脂肪间充质干细胞移植治疗1型糖尿病模型大鼠的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胰岛B细胞：是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，能分泌胰岛素，与胰岛A细胞分泌的胰高血糖素一起起到调节血糖的作用。胰岛B细胞功能受损、胰岛素分泌绝对或相对不足(胰岛素抵抗)，会使血糖升高，从而引发糖尿病。
PDX-1：又称胰十二指肠同源盒1，其参与胰腺早期发育和较晚期B细胞的分化，在成年机体内通过调节一系列基因的表达来维持B细胞的形态和正常功能，尤其是通过调控胰岛素及胰岛素相关基因如葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白2等基因的表达，促进胰岛素分泌和维持胰岛B细胞的正常功能，其在胚胎期胰岛细胞发育、增殖、分化和成熟以及胰岛B细胞分泌功能的调节中扮演着重要角色。

摘要
背景：干细胞移植是1型糖尿病比较有前景的治疗方法，脂肪间充质干细胞是继骨髓间充质干细胞后的又一研究热点。
目的：观察脂肪间充质干细胞移植对1型糖尿病大鼠的治疗作用。
方法：将45只SD大鼠随机分为正常组、模型组和细胞移植组，后2组采用链脲菌素腹腔注射建立1型糖尿病模型。造模后7 d，正常组腹腔静脉注射生理盐水，模型组腹腔静脉注射无血清的DMEM培养液，细胞移植组腹腔静脉注射脂肪间充质干细胞悬液。移植后2周，监测各组大鼠体质量、血糖水平，ELISA法检测各组大鼠胰岛素分泌量，RT-PCR检测胰腺组织PDX-1 mRNA的表达。
结果与结论：①移植前细胞移植组与模型组的体质量均低于正常组，移植后2周细胞移植组大鼠体质量逐渐增加，而模型组的体质量持续下降；②与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖维持在较高水平(P < 0.05)，与模型组相比，细胞移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05)；③与正常组比较，模型组胰岛素水平明显降低(P < 0.05)，与模型组比较，细胞移植组胰岛素水平则显著增加(P < 0.05)；④正常组胰腺组织PDX-1 mRNA表达最高，模型组最低，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，脂肪间充质干细胞移植促进胰岛组织PDX-1表达，改善了大鼠的高血糖状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6401-2487(刘小会)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪间充质干细胞, 大鼠, 1型糖尿病, PDX-1, 血糖, 胰岛素

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation is a promising treatment for type 1 diabetes mellitus. Adipose-derived mesenchymal stem cells have become another hotspot following bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation on type 1 diabetes in a rat model.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomized into normal, model and cell transplantation. Animal model of type 1 diabetes was made in the latter two groups through intraperitoneal injection of streptozotocin. Seven days after modeling, rats in the three groups were given intraperitoneal injection of normal saline, serum-free DMEM or adipose-derived mesenchymal stem cell suspension, respectively. Two weeks after injection, body mass, blood glucose level, insulin secretion and PDX-1 mRNA in the pancreatic tissue of rats were monitored and detected in the three groups.
RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, the body mass of rats were lowered, and increased gradually in the cell transplantation group at 2 weeks after cell transplantation, but it was still decreased in the model group. Compared with the normal group, the fasting blood glucose level was significantly higher in the model group (P < 0.05), but it was reduced significantly after cell transplantation (P < 0.05). Compared with the normal group, the insulin level was reduced significantly in the model group (P < 0.05), but it was increased significantly after cell transplantation (P < 0.05). Highest and lowest PDX-1 mRNA expressions were obtained in the normal and model groups, respectively; and there was a significant difference between groups (P < 0.05). All these findings show that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation relieves hyperglycemia in rats by promoting the expression of PDX-1 in the rat pancreatic tissue.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Diabetes Mellitus, Type 1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘小会. 脂肪间充质干细胞移植治疗1型糖尿病模型大鼠的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6171-6176.

Liu Xiao-hui . Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for type 1 diabetes in a rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6171-6176.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年2月至2015年8月在天津医科大学研究所动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠45只，四五周龄，体质量200-250 g，购于天津医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(津)2005-0008。

1.3.2 主要试剂、仪器 链脲佐菌素、Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；低温离心机(Biometro公司)；PCR试剂盒(Takara公司)；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(美国ADL公司)；CO₂恒温细胞培养箱(Heraeus公司)；便携式血糖仪(葡萄糖氧化酶法，北京怡成)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离、培养 以颈椎脱臼法将大鼠处死，固定在手术台上，无菌手术刀分离大鼠腹股沟及附睾处脂肪组织，严格无菌操作，用PBS将取下的脂肪组织冲洗2遍，然后用剪刀剪成肉糜样的细小颗粒，将剪碎后的脂肪组织置入离心管中，加入2倍剂量的0.1%Ⅰ型胶原酶，将二者吹打混匀，于37 ℃条件下消化120 min，将等体积的低糖DMEM完全培养基注入离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，PBS冲洗2遍，将冲洗后的上层脂肪及上清一同弃去，保留离心管底部的沉积物，再次加入完全培养基，吹打至悬浮状态，接种于培养皿中，置于培养箱中培养72 h，更换1次培养基，之后每隔1 d更换1次培养基，直至贴壁细胞数达总量的80%-90%，加入0.25%胰酶进行消化，按照1︰2-1︰3的比例进行传代接种。第3代生长旺盛的脂肪间充质干细胞进行移植。

1.4.2 1型糖尿病模型建立 SD大鼠禁食水12 h后按照60 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素，分别在注射后第3，7，14，28天检测空腹血糖，判定1型糖尿病动物模型建立成功的标准为注射链脲佐菌素7 d后空腹血糖高于16.7 mmol/L，且出现多饮、多食、多尿及消瘦症状。

1.4.3 实验分组 将45只建模成功的SD大鼠随机分成3组，分别为正常组、模型组和细胞移植组，每组15只。建模后第7天，正常组大鼠腹腔静脉注射1 mL生理盐水，模型组大鼠腹腔静脉注射1 mL无血清的DMEM培养液，细胞移植组大鼠腹腔静脉注射1.5×10⁹ L^-¹的脂肪间充质干细胞悬液1 mL。

1.4.4 监测各组大鼠的血糖变化 移植后2周，用便携式血糖仪测量各组大鼠空腹血糖，称量大鼠体质量，观察实验动物一般状态。

1.4.5 ELISA法检测各组大鼠胰岛素分泌量 移植后2周，将各组大鼠麻醉，局部皮肤消毒，取腹正中线大直切口剖腹找到胰腺后将其切除取出，完全浸没在消化瓶中静置消化，振荡消化瓶使胰岛细胞散开，过35目滤网，收集滤液加入Hank’s液终止消化，经过反复洗涤、离心后，将胰岛悬液置于24孔培养板中，每组8孔，每孔约1 mL，采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测胰岛素分泌量，按照试剂盒说明进行检测操作。

1.4.6 RT-PCR检测大鼠胰腺组织PDX-1 mRNA的表达 移植后2周，运用TRizol一步法提取胰腺总RNA。PDX-1上游引物序列5’-GTT CAT CTC CCT TTC CCG TGG-3’，下游引物序列5’-GGT GGT GGC TTT GGC AAT G-3’。GADPH的上游引物序列5’-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3’，下游引物序列5’-GGC TAA GCA GTT GGT GGT-3’。首先在95 ℃条件下预变性5 min，然后经过32个如下循环，95 ℃变性40 s，PDX-1 57 ℃，GADPH 55 ℃，退火35 s，72 ℃延伸35 s，PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，使用EB染色法进行染色，以DNA makerDL2000为分子质量标准，RT-PCR产物电泳条带使用凝胶图像分析系统进行分析，结果将GAPDH作为内参，计算PDX-1基因的相对表达量。

1.5 主要观察指标 各组大鼠血糖变化、胰岛素分泌量以及胰腺组织PDX-1 mRNA的表达。

1.6 统计学分析 所有实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0对结果进行分析，采用单因素方差分析各组之间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病是非传染性的慢性代谢性疾病，其主要特征为高血糖，高血糖是由于胰岛素分泌减少或者是胰岛素作用受限^[12-13]。糖尿病患者长期血糖控制不佳，可以导致多种并发症，造成包括眼、肾、心脏等脏器在内的多种组织损伤，影响其功能及作用的发挥。糖尿病包括1型糖尿病和2型糖尿病^[14]，二者发病机制及其治疗方案均不相同，1型糖尿病是由于自身抗体破坏了分泌胰岛素的β细胞，最终导致胰岛素绝对缺乏^[15-16]，从而导致血糖升高，多见于儿童患者^[17]，治疗上主要注射外源性胰岛素控制血糖维持生命。

干细胞因在特定条件下分化成为多种不同的组织器官而被广泛应用于自身免疫性疾病的治疗^[18-20]。与骨髓类似，脂肪组织也是由间充质细胞发育而来，并且是由多种不同细胞类群组成的高度复杂的组织系统。以往人们认为脂肪是人体肥胖之源，瘦身后抽出的脂肪组织都当成废弃物丢弃，现经由医学专家研究证实，与骨髓中存在造血干细胞一样，脂肪组织中同样含有大量的间质干细胞，这种间质干细胞也具有体外增殖及多向分化的潜力，能运用于组织器官的再生与修复^[21-23]。

目前糖尿病治疗方法很多，药物治疗、胰岛素替代治疗是临床上最常用的治疗方法^[24-25]，胰岛β细胞移植治疗糖尿病在临床上也有应用^[26-28]，且有研究显示胰岛β细胞移植治疗糖尿病很有效，然而这种疗法需要大量的供体细胞，且取材上存在较大的难度，因此这种治疗方法实施过程中受到很大程度的限制^[29-31]。随着干细胞移植技术的发展，大量研究显示干细胞移植可以应用于各种自身免疫性疾病的治疗^[32-34]，目前国内外也有大量研究关于干细胞移植治疗1型糖尿病^[35-40]，具体应用于临床还有待进一步研究^[39-40]。实验结果表明脂肪间充质干细胞移植不仅可以改善大鼠的高血糖状态，而且还可以促进胰岛组织PDX-1表达增强，促进胰岛新生，改善了大鼠糖尿病病变程度，提示脂肪间充质干细胞治疗1型糖尿病具有潜在应用价值。