白细胞介素8参与CD133+肝癌细胞的侵袭与转移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
干细胞和肿瘤干细胞的分选：目前所用的分选技术分为两类：一是磁珠分选，主要是利用CD抗原等蛋白的单克隆抗体作为一抗与单细胞悬液孵育后，再用免疫磁珠标记的第二抗体结合，经过特殊的磁珠磁场，可吸附于磁式分选柱内，最后洗脱并收集；二是流式细胞术分选，主要是通过干细胞或前体细胞表面表达的特异蛋白，或在干细胞上表达上调或下调蛋白。利用1种或2种以上可以激发不同波长荧光素标记的单克隆抗体标记单细胞悬液后，通过流式细胞仪分选。
白细胞介素8：又称为趋化因子CXCL8，是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子。白细胞介素8结合白细胞介素8受体α(IL8RA，又叫CXCR1)和白细胞介素8受体β(IL8RB，又叫CXCR2)而对中性粒细胞有细胞趋化作用而实现其对炎症反应的调节。白细胞介素8还有很强的促血管生成作用。

摘要
背景：白细胞介素8是一种重要的炎性趋化因子，其在调节肿瘤细胞增殖、血管新生方面发挥了重要作用。
目的：探讨白细胞介素8对CD133⁺肝癌细胞侵袭转移能力的影响。
方法：分离培养人肝癌MHCC97-H细胞株，免疫磁珠分选出CD133⁺/CD133^- MHCC97-H细胞，流式细胞仪检测CD133表达，ELISA检测上清液白细胞介素8水平。克隆形成实验、裸鼠成瘤实验、Transwell小室分别检测CD133⁺/CD133^- MHCC97-H细胞克隆形成率、小鼠成瘤能力、细胞迁移侵袭能力。另外，采用白细胞介素8中和抗体处理细胞，比较CD133⁺/CD133^-MHCC97-H细胞CD133表达、上清液中白细胞介素8水平及细胞克隆形成能力和迁移、侵袭能力。
结果与结论：①CD133⁺MHCC97-H细胞的CD133表达率、上清液白细胞介素8水平及克隆形成率均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；②细胞浓度为1×10⁶ L^-1和1×10⁷ L^-1的CD133⁺ MHCC97-H细胞接种后有部分小鼠出现皮下移植瘤，但CD133^-MHCC97-H细胞在同样细胞浓度下，均未出现皮下移植瘤；③CD133⁺MHCC97-H细胞的透膜细胞数量均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；④经白细胞介素8中和抗体处理之后，CD133⁺/CD133^-MHCC97-H细胞的CD133表达率、上清液中白细胞介素8水平、克隆形成率均显著下降(P < 0.05)，且CD133⁺MHCC97-H细胞下降程度更大(P < 0.01)；CD133⁺MHCC97-H细胞的迁移、侵袭透膜细胞数显著减少(P < 0.05)，CD133^-MHCC97-H细胞则未出现明显的改变(P > 0.05)；⑤结果表明，白细胞介素8可以特异性参与调节CD133⁺MHCC97-H细胞侵袭、转移能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-0113-628X(文利红)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肝癌, CD133, 细胞侵袭, 细胞转移

Abstract:

BACKGROUND: Interleukin-8 is an important inflammatory chemokine that plays an important role in the regulation of tumor cell proliferation and angiogenesis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of interleukin-8 on the invasion and metastasis of CD133⁺ hepatocellular carcinoma stem cells.
METHODS: After isolation and culture of MHCC97-H cell lines, CD133⁺/CD133^-MHCC97-H cells were sorted using immunomagnetic beads. CD133 expression was detected using flow cytometry, and interleukin-8 level in supernatant was measured using ELISA method. Cloning efficiency, tumorigenic capacity, cell migration and invasion ability were detected through colony formation assay, tumorigenesis experiment in nude mice, and Transwell detection. Additionally, other cells were neutralized using interleukin-8 neutralizing antibody. Measurement results were compared between cells undergoing different treatments.
RESULTS AND CONCLUSION: The CD133 level, interleukin-8 level, cloning efficiency and cell membrane permeability of CD133⁺MHCC97-H cells were significantly higher than those of CD133^-MHCC97-H cells (P < 0.05). Transplantation of CD133⁺MHCC97-H cells at 1×10⁶/L and 1×10⁷/L resulted in subcutaneous tumors in some mice, whereas no subcutaneous tumors appeared in mice undergoing transplantation of CD133^-MHCC97-H cells at the same concentrations. After interleukin-8 neutralizing antibody treatment, the CD133 level, interleukin-8 level, and cloning efficiency of CD133⁺/CD133^-MHCC97-H cells were significantly decreased (P < 0.05), especially in the CD133⁺MHCC97-H cells (P < 0.01); the migration and invasion ability and cell membrane permeability of CD133⁺MHCC97-H cells were significantly reduced (P < 0.05), but these changes were not obvious in CD133^-MHCC97-H cells (P > 0.05). These results show that interleukin-8 could be specifically involved in the invasion and metastasis of CD133⁺MHCC97-H cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Antigens, CD, Neoplasm Invasiveness, Neoplasm Metastasis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

文利红，胡文杰，叶恒曦，向卫东. 白细胞介素8参与CD133⁺肝癌细胞的侵袭与转移[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6145-6150.

Wen Li-hong, Hu Wen-jie, Ye Heng-xi, Xiang Wei-dong. Interleukin 8 is involved in the invasion and metastasis of CD133+ hepatocellular carcinoma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6145-6150.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验与随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年5至6月在四川医科大学附属医院实验室完成。

1.3 材料 人肝癌细胞株MHCC97-H由四川医科大学附属医院实验室提供，BALB/c(nu/nu)裸小鼠10只，由南京金莱畅生物科技有限公司提供，清洁级。研究相关内容和方法均经四川医科大学附属医院伦理部门审核并批准。

1.4 实验方法

1.4.1 肝癌细胞的培养 用含胎牛血清的DMEM培养基对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养，取对数期细胞进行后续实验。

1.4.2 肝癌细胞中CD133表达率及上清液白细胞介素8水平 重悬MHCC97-H细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，添加CD133抗体(荧光标记)孵育30 min，离心后再次重悬，流式细胞仪检测CD133表达率。按照试剂盒说明书，ELISA法检测上清液中白细胞介素8水平。

1.4.3 CD133⁺/CD133^-MHCC97-H细胞分选 MHCC 97-H细胞经胰酶消化并进行重悬，离心后弃掉上清液，再次重悬细胞之后添加FCR封阻试剂和CD133免疫微珠，常规孵育、离心、重悬之后进行过柱处理，收集CD133⁺、CD133^-细胞并进行计数，继续传代培养。流式细胞仪检测分选之后细胞的CD133表达率。

1.4.4 克隆形成实验 稀释CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞，并接种在6孔板中。培养14 d后PBS漂洗2次，各孔添加Giemsa染液进行染色，计数集落数。克隆形成率=集落数/细胞接种数×100%。

1.4.5 裸鼠成瘤实验 裸鼠BALB/c(nu/nu)10只，随机分为2组，每组5只。将CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H调整为1×10⁶ L^-¹、1×10⁷ L^-¹ 2个浓度，分别接种于裸鼠背部皮下。接种完毕对裸鼠进行常规饲养，每日观察，连续4周观察成瘤情况。

1.4.6 侵袭转移实验 用无血清的DMEM培养液重悬CD133⁺/CD133^-MHCC97-H细胞并调整细胞浓度，进行Transwell小室侵袭和迁移实验。在光学显微镜下对微孔膜下层细胞进行观察和计数，共观察5个视野，计算平均值，作为穿膜细胞数。

1.4.7 分选细胞分组和处理 分选后继续培养CD133⁺/ CD133^-MHCC97-H细胞，培养1 d后按照试剂盒说明书，ELISA检测上清液中白细胞介素8水平。按照干预方法分为4组，分别为CD133⁺细胞组、加入白细胞介素8中和抗体的CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组、加入白细胞介素8中和抗体的CD133^-细胞组。干预结束之后继续进行传代培养，培养7 d后流式细胞术检测4组细胞CD133抗原表达，ELISA检测上清液白细胞介素8水平。

1.5 主要观察指标 ①CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞CD133表达、上清液白细胞介素8水平；②细胞克隆形成能力、裸鼠成瘤能力、细胞迁移侵袭能力；③经白细胞介素8中和抗体处理后CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^-MHCC97-H细胞CD133表达、上清液中白细胞介素8水平及细胞克隆形成能力和迁移、侵袭能力。

1.6 统计学分析 研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件。计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤细胞中存在一类十分特殊的细胞，这些细胞具有自我更新能力以及较强的分化能力，被称为肿瘤干细胞。总体来看，肿瘤干细胞可以发挥出多重功能。首先，肿瘤干细胞可以通过自我更新和增殖为肿瘤细胞群的生长和壮大提供强大的活力来源，帮助其维持旺盛的生命力^[5]。其次，肿瘤干细胞还具有较强的迁徙和运动能力，极大的促进了肿瘤细胞的转移，导致各种肿瘤的浸润和转移等^[6]。另外，在正常状态下，肿瘤干细胞还可以长期维持相对稳定的休眠状态，并具备较强的耐药性^[7]。因此，肿瘤干细胞对放疗或者化疗的敏感性不强^[8]，在治疗结束一段时间之后，肿瘤干细胞便会继续发挥作用，导致肿瘤的复发。

许多学者认为肿瘤起源于干细胞，且肿瘤复发、转移以及对治疗的耐受等均与肿瘤干细胞相关^[9-11]。肿瘤干细胞具有自我更新和分化能力，与正常的组织干细胞也共享了一些核心调控基因和发育信号通路^[12]。对肿瘤干细胞进行研究过程中，首先需要筛选出可能的肿瘤干细胞表面标志，然后通过细胞分选的方法分选出具有该标记的细胞，再进一步进行干细胞活性检测。CD133具有独特的信号传递通路，可以参与到淋巴细胞的再循环过程，与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系，可以作为肿瘤干细胞重要的表面标志分子^[13]。实验发现，CD133⁺MHCC97-H细胞的CD133表达率、上清液白细胞介素8水平及克隆形成率均显著大于CD133^- MHCC97-H细胞，经比较差异有显著性意义(P < 0.05)。裸鼠成瘤实验显示，细胞浓度为1×10⁶ L^-¹和1×10⁷ L^-¹的CD133⁺MHCC97-H细胞接种后有部分小鼠出现皮下移植瘤，但CD133^-MHCC97-H细胞在同样的细胞浓度下，均未出现皮下移植瘤。结果表明，CD133⁺MHCC97-H细胞是具肿瘤干细胞特性的亚群，具有很强的克隆形成能力，并具有一定的致瘤能力。CD133⁺MHCC97-H细胞的透膜细胞数量均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞(P < 0.05)，表明CD133⁺MHCC97-H细胞具有更强的迁移、侵袭能力，提示在肝癌侵袭转移的过程中，CD133⁺肿瘤干细胞亚群可以发挥出十分重要的作用。

CD133蛋白可作为肝癌干细胞的标记物，有助研发针对肝癌干细胞失控信号通道的标靶疗法，减低癌细胞的抗药性^[14-15]。肝癌干细胞有多个信号通道不受控制，导致癌细胞不断复制、生长，并有抗药性，易于复发。通过加深对肝癌干细胞信号通道的了解，针对失控的信号通道，找到更有效的标靶疗法，可以有效减低癌细胞的抗药性等^[16-17]。白细胞介素8是一种常见的细胞因子，又称CXCL8，由多种细胞，包括单核细胞、内皮细胞等进行合成与释放。白细胞介素8可以影响多种细胞信号转导通路，进而促进肿瘤生长、血管新生等。白细胞介素8可以有效趋化并激活中性粒细胞，积极参与各种炎症过程。对各种肿瘤而言，在病灶周围的正常组织会产生一定的炎性反应，分泌白细胞介素8等多种细胞因子，这些因子与肿瘤细胞的生长和扩散具有十分紧密的联系^[18]。白细胞介素8的表达紊乱也与多种肿瘤细胞增殖和存活以及运动等紧密相关，并参与到血管的形成^[19-21]。以往有学者通过研究报道，白细胞介素8在肿瘤组织以及肿瘤微环境中可以与表达CXCR1和CXCR2的肿瘤细胞发生结合，并影响肿瘤细胞的相关活动^[22]。Waugh等^[23]也通过研究发现，白细胞介素8可以在早期促进肿瘤的生长，其作用机制可能是白细胞介素8限制肿瘤细胞的衰老。实验还发现，经白细胞介素8中和抗体处理之后，CD133⁺MHCC97-H细胞和CD133^- MHCC97-H细胞的CD133表达率、上清液中白细胞介素8水平均显著下降(P < 0.05)，克隆形成率也出现显著下降，且CD133⁺MHCC97-H细胞下降程度更大(P < 0.01)；经白细胞介素8中和抗体处理之后，CD133⁺MHCC97-H细胞的迁移、侵袭透膜细胞数显著减少(P < 0.05)，CD133^-MHCC97-H细胞则未出现明显的改变(P > 0.05)。结果表明，清除白细胞介素8之后，可以实现显著下调MHCC97-H细胞CD133表达，并可特异性降低CD133⁺MHCC97-H细胞亚群的迁移、侵袭能力，提示CD133可能参与肝癌的侵袭转移过程，发挥出功能相关性蛋白的作用。另外，清除白细胞介素8后细胞克隆形成能力出现下降，分析可能还存在着其他分子机制参与对肿瘤细胞增殖能力的调节^[24]，值得在今后予以进一步分析。