋白浓度试剂盒对蛋白浓度进行定量测量。将相同质量的样品40 μg，应用凝胶恒压进行分离，随后进行湿转，使其成功转到聚偏氟乙烯膜上，用封闭液封闭在室温下温育1 h，加兔抗鼠VEGF抗体、抗微管相关蛋白1轻链(LC)3多克隆抗体(1∶500)和兔抗基因Bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3多克隆抗体(1∶200)4 ℃过夜，分别加入HRP标记山羊抗小鼠和HRP标记山羊抗兔的二抗(1∶500)，室温中静置1 h，用化学发光液对其进行显影。用扫描分析软件系统对Western blot结果中各条带的积分灰度值进行检测，蛋白水平的相对量用目的蛋白与β-actin蛋白产物条带灰度值之比来代表。

1.6 统计学分析 所有数据采用x(_)±s表示，实验数据采用SPSS 17.0进行分析，采用单因素方差分析进行不同组之间差异的比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

内皮祖细胞的常用来源是骨髓。骨髓来源单个核细胞经过适当的培养能够分化为具有很强增殖能力的内皮祖细胞^[24]。通常采用密度梯度离心法对其进行分离机培养，该方法遵循的原理是依据梯度密度对其进行离心操作，从而分离出单个核细胞，并对其在适宜条件下进行培养^[25]。研究发现培养基浓度不同时，对其生长速度及向不同方面分化的能力有重要影响^[26]。亦有研究证实，在细胞贴壁、迁移等方面，纤维连接蛋白发挥了巨大作用^[27-29]。而Yang等^[30]则证实纤维连接蛋白只在前3代内皮祖细胞中有作用，而对于第4代及以后则无明显作用。实验应用上述方法对单个核细胞进行分离，并对其培养，用于后续实验。

如何在干细胞的示踪及与目的基因的融合情况鉴定中应用无创的影像学方法，一直是人们关注的焦点。大量实验证实，MR有其独特的优越性，例如分辨率高，能同时获得生理学及解剖学信息，能从空间角度对病情进行全面的评价^[31-35]。因此，将MR看成是诊断疾病的一种重要手段，并有望应用于活体细胞移植后对其进行示踪的一种重要的技术^[36-37]。目前已将SPIO作为常用的活体细胞示踪剂^[38]。相关文献已经证实，采用该方法对细胞进行标记不会影响其生物学特性，其安全性及有效性均较好^[39]，在体内MR示踪方面有广阔应用前景。SPIO由于其自身带有负电荷，所以要先进行自身修饰，随后在胞吞作用下通过带负电的细胞膜进入细胞。实验中采用SPIO标记内皮祖细胞，并用普鲁士蓝染色对其进行鉴定，结果显示其标记率达97%，可以用来进行MR检查。对4组细胞均进行增殖及细胞周期、表达情况的检测发现，SPIO标记的3组细胞与普通内皮祖细胞在细胞增殖及周期分布方面的差异无统计学意义(P > 0.05)，所以用SPIO进行标记并不影响其增殖能力；而Western blot的检测结果显示，促红细胞生成素基因可以在SPIO标记的内皮祖细胞中表达，与内皮祖细胞组、SPIO标记内皮祖细胞组、SPIO标记空载病毒组相比，SPIO标记转染组可见促红细胞生成素基因稳定表达。

对用SPIO标记的细胞进行活体MR之前，首先要对其体外成像能力进行测定。SPIO为T2对比剂的一种，主要用T2*、T2和与之对应的R2*、R2进行衡量。在实验中，应用琼脂糖凝胶模型进行体外MR成像，结果显示，T2和T2*图像信号强度和弛豫时间随细胞数目的增多而减低，差异有统计学意义(P < 0.01)。因此，MR能够对SPIO标记的促红细胞生成素修饰的内皮祖细胞有效地体外成像。

总之，内皮祖细胞因其已获得、扩增速度快、能够进行自体移植，在修复损伤方面应用广泛。用SPIO对促红细胞生成素修饰的内皮祖细胞进行标记，并用MR成像技术对其进行评价，能够在体外条件下很好地成像。