脂肪间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
慢性阻塞性肺疾病：是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。
间充质干细胞减轻肺部炎症反应：大量研究证实间充质干细胞可以分化成肺上皮细胞，并诱导其表达气道和/或肺泡上皮细胞的标记，可表达HLA Ⅰ，HLA Ⅱ以及其他共刺激分子，使得间充质干细胞可以成功逃避机体免疫监测。此外，它可以在损伤组织局部分泌一些生长因子和细胞因子，提高自由基清除酶的活性，增强机体的抗氧化能力，减轻脂质过氧化引起的损伤。另有研究表明到达损伤肺组织中的间充质干细胞能在下调促炎因子表达的同时上调抗炎细胞因子的表达，从而起到减少甚至是中止炎症的作用。

摘要
背景：慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流受限特征的以炎症为核心的慢性呼吸系统疾病。
目的：探讨脂肪间充质干细胞对慢性阻塞性肺疾病大鼠的治疗作用。
方法：健康雄性SD大鼠60只随机分成3组(n=20)，治疗组和模型组大鼠通过烟熏及气管内注入脂多糖的方法建立慢性阻塞性肺疾病模型，对照组大鼠不进行任何处理。造模后治疗组大鼠经尾静脉注射CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞，模型组及对照组给予等量生理盐水，移植后14 d，检测大鼠肺通气功能、炎症因子水平和肺组织病理学变化。
结果与结论：①与对照组比较，模型组和治疗组肺功能明显下降，治疗组肺功能较模型组明显改善(P < 0.05)；②治疗组肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞数及中性粒细胞数均显著低于模型组(P < 0.05)；③治疗组肺泡灌洗液中白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白水平低于模型组(P < 0.05)；④与模型组相比，治疗组血清中超氧化物歧化酶活性显著增高、丙二醛水平显著降低(P < 0.05)；⑤治疗组较模型组肺气肿样改变减轻；⑥CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞能够归巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织并存活；⑦结果表明，脂肪间充质干细胞移植能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能，减轻炎症反应，具有一定治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8143-5847(郝术安)

关键词: 干细胞, 移植, 慢性阻塞性肺疾病, 脂肪间充质干细胞, 炎症因子, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Chronic obstructive pulmonary disease is progressive respiratory disease characterized by airflow limitation.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation in rats with chronic obstructive pulmonary disease.
METHODS: Sixty healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control, model and treatment groups (n=20 per group). Rat models of chronic obstructive pulmonary disease were made in the model and treatment group, while no treatment was done in the control group. After modeling, rats in the treatment group were given tail vein injection of CM-Dil-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells, and rats in the model and control groups given the same amount of normal saline. Rat pulmonary ventilation function, inflammatory factor level and pathological changes of the lung were detected at 14 days after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, reduced lung function was found in rats with chronic obstructive pulmonary disease, but the cell transplantation significantly improved this reduction (P < 0.05). Compared with the model group, significantly reduced indexes were visible in the treatment group (P < 0.05), including the total number of white blood cells, the number of macrophages and neutrophils, levels of interleukin-8, tumor necrosis factor α and C-reactive protein in the bronchoalveolar lavage fluid as well as serum level of malondialdehyde, while serum superoxide dismutase activity was increased significantly in the treatment group (P < 0.05). In the treatment group, emphysema-like changes were mitigated and CM-Dil-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells were capable of homing to the lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease and survived. All these findings show that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation can improve lung function of rats with chronic obstructive pulmonary disease, and reduce inflammatory response, which has for certain some therapeutic effects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Pulmonary Disease, Chronic Obstructive, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郝术安，吴琦，王茂均. 脂肪间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6177-6182.

Hao Shu-an, Wu Qi, Wang Mao-jun. Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treatment of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6177-6182.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)[J].中国医学前沿杂志:电子版,2014,6(2):67-80.
[2] Vaz Fragoso CA, Gill TM. Defining chronic obstructive pulmonary disease in an aging population. J Am Geriatr Soc. 2010;58(11):2224-2226.
[3] 赵红旗,罗晓寒.无创通气治疗慢性阻塞性肺病并发II型呼吸衰竭临床观察[J].实用医院临床杂志,2010,7(2):95-97.
[4] 聂姗,王浩彦.慢性阻塞性肺疾病与系统性炎症[J].心肺血管病杂志,2011,29(6):541-543.
[5] 邱川,李明才,武燕.慢性阻塞性肺疾病气道炎症的研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志,2011,10(2):196-199.
[6] Cristóvão C, Cristóvão L, Nogueira F, et al. Evaluation of the oxidant and antioxidant balance in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Rev Port Pneumol. 2013;19(2):70-75.
[7] 余国辉,陈敏.慢性阻塞性肺疾病发病机制的发展状况[J].临床肺科杂志,2010,15(1):72-74.
[8] Lindenmair A, Hatlapatka T, Kollwig G, et al. Mesenchymal stem or stromal cells from amnion and umbilical cord tissue and their potential for clinical applications. Cells. 2012;1(4):1061-1088.
[9] 胡泽斌,王立生,崔春萍,等.干细胞临床应用安全性评估报告[J].中国医药生物技术,2013,8(5):349-361.
[10] Amable PR, Teixeira MV, Carias RB, et al. Protein synthesis and secretion in human mesenchymal cells derived from bone marrow, adipose tissue and Wharton's jelly. Stem Cell Res Ther. 2014;5(2):53.
[11] de Girolamo L, Lucarelli E, Alessandri G, et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new ''cells as drugs'' paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr Pharm Des. 2013;19(13):2459-2473.
[12] 任薇,孙耕耘,王胜,等.阿奇霉素对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气道炎症和气道黏液高分泌的影响[J].中国病理生理杂志,2015,31(10):1767-1771.
[13] 任薇,王胜.低分子肝素对慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血栓前状态影响及临床疗效观察[J].安徽医学,2014, 35(6):734-736,737.
[14] Lu M, Yao WZ, Zhong NS, et al. Asymptomatic patients of chronic obstructive pulmonary disease in China. Chin Med J (Engl). 2010;123(12):1494-1499.
[15] Lu M, Yao W, Zhong N, et al. Chronic obstructive pulmonary disease in the absence of chronic bronchitis in China. Respirology. 2010;15(7):1072-1078.
[16] 甘桂香,胡瑞成.吸烟慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织内质网相关凋亡基因Caspase-12的表达[J].中国呼吸与危重监护杂志,2011,10(1):33-35.
[17] 范秀,潘海燕.炎性递质在慢性阻塞性肺疾病气道炎症反应中的作用[J].中国医药,2012,7(11): 1485-1486.
[18] Agustí A, Edwards LD, Rennard SI, et al. Persistent systemic inflammation is associated with poor clinical outcomes in COPD: a novel phenotype. PLoS One. 2012;7(5):e37483.
[19] Kherbeck N, Tamby MC, Bussone G, et al. The role of inflammation and autoimmunity in the pathophysiology of pulmonary arterial hypertension. Clin Rev Allergy Immunol. 2013;44(1):31-38.
[20] Martinez FJ, Donohue JF, Rennard SI. The future of chronic obstructive pulmonary disease treatment- difficulties of and barriers to drug development. Lancet. 2011;378(9795):1027-1037.
[21] 文富强,申永春.慢性阻塞性肺疾病的抗炎治疗证据和重要性[J].中国医刊,2011,46(12) : 87-90.
[22] 居朝霞,刘霞英,陆忠华.呼吸训练在慢性阻塞性肺疾病患者康复中的应用[J].中国老年学杂志,2010,30(2): 284-285.
[23] 刘前桂,李永杰,郑曦,等.6分钟步行试验在呼吸康复训练中的临床应用[J].临床肺科杂志,2010,15(1):129-131.
[24] 王亚勤,郑彩娥.应用综合康复护理措施改善老年慢性阻塞性肺疾病患者肺功能[J].中华护理杂志,2012 ,47(1): 25-27.
[25] 方晓聪,王向东,白春学.慢性阻塞性肺疾病在中国的诊治现状[J].国际呼吸杂志,2011,31(7):493-497.
[26] 高远毅.慢性阻塞性肺疾病的临床治疗观察与分析[J].当代医学,2011,17(10):9-10.
[27] Rabe KF, Wedzicha JA. Controversies in treatment of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 2011;378(9795):1038-1047.
[28] de Girolamo L, Lucarelli E, Alessandri G, et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new ''cells as drugs'' paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr Pharm Des. 2013;19(13):2459-2473.
[29] Bieback K, Brinkmann I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy.World J Stem Cells. 2010;2(4):81-92.
[30] Kim N, Cho SG. Clinical applications of mesenchymal stem cells. Korean J Intern Med. 2013;28(4):387-402.
[31] 李建鑫,杨亮,王文良.脂肪间充质干细胞在组织工程中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(7): 1274-1277.
[32] 殷莉波,赵文秀,尹震宇,等.人脂肪间充质干细胞的分离培养及其鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(32):5997-6000.
[33] Al-Nbaheen M, Vishnubalaji R, Ali D, et al. Human stromal (mesenchymal) stem cells from bone marrow, adipose tissue and skin exhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential. Stem Cell Rev. 2013;9(1):32-43.
[34] Liu AR, Liu L, Chen S, et al. Activation of canonical wnt pathway promotes differentiation of mouse bone marrow-derived MSCs into type II alveolar epithelial cells, confers resistance to oxidative stress, and promotes their migration to injured lung tissue in vitro. J Cell Physiol. 2013;228(6):1270-1283.
[35] Weiss DJ, Casaburi R, Flannery R, et al. A placebo-controlled, randomized trial of mesenchymal stem cells in COPD. Chest. 2013;143(6):1590-1598.
[36] Huh JW, Kim SY, Lee JH, et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2011;301(3): L255-266.
[37] Zhen G, Xue Z, Zhao J, et al. Mesenchymal stem cell transplantation increases expression of vascular endothelial growth factor in papain-induced emphysematous lungs and inhibits apoptosis of lung cells. Cytotherapy. 2010;12(5):605-614.
[38] D'Agostino B, Sullo N, Siniscalco D, et al. Mesenchymal stem cell therapy for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Biol Ther. 2010;10(5):681-687.
[39] 张超凤,区庆坚,王志红,等.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病[J].心肺血管病杂志,2011,30(1): 62-66.
[40] Katsha AM, Ohkouchi S, Xin H, et al. Paracrine factors of multipotent stromal cells ameliorate lung injury in an elastase-induced emphysema model. Mol Ther. 2011; 19(1):196-203.
[41] Ma S, Xie N, Li W, et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 2014;21(2): 216-225.
[42] Cuiffo BG, Karnoub AE. Mesenchymal stem cells in tumor development: emerging roles and concepts. Cell Adh Migr. 2012;6(3):220-230.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2015年10月在天津医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 64只四五周龄雄性SD大鼠，体质量200-250 g，购于天津市实验动物中心。

1.3.2 主要试剂、仪器 超氧化物歧化酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒(上海闳巨实业有限公司)；白细胞介素8、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(上海沪鼎生物技术有限公司)；台式离心机(北京医用离心机厂)；显微镜(德国Lica公司)；721分光光度计(上海第三分析仪器厂)；流式细胞仪(美国Coulter公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 取60只SD大鼠随机分成3组，分别为对照组、模型组和治疗组，每组20只。治疗组和模型组制备慢性阻塞性肺疾病模型，对照组不进行造模。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的分离、培养^[10-11] 取4只SD大鼠，以颈椎脱臼法处死，分离出腹股沟及附睾处脂肪组织，PBS冲洗，用剪刀剪成乳糜样的细小颗粒，取少量放入离心管中，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，用胶头滴管将混合液吹打混匀，使剪碎的脂肪组织呈悬浮状态，于37 ℃消化120 min，离心管中加入低糖DMEM完全培养基，用胶头滴管吹打均匀，1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，加入PBS冲洗2遍，加入完全培养基，用胶头滴管吹打至悬浮状态，吸取少量悬液接种于培养皿中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，培养第3天时进行第1次换液，之后隔日换液1次，培养皿中细胞达80%-90%融合时，加入0.25%胰酶消化，并按1︰2-1︰3的比例进行传代培养。取第5代细胞贴壁融合达80%时向其中加入含4 mg/L CM-DiI的培养基，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗2遍，荧光显微镜下观察细胞标记情况，然后消化细胞传代培养。

1.4.3 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立 参照任薇等^[12-13]方法，治疗组和模型组给予生理盐水10 mL/(kg•d)灌胃4周后开始造模，造模第1天、第14天，腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠，气管注入脂多糖200 μL，第2-28天(第14天除外)每天上午将大鼠置于密封的1 m³烟室中，持续吸入香烟烟雾30 min(滁州烟卷厂生产的红三环香烟，焦油量19 mg，尼古丁1.2 mg)，每天熏1次，每次15支香烟，同时每天继续用生理盐水灌胃，最终以大鼠出现频繁咳嗽作为判断造模成功的标准。

1.4.4 脂肪间充质干细胞移植 造模成功后1周，对照组及模型组大鼠尾静脉注射0.5 mL生理盐水，治疗组大鼠尾静脉注射CM-Dil标记的脂肪间充质干细胞悬液 0.5 mL(1×10⁶)。

1.4.5 肺功能仪检测大鼠肺通气功能细胞移植后 14 d，各组大鼠腹腔注射8%水合氯醛麻醉，行气管切开后迅速插入Y形气管插管，Y形气管插管的一端连接呼吸流量换能器，另一端连接三通管，通过BL-420S生物机能实验系统记录一段平静呼吸曲线后，在呼气末以注射器经三通管迅速向气管内打6 mL空气，此过程相当于大鼠被动深吸气，然后立即将注射器移开，让气体自然呼出，计算各组大鼠1 s时间用力呼出量(FEV1)、1 s时间用力呼出量与用力肺活量之比(FEV1/FVC)、最大呼气中期流速(MMEF)、最大呼气流量(PEF)测定肺通气功能。

1.4.6 肺泡灌洗液中各类白细胞计数及白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白水平 细胞移植后14 d，每组随机取7只大鼠，打开胸腔，使气管及双肺暴露于手术视野，切开气管，用血管钳夹闭右侧主支气管，向左肺内注入生理盐水进行灌洗，灌洗液在左肺停留数秒后抽出灌洗液，重复以上操作过程3次，收集3次肺泡灌洗液。取少量肺泡灌洗液滴入离心管中，1 500 r/min离心10 min，胶头滴管吸出离心管中的上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定肺泡灌洗液中白细胞介素8、肿瘤坏死因子α及C-反应蛋白水平。吸取10 μL肺泡灌洗液滴入细胞计数板，于低倍镜下计数位于四角的四个大方格中的细胞数。另取少许沉淀细胞涂片，进行瑞氏染色，选取细胞计数板上的100个白细胞，根据细胞形态特点进行分类计数，求出各种白细胞所占的百分率，再以细胞总数求得肺泡灌洗液中各类白细胞的绝对值。

1.4.7 血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平 细胞移植后14 d，每组随机取7只大鼠，从大鼠颈动脉抽取少量血液。以硫代巴比妥酸反应比色法检测血清中丙二醛水平。以黄嘌呤氧化法检测血清中超氧化物歧化酶活性。

1.5 主要观察指标 ①肺通气功能；②肺泡灌洗液中各类白细胞计数及白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白水平；③血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平；④大鼠肺组织病理变化。

1.6 统计学分析 所有实验数据以x(_)±s表示，用SPSS 17.0软件对实验数据进行两样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

慢性阻塞性肺疾病是一种慢性炎症性疾病^[14-15]，其累及包括中央气道、外周气道、肺实质在内的组织。目前最主要治疗为早期戒烟^[16]，积极预防气道感染^[17-18]，早期有效地控制炎症反应^[19-21]，长期家庭氧疗能改善患者低氧血症^[22]，加强体育锻炼增强机体抵抗力^[23]，防治并发症等^[24]，传统的药物及相关外科治疗均不能阻止病情的进一步发展，作用非常有限^[25]，几乎没有其他明确的方法能够延长患者的寿命，也没有任何治疗方法能够完全恢复慢性阻塞性肺疾病患者受损的肺功能^[26-27]。

骨髓间充质干细胞可以在特定条件下分化成为多种不同的组织器官被广泛应用于多种临床疾病的治疗^[28-30]。相关研究证实脂肪组织中同样含有大量的间质干细胞，也具有体外增殖及多重分化的潜力，能运用于组织与器官的再生与修复^[31-33]。目前有研究认为骨髓间充质干细胞移植后，在一定诱导条件下可以到达损伤的肺组织分化成肺泡上皮细胞^[34-37]。实验对治疗组大鼠经尾静脉注射CM-Dil 标记的脂肪间质干细胞，其余两组注射等剂量的生理盐水，研究结果显示脂肪间质干细胞能够归巢到大鼠的肺组织并且存活，与上述研究结果一致。除此之外脂肪间质干细胞还可以通过分泌各种细胞因子减轻炎症反应、促进损伤组织的修复^[38-42]，结果显示治疗组炎症因子高于对照组而低于模型组，提示脂肪间质干细胞移植有降低炎症反应的作用。

综上所述，脂肪间质干细胞移植能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织病理改变，减轻炎症反应，具有一定治疗作用。