石菖蒲对脐血干细胞成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (41): 6131-6137.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.008

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

石菖蒲对脐血干细胞成骨分化的影响

褚静¹，王立芹¹，张寒²，曾娟³

西安医学院，¹护理学院妇护教研室，²药学院中药学教研室，陕西省西安市 710021；³西安医学院第二附属医院护理部，陕西省西安市 710038

修回日期:2016-07-13 出版日期:2016-10-07 发布日期:2016-10-07
作者简介:褚静，女，1977年生，陕西省渭南市人，汉族，2007年广东医学院毕业，硕士，讲师，主要从事妇产科学研究。
基金资助:
陕西省科技厅项目(2009JM4016)

Effect of Acorus tatarinowii on the osteogenic differentiation of umbilical cord blood stem cells

Chu Jing¹, Wang Li-qin¹, Zhang Han², Zeng Juan³

¹Department of Gynecologic Care, School of Nursing, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, Shaanxi Province, China; ²Department of Traditional Chinese Medicine, School of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, Shaanxi Province, China; ³Department of Nursing, Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China

Revised:2016-07-13 Online:2016-10-07 Published:2016-10-07
About author:Chu Jing, Master, Lecturer, Department of Gynecologic Care, School of Nursing, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Project of Shaanxi Provincial Science and Technology Department, No. 2009JM4016

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
成骨细胞：是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。
石菖蒲：拉丁学名Acorus tatarinowii，属天南星科、菖蒲属禾草状多年生草本植物，其根茎具气味。叶全缘，排成二列，肉穗花序(佛焰花序)，花梗绿色，佛焰苞叶状。根茎常作药用。生长于海拔20-2 600 m的地区，多生在山涧水石空隙中或山沟流水砾石间。花果期2-6月。分布于亚洲，包括印度东北部、泰国北部、中国等国家。石菖蒲有镇静作用，煎剂或挥发油均能使小鼠自发活动减少，解除单笼饲养小鼠的攻击行为，亦能延长戊巴比妥钠所致的睡眠时间，对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠有协同作用，尚能显著延长戊巴比妥钠的麻醉时间。

摘要
背景：研究表明石菖蒲及其活性成分能促进成体神经的发生，对抗衰老和治疗相关神经退行性疾病有良好疗效。
目的：探究中药石菖蒲浸提液对脐血干细胞增殖、成骨分化的影响，从中药学角度为促进干细胞的成骨分化提供新的思路。
方法：采用溶剂提取法提取中药石菖蒲浸提液；流式细胞分选技术分离筛选脐血干细胞；电子显微镜观察脐血干细胞生长情况；CCK8法观察石菖蒲对脐血干细胞增殖的影响；ELISA方法检测石菖蒲对脐血干细胞培养上清液中骨钙素、骨形态发生蛋白2含量的影响；碱性磷酸酶染色试剂盒检测石菖蒲对脐血干细胞中碱性磷酸酶分布表达的影响。
结果与结论：①分选出脐血单核细胞中的脐血干细胞纯度可达到(89.66±3.47)%；②加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞24，48，72 h后，干细胞的增殖率明显高于空白对照组(P < 0.05)，中剂量组的增殖率高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)；③加入石菖蒲浸提液培养脐血干细胞5，10，15 d后，上清液中骨形态发生蛋白2、骨钙素的含量明显高于空白对照组(P < 0.05)，中剂量组的骨形态发生蛋白2、骨钙素含量高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)；④碱性磷酸酶染色结果显示，加入石菖蒲浸提液培养干细胞10 d后碱性磷酸酶的分布表达明显高于空白对照(P < 0.05)，中剂量组和高剂量组的表达明显高于低剂量组(P < 0.05)。⑤结果提示中药石菖蒲可以促进脐血干细胞的增殖以及其成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3673-6688(褚静)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 石菖蒲, 脐血干细胞, 增殖, 成骨分化, 碱性磷酸酶, 骨钙素

Abstract:

BACKGROUND: Studies have demonstrated that Acorus tatarinowii and its active ingredients can promote adult neurogenesis, exerting an active role in anti-aging and neurodegenerative disease treatment.
OBJECTIVE: To explore the effects of Acorus tatarinowii extracts on the proliferation and osteogenic differentiation of umbilical cord blood stem cells, thereby providing a new idea for promoting the osteogenic differentiation of stem cells by Chinese medicines.
METHODS: Acorus tatarinowii extracts were obtained via solvent extraction method and flow cytometry sorting technology was used to select the stem cells isolated from human umbilical cord. Then, the umbilical cord blood stem cell proliferation was observed by electron microscope, and the effect of Acorus tatarinowii on the proliferation of umbilical cord blood stem cells was observed by cell counting kit-8. Meanwhile, the impact of Acorus tatarinowii on osteocalcin and bone morphogenetic protein-2 contents in the supernatant of umbilical cord blood stem cells were detected by ELISA; alkaline phosphatas expression was detected using alkaline phosphatase staining kit.
RESULTS AND CONCLUSION: The separation purity of the stem cells from umbilical cord mononuclear cells was (89.66±3.47)%. After low, moderate and high concentrations of cord blood stem cells co-cultured with Acorus tatarinowii extractions for 24, 48 and 72 hours, the stem cell proliferation rate was significantly higher compared with the control group (P < 0.05), and additionally, the proliferation rate of moderate concentration group was significantly higher than that in the low and high concentration groups (P < 0.05). The contents of osteocalcin and bone morphogenetic protein-2 in the stem cell supernatants were significantly higher than those in the control group after co-cultured with Acorus tatarinowii extractions for 5, 10 and 15 days, and which the highest in the high concentration group (P < 0.05). The expression of alkaline phosphatase was significantly higher than that in the control group after umbilical cord blood stem cells co-cultured with Acorus tatarinowii extractions for 10 days, and moreover, the expression of alkaline phosphatase in the moderate concentration and high concentration groups were significantly higher than that in the low concentration group (P < 0.05). In conclusion, Acorus tatarinowii can promote the proliferation and osteogenic differentiation of umbilical cord blood stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Drugs, Chinese Herbal, Bone Morphogenetic Proteins

中图分类号:

R394.2

褚静，王立芹，张寒，曾娟. 石菖蒲对脐血干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6131-6137.

Chu Jing, Wang Li-qin, Zhang Han, Zeng Juan . Effect of Acorus tatarinowii on the osteogenic differentiation of umbilical cord blood stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6131-6137.

图/表（结果） 3

2.1 脐血干细胞的提取分离及培养 从脐血中分离得到的单核细胞平均数量为(1.68±0.32)×10¹⁰ L^-¹，经磁珠分选得到的干细胞数量为(1.78±0.14)×10⁸ L^-¹，经流式细胞技术鉴定发现所得脐血干细胞纯度达到(89.66±3.47)%(见图1)。对分选出的脐血干细胞进行培养，刚分离的细胞呈圆形，分离7 d后，贴壁生长，呈梭形，分离14 d的细胞长满培养瓶，见图2。

2.2 石菖蒲对脐血干细胞增殖的影响 CCK8结果显示，加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞24，48，72 h后，脐血干细胞的增殖率明显高于空白对照(P < 0.05)，其中，中剂量组的增殖率明显高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)，低剂量与高剂量组间的增殖率差异无显著性意义(P > 0.05)。见表1。

2.3 石菖蒲对脐血干细胞培养上清液中骨钙素含量的影响 由ELISA实验结果可知，加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞5，10，15 d后，上清液中骨钙素的含量明显高于空白对照组(P < 0.05)，其中，中剂量组的骨钙素含量高于低剂量、高剂量组 (P < 0.05)。见表2。

2.4 石菖蒲对脐血干细胞培养上清液中骨形态发生蛋白2含量的影响 由ELISA实验结果可知，加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞5，10，15 d后，上清液中骨形态发生蛋白2的含量明显高于空白对照组(P < 0.05)，其中，中剂量组的骨形态发生蛋白2含量高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)。见表3。

2.5 碱性磷酸酶染色检测石菖蒲对脐血干细胞中碱性磷酸酶分布表达的影响 碱性磷酸酶染色结果显示，加入石菖蒲浸提液培养干细胞10 d后，低剂量、中剂量、高剂量组中碱性磷酸酶的分布表达明显高于空白对照，中剂量组和高剂量组的表达明显高于低剂量组。见图3。

参考文献

[1] Cui X, Chen L, Xue T et al.Human umbilical cord and dental pulp-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential roles in vitro and in vivo.Mol Med Rep.2015;11(5):3269-3278.
[2] Mueller AA, Forraz N, Gueven S et al.Osteoblastic differentiation of Wharton jelly biopsy specimens and their mesenchymal stromal cells after serum-free culture.Plast Reconstr Surg.2014;134(1):59e-69e.
[3] Liang ZH,Cheng XH,Ruan ZG,et al.Protective effects of components of the Chinese herb grassleaf sweetflag rhizome on PC12 cells incubated with amyloid-beta42. Neural Regen Res. 2015;10(8): 1292-1297.
[4] Lynch K,Pei M.Age associated communication between cells and matrix: a potential impact on stem cell-based tissue regeneration strategies. Organogenesis.2014;10(3):289-298.
[5] Xu M,Zhang B,Liu Y，et al.The immunologic and hematopoietic profiles of mesenchymal stem cells derived from different sections ofhuman umbilical cord.Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2014; 46(12):1056-1065.
[6] Ha CZ,Chen HY, Wang J，et al.Effect of diabetic osteoblasts on osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub.2015; 159(3):388-393.
[7] Doan CC, Le TL, Hoang NS, et al.Differentiation of umbilical cord lining membrane-derived mesenchymal stem cells into endothelial-like cells.Iran Biomed J. 2014;18(2):67-75.
[8] Fakhry M, Hamade E, Badran B,et al.Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts.World J Stem Cells.2013;5(4): 136-148.
[9] Lee JH, Hah YS, Cho HY, et al. Human umbilical cord blood-derived CD34-positive endothelial progenitor cells stimulate osteoblasticdifferentiation of cultured human periosteal-derived osteoblasts.Tissue Eng Part A.2014;20(5-6):940-953.
[10] Chen E, Tang MK, Yao Y,et al.Silencing BRE expression in human umbilical cord perivascular (HUCPV) progenitor cells accelerates osteogenic and chondrogenic differentiation. PLoS One.2013;8(7): e67896.
[11] Stanko P, Kaiserova K, Altanerova V,et al.Comparison of human mesenchymal stem cells derived from dental pulp, bone marrow, adipose tissue, andumbilical cord tissue by gene expression.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2014;158(3):373-377.
[12] Liu S, Hou KD, Yuan M,et al. Characteristics of mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of human umbilical cord and for fabrication of non-scaffold tissue-engineered cartilage.J Biosci Bioeng.2014;117(2):229-235.
[13] Pan H, Lan J, Luo X,et al.Biologic properties of gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid-labeled and PKH26-labeled humanumbilical cord mesenchymal stromal cells.Cytotherapy. 2014;16(1): 74-83.
[14] Hong SH, Maghen L, Kenigsberg S,et al.Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.Stem Cells Dev. 2013;22(17):2425-2439.
[15] Marupanthorn K, Tantrawatpan C, Tantikanlayaporn D,et al.The Effects of TNF-α on Osteogenic Differentiation of Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stem Cells.J Med Assoc Thai.2015;98 Suppl 3:S34-40.
[16] Qu J, Lu D, Guo H et al.MicroRNA-9 regulates osteoblast differentiation and angiogenesis via the AMPK signaling pathway.Mol Cell Biochem. 2016;411 (1-2):23-33.
[17] Luthringer BJ, Willumeit-Römer R.Effects of magnesium degradation products on mesenchymal stem cell fate and osteoblastogenesis. Gene. 2016; 575(1):9-20.
[18] Li T,Zhang C,Ding Y,et al.Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells promote proliferation and migration in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells through activation of the ERK pathway.Oncol Rep.2015;34(3):1469-1477.
[19] Satué M, Ramis JM, Monjo M. UV-activated 7-dehydrocholesterol-coated titanium implants promote differentiation of human umbilical cordmesenchymal stem cells into osteoblasts. J Biomater Appl.2016;30(6):770-779.
[20] Huang L, Niu C, Willard B,et al. Proteomic analysis of porcine mesenchymal stem cells derived from bone marrow and umbilical cord: implication of the proteins involved in the higher migration capability of bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 2015;6:77.
[21] Shimazu T, Mori Y,Takahashi A,et al.Serum- and xeno-free cryopreservation of human umbilical cord tissue as mesenchymal stromal cell source. Cytotherapy.2015;17(5):593-600.
[22] Zhang L, Liu D, Pu D et al. The role of Toll-like receptor 3 and 4 in regulating the function of mesenchymal stem cells isolated from umbilical cord.Int J Mol Med. 2015;35(4):1003-1010.
[23] Cui X, Chen L, Xue T et al. Human umbilical cord and dental pulp-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential roles in vitro and in vivo. Mol Med Rep.2015;11(5):3269-3278.
[24] Buyl K, Vanhaecke T, Desmae T,et al. Evaluation of a new standardized enzymatic isolation protocol for human umbilical cord-derived stem cells.Toxicol In Vitro.2015;29(6):1254-1262.
[25] Lynch K, Pei M.Age associated communication between cells and matrix: a potential impact on stem cell-based tissue regeneration strategies. Organogenesis.2014;10(3):289-298.
[26] Xu M,Zhang B,Liu Y,et al.The immunologic and hematopoietic profiles of mesenchymal stem cells derived from different sections of human umbilical cord. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai).2014;46(12): 1056-1065.
[27] Xiao YZ, Wang S.Differentiation of Schwann like cells from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells in vitro. Mol Med Rep.2015;11(2):1146-1152.
[28] Chao YH, Wu HP, Wu KH,et al.An increase in CD3+CD4+CD25+ regulatory T cells after administration of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during sepsis. PLoS One.2014;9(10): e110338.
[29] Xu Z,Sheng L,Ouyang G.Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells inhibit proliferation of peripheral blood lymphocytes. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi.2014;30(9):968-971.
[30] Shekels LL, Colvin Wanshura LE, Xie Y,et al. The effects of Gremlin1 on human umbilical cord blood hematopoietic progenitors.Blood Cells Mol Dis.2015; 54(1):103-109.
[31] Gao Y,Liu F,Zhang L,et al. Acellular blood vessels combined human hair follicle mesenchymal stem cells for engineering of functional arterial grafts. Ann Biomed Eng.2014;42(10):2177-2189.
[32] Li D,Chai J,Shen C,et al.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells differentiate into epidermal-like cells using a novel co-culture technique. Cytotechnology.2014;66(4):699-708.

引言

石菖蒲为天南星科、菖蒲属禾草状多年生草本植物，其根茎具气味。叶全缘，排成二列，肉穗花序，花梗绿色，佛焰苞叶状，根茎常作药用。生长于海拔20- 2 600 m的地区，多生在山涧水石空隙中或山沟流水砾石间，花果期2-6个月^[1-2]。有研究表明，石菖蒲有抗真菌的作用，对中枢神经系统、心血管系统、消化系统疾病也均有疗效。石菖蒲有镇静作用。煎剂或挥发油均能使小鼠自发活动减少，解除单笼饲养小鼠的攻击行为；亦能延长戊巴比妥钠所致的睡眠时间，对阈下催眠剂量的戊巴比妥钠有协同作用。石菖蒲根茎水提取物制成的片剂，在临床上用于治疗癫痫病及其他神经系统疾患，有较好疗效，其挥发油对某些神经系统的动物模型具有显著的生理活性。有研究报道表明石菖蒲及其活性成分能促进成体神经的发生，对抗衰老和治疗相关神经退行性疾病有良好疗效^[4-6]。以上研究提示石菖蒲有可能在干细胞分化中发挥着重要作用。

干细胞其实是人体的主要细胞，它会分化成人体的各种细胞，例如血液细胞，神经细胞，骨骼细胞等。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。相对于骨髓内的干细胞，进行脐带血干细胞移植所引发的后遗症更低，而且干细胞的排斥概率也低^[7-9]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成^[10-11]。干细胞骨分化是骨骼细胞再生的重要环节，干细胞分化成骨组织用以进行移植研究和潜在治疗具有重要的价值^[12-13]。

研究通过实验探究中药石菖蒲浸提液对脐血干细胞增殖、成骨分化的影响，从中药学角度为促进脐血干细胞的成骨分化的应用提供新思路。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验观察。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年4月在西安医学院护理学院及西安医学院实验中心完成。

1.3 材料

石菖蒲：西安瑞林生物科技有限公司。

脐血的获取：采集西安红会医院产妇生产的足月产健康婴儿脐血标本30份，50 mL/份，于采集脐血6 h内完成脐血干细胞的提取分离，取样经西安红会医院医学伦理会讨论通过，所有产妇及家属在充分知情的基础上，签署知情同意书。

1.4 实验方法

1.4.1 石菖蒲浸提液的提取与分组

石菖蒲低剂量组(质量浓度0.3 g/mL)：采用溶剂提取法中的煎煮法，将300 g石菖蒲粉碎为片状，加水1 L浸泡3 h，100 ℃加热至水沸腾后，调至60 ℃保持微沸状态2 h，用纱布过滤煎煮液500 mL，之后再将药渣用剩下的500 mL液体反复煎煮两三次，合并各次煎煮液。培养细胞时，于皿中加入低剂量石菖蒲200 μL，培养基1 700 μL混合液。

石菖蒲中剂量组(质量浓度0.6 g/mL)：采用溶剂提取法中的煎煮法，将600 g石菖蒲粉碎为片状，加水1 L浸泡3 h，100 ℃加热至水沸腾后，调至60 ℃保持微沸状态2 h，用纱布过滤煎煮液500 mL，之后再将药渣用剩下的 500 mL液体反复煎煮两三次，合并各次煎煮液。培养细胞时，于皿中加入中剂量石菖蒲200 μL，培养基1 700 μL混合液。

石菖蒲高剂量组(质量浓度1.0 g/mL)：采用溶剂提取法中的煎煮法，将1 kg石菖蒲粉碎为片状，加水1 L浸泡3 h，100 ℃加热至水沸腾后，调至60 ℃保持微沸状态2 h，用纱布过滤煎煮液500 mL，之后再将药渣用剩下的500 mL液体反复煎煮两三次，合并各次煎煮液。培养细胞时，于皿中加入高剂量石菖蒲200 μL，培养基1 700 μL混合液。

空白对照组：培养细胞时，于皿中加入2 000 μL培养基。

1.4.2 脐血单核细胞提取 密度梯度离心和红细胞裂解法提取出脐血单核细胞。每管加入15 mL脐血，加入15 mL PBS进行稀释，缓慢加入Histopaque-1077 14 mL，室温下3 000 r/min离心30 min，收集上清液为已分离的血清。血沉层即为已分离的单核细胞，取离心管，加入30 mL已分离的单核细胞，加入20 mL RMPI- 1640培养基，混匀，于室温下3 000 r/min离心5 min；移去上清液后，再次用40 mL PBS悬浮细胞，于室温下3 000 r/min离心5 min；用20 mL PBS再次悬浮细胞后，进行单核细胞的计数^[14-15]。

1.4.3 流式细胞技术分选脐血干细胞 取已分离的单核细胞，加入200 μL缓冲液，100 μL FcR阻断剂，100 μL CD133磁珠抗体，于4 ℃冰箱内孵育30 min；加入荧光抗体孵育10 min，加入PBS洗细胞，1 000 r/min离心10 min，移去上清，PBS 500 μL使细胞悬浮，在磁珠上加入500 μL细胞悬浮液，PBS冲洗磁珠4次，取下磁珠，用活塞快速推出黏附于磁珠上的CD133细胞，PBS重悬，进行流式细胞分选与纯度分析^[16]。

1.4.4 脐血干细胞的培养 采用DMEM/F12培养基1 700 μL，加入体积分数20%胎牛血清，青霉素、链霉素混合物100 μL，各剂量石菖蒲浸提液200 μL，置于 37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱内培养。

1.4.5 CCK8检测细胞增殖率 将获取的脐血干细胞铺于在96孔板中，分别加入前述DMEM/F12和石菖蒲低、中、高浓度提取液的混合液200 μL，培养24，48，72 h后，加入CCK8溶液每孔各20 μL，继续放入培养箱中培养3 h后终止，在酶标仪450 nm和630 nm处读取各孔的吸光度^[17]。

1.4.6 ELISA检测石菖蒲对脐血干细胞培养上清液中骨钙素、骨形态发生蛋白2含量的影响 将不同浓度的标准品各0.1 mL依次加入一排7孔中，加入稀释的待检测样品0.1 mL，置于37 ℃孵育90 min，甩去酶标板中的液体。将抗体工作液按每孔0.1 mL依次加入，置于37 ℃孵育60 min，用PBS洗涤3次；将ABC工作液按每孔0.1 mL依次加入，置于37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤，5次；按每孔90 μL依次加入TMB显色液，置于37 ℃避光反应15-20 min；按每孔100 μL依次加入TMB终止液，酶标仪在450 nm处测定吸光度^[18]。

1.4.7 碱性磷酸酶染色试剂盒检测石菖蒲对脐血干细胞中碱性磷酸酶分布表达的影响 将细胞按照2×10⁸ L^-¹的细胞浓度种于35 mm细胞培养皿中，按试剂盒操作步骤加入碱性磷酸酶染色试剂，反应60 min后，用PBS冲洗3次，5 min/次，于显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 石菖蒲提取液培养脐血干细胞24，48，72 h后的吸光度；石菖蒲对脐血干细胞培养上清液中骨钙素含量；石菖蒲对脐血干细胞培养上清液中骨形态发生蛋白2含量；石菖蒲对脐血干细胞中碱性磷酸酶分布表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析，由于数据服从正态分布，故计量数据以x(_)±s表示，组内差异采用t 检验；各组别之间的计量资料比较采用F分析，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

石菖蒲具有调节中枢神经系统、自主神经系统、内分泌系统、心血管系统和消化系统的作用，其最主要的药理作用表现为中枢镇静抗惊厥^[19-20]。近期有国际学术期刊报道，传统中药石菖蒲及其活性成分细辛醚促进神经干细胞增殖和神经发生的作用及其分子机制，提示了对抗衰老及疾病相关的神经退行性病变的新策略^[21-22]。也提示了石菖蒲对于促进干细胞分化的可能性。

干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体。这些细胞可以通过分裂维持自身细胞的特性和数量，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用^[23-25]。在新生儿出生以后，取婴儿端3-8 cm脐带储两把止血钳结扎、断脐，婴儿被抱走处理，贴近母端止血钳处消毒并将针头插入脐静脉，采集脐血。脐血中含有大量干细胞，可以重建人体造血和免疫系统，可用于造血干细胞移植，治疗血液系统、免疫系统，以及遗传代谢性及先天性疾病^[26-27]。脐血干细胞作为造血干细胞移植的最佳选择之一，其所引发的后遗症更低，干细胞的排斥概率也低^[28-29]。干细胞骨分化是骨骼细胞再生的重要环节，干细胞分化成骨组织用以进行移植研究和潜在治疗具有重要的价值^[30-31]。

实验探究中药石菖蒲浸提液对脐血干细胞增殖、成骨分化的影响，从中药学角度为促进干细胞的成骨分化提供新的思路。实验结果显示，加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞24，48，72 h后，脐血干细胞的增殖率明显高于空白对照(P < 0.05)，其中，中剂量组的增殖率明显高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)，低剂量与高剂量组间的增殖率没有明显的统计学差异(P > 0.05)；加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞5，10，15 d后，上清液中骨钙素的含量明显高于空白对照组(P < 0.05)，其中，中剂量组的骨钙素含量高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)；加入石菖蒲浸提液低剂量、中剂量、高剂量培养脐血干细胞5，10，15 d后，上清液中骨形态发生蛋白2的含量明显高于空白对照组(P < 0.05)，其中，中剂量组的骨形态发生蛋白2含量高于低剂量、高剂量组(P < 0.05)；碱性磷酸酶染色结果显示，加入石菖蒲浸提液培养干细胞10 d后，低剂量、中剂量、高剂量组中碱性磷酸酶的分布表达明显高于空白对照(P < 0.05)，中剂量组和高剂量组的表达明显高于低剂量组(P < 0.05)。

实验的创新点在于探究了石菖蒲常被作为中枢镇静药使用之外更具有研究价值的干细胞骨分化的可能性，采用了不同中药剂量梯度进行实验设计^[32]，采用了骨形成的经典标志物在体外实验中验证了石菖蒲的功效。石菖蒲影响脐血干细胞骨分化的具体机制以及影响分化的具体成分将是下一步研究的重点内容。

石菖蒲对脐血干细胞成骨分化的影响

Effect of Acorus tatarinowii on the osteogenic differentiation of umbilical cord blood stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.