紫杉醇联合顺铂通过Wnt/β-catenin信号通路抑制鼻咽癌肿瘤干细胞增殖并促进其凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤干细胞：是肿瘤中少量的类似干细胞的癌细胞亚群，具有自我更新、多向分化、致瘤、增殖潜能和放化疗抗拒等特性的细胞。新肿瘤中的各种类型的细胞都是肿瘤干细胞不同程度分化的结果，肿瘤干细胞与肿瘤的发生、发展、转移和产生抗药性密切相关，是肿瘤发生和复发的根源。
紫杉醇：1963年美国化学家瓦尼(M.C. Wani)和沃尔(Monre E. Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉(Pacific Yew)树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对体外培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成分。由于该活性成分在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克(Duke)大学的化学教授姆克法尔(Andre T. McPhail)合作，通过x-射线分析确定了该活性成分的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇。

摘要
背景：肿瘤干细胞具有自我更新和分化成新肿瘤的能力，会导致肿瘤放化疗不敏感，是肿瘤发生和复发的根源。
目的：探索紫杉醇联合顺铂对鼻咽癌干细胞增殖和凋亡的影响并探索其作用的信号通路。
方法：免疫磁珠的方法分离培养鼻咽癌干细胞，紫杉醇和顺铂处理细胞，Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、活化的caspase-3、Bcl-2和β-catenin及下游原癌基因c-myc的表达，用RNA干扰技术敲降β-catenin表达或者使用抑制剂XAV939抑制Wnt/β-catenin通路活性，MTT法检测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果与结论：①紫杉醇或顺铂均会抑制鼻咽癌干细胞的增殖，促进其凋亡，并且凋亡标志蛋白活化caspase-3表达上升，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降，联合用药具有协同作用，②紫杉醇或顺铂均会抑制Wnt/β-catenin通路的活性及下游靶基因c-myc的表达，抑制Wnt/β-catenin通路活性抑制鼻咽癌干细胞的增殖，促进其凋亡。③结果表明，紫杉醇和顺铂可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调控鼻咽癌干细胞的增殖和凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4425-9968(刘永刚)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 紫杉醇, 顺铂, 鼻咽癌干细胞, Wnt/β-catenin通路, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Cancer stem cells have self-renewal ability and can differentiate into new tumors. Cancer stem cells are the source of tumor formation and recurrence, and they can make tumors insensitive to radiotherapy and chemotherapy.
OBJECTIVE: To explore the effect of paclitaxel plus cisplatin on the proliferation and apoptosis of nasopharyngeal cancer stem cells (NPCSCs) and involved signal pathways.
METHODS: NPCSCs were sorted by immunomagneticbeads and were treated with paclitaxel, cisplatin or their combination. The expression of caspase-3, activated caspase-3 and Bcl-2, which are related to apoptosis, was determined by western blot. The expression of β-catenin and its downstream proto-oncogene, c-myc, was also determined by western blot. The activity of the Wnt/β-catenin pathway was inhibited by knocking down β-catenin expression or β-catenin inhibitor XAV939. Proliferation and apoptosis of NPCSCs were detected by MTT and flow cytometry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Either paclitaxel or cisplatin could inhibit proliferation and induce apoptosis of NPCSCs. The expression of apoptosis marker, activated caspase-3, was increased and the expression of the inhibitor of apoptosis, Bcl-2, was declined. Combined use of paclitaxel and cisplatin had synergistic effect when used together. Either paclitaxel or cisplatin could inhibit the expression of β-catenin and c-myc, suppressed the proliferation and induced the apoptosis of NPCSCs by inhibiting the activity of Wnt/β-catenin pathway. These results indicate that the combined use of paclitaxel and cisplatin may inhibit the proliferation of NPCSCs and promote apoptosis via the Wnt/β-catenin pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Drug Therapy, Signal Transduction, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘永刚，杨荣松，吴红方，张保朝. 紫杉醇联合顺铂通过Wnt/β-catenin信号通路抑制鼻咽癌肿瘤干细胞增殖并促进其凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6118-6124.

Liu Yong-gang, Yang Rong-song, Wu Hong-fang, Zhang Bao-chao . Paclitaxel and cisplatin inhibit the proliferation of nasopharyngeal cancer stem cells and promote apoptosis via the Wnt/beta-catenin pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6118-6124.

图/表（结果） 2

2.1 不同质量浓度紫杉醇和顺铂对鼻咽癌干细胞增殖的影响 为了摸索合适的药物浓度用于后续实验，使用不同浓度的紫杉醇或顺铂处理鼻咽癌干细胞，MTT法检测细胞的增殖情况。结果如图1，紫杉醇和顺铂均能抑制体外培养的鼻咽癌干细胞的增殖，且呈剂量依赖性。综合考虑各方面因素，选择4 mg/L的紫杉醇和8 mg/L顺铂用于后续实验。

2.2 紫杉醇联合顺铂对鼻咽癌干细胞增殖和凋亡的影响 为了研究紫杉醇联合顺铂对鼻咽癌干细胞凋亡的影响，分别用紫杉醇、顺铂、紫杉醇联合顺铂处理细胞，MTT检测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3和活化caspase-3表达。结果表明，紫杉醇或顺铂处理细胞后细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率上升，凋亡标志蛋白活化caspase-3表达上升，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降，联合用药较单一用药抑制增殖和促凋亡效果更好(图2)。这些结果表明紫杉醇和顺铂均可抑制鼻咽癌干细胞增殖，促进其凋亡，并且两种药物具有协同作用。

2.3 紫杉醇联合顺铂作用细胞后β-catenin及下游c-myc蛋白的表达 为了研究紫杉醇联合顺铂对鼻咽癌干细胞Wnt/β-catenin通路的影响，用紫杉醇和顺铂处理鼻咽癌干细胞后Western blot检测β-catenin及下游原癌基因c-myc的表达。如图3所示，紫杉醇或顺铂对β-catenin及c-myc的表达均有不同程度的抑制作用，2种药物联合处理对Wnt/β-catenin通路的抑制作用更强，表明紫杉醇和顺铂可协同抑制Wnt/β-catenin通路活性。

2.4 使用RNA干扰或抑制剂抑制Wnt/β-catenin通路活性后鼻咽癌干细胞增殖和凋亡的变化 为了探索紫杉醇和顺铂抑制鼻咽癌干细胞增殖和促进凋亡是否通过Wnt/β-catenin通路，使用RNA干扰敲降β-catenin表达或使用抑制剂XAV939抑制Wnt/β-catenin通路活性后检测鼻咽癌干细胞增殖和凋亡的变化。图4结果发现，敲降β-catenin表达或抑制剂抑制Wnt/β-catenin通路活性后鼻咽癌干细胞增殖受到抑制，凋亡增加，Bcl-2表达下降，活化caspase-3表达上升，表明Wnt/β-catenin通路活性的变化对鼻咽癌干细胞的增殖和凋亡有作用。

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引言

鼻咽癌是中国常见的发生于鼻咽上皮的恶性肿瘤。鼻咽癌在中国南方地区发病较高，发病率达每年20-50/10万，欧洲及美国发病率较低^[1-2]。鼻咽癌的发生与病毒感染、饮食、地理及遗传等因素有关^[3]。研究发现在鼻咽癌中存在肿瘤干细胞^[4]。

肿瘤的“层级模型”理论认为，肿瘤中只有少部分具有自我更新和分化成新肿瘤能力的细胞，这部分细胞具有干细胞的特征，称为肿瘤干细胞，新肿瘤中的各种类型的细胞都是肿瘤干细胞不同程度分化的结果^[5]。肿瘤干细胞是肿瘤中少量的类似干细胞的癌细胞亚群，具有自我更新、多向分化、致瘤、增殖潜能和放化疗抗拒等特性的细胞^[6]。肿瘤干细胞与肿瘤的发生、发展、转移和产生抗药性密切相关，是肿瘤发生和复发的根源^[7]。肿瘤干细胞会导致肿瘤复发转移和放化疗不敏感^[8]，因此针对肿瘤干细胞采取治疗方案是治疗肿瘤的关键。治愈肿瘤不仅需要杀灭肿瘤细胞，还需要彻底清除肿瘤干细胞。传统的治疗癌症的方式是通过手术、放疗、化疗等方法消灭大部分肿瘤组织，但是如果肿瘤干细胞没有清除干净，癌症很可能会复发。发展针对肿瘤干细胞的药物和治疗方法对癌症的治疗具有重要的意义。

紫杉醇是从短叶红豆杉中提取出的一种四环二萜类化合物^[9]。紫杉醇是细胞周期特异性药物，其抗癌机制主要是结合到微管蛋白上，抑制微管蛋白的解聚并促进其聚合，导致细胞有丝分裂时不能形成纺锤丝，抑制细胞分裂和增殖，导致肿瘤细胞凋亡^[10]。有研究者提出紫杉醇的抗肿瘤机制还与细胞信号转导通路有关。在卵巢癌细胞中，紫杉醇可以诱导ERK和AKT通路的激活，增加细胞的抗药性^[11]。紫杉醇是临床上广泛应用的治疗肿瘤药物，在治疗胶质瘤^[12]、乳腺癌^[13]、非小细胞肺癌等癌症上均有广泛的应用^[14]。

顺铂是铂的络合物，是临床常用的广谱抗癌药物之一，属于细胞周期非特异性药物^[15]。它主要是和DNA形成复合物，干扰DNA复制和转录，导致DNA损伤，启动包括蛋白激酶和p53等信号转导通路，诱导细胞凋亡^[16]。紫杉醇和顺铂联合应用在多种癌症中有良好的疗效，如卵巢癌^[17]、非小细胞肺癌^[18]、食管癌等^[19]。

与肿瘤干细胞自我更新和分化有关的信号通路有PI3K/Akt、PTEN、Wnt/β-catenin、notch、Hedgehog等^[20]。Wnt信号通路包括3条通路，其中一条是Wnt/PCP通路，另一条是Wnt/Ca²⁺通路，第3条是Wnt/β-catenin通路，这条通路也被称为经典Wnt通路^[21]。在Wnt/β-catenin通路中，β-catenin是Wnt信号通路的的核心元件，在细胞质和细胞膜上均有分布。当没有Wnt信号时，细胞质中的β-catenin与Axin、APC(腺瘤息肉蛋白)、GSK3(糖原合成酶激酶)和CK1(酪蛋白激酶)相互作用形成降解复合物，导致β-catenin的磷酸化和被蛋白酶体降解，β-catenin维持在较低的水平^[22]。在Wnt信号刺激下，Wnt蛋白和细胞膜受体LRP5/6和Frizzled结合，激活受体蛋白，受体蛋白的胞内端招募Disheveled和Axin抑制降解复合体的形成，Disheveled将GSK3磷酸化使其脱离Axin，阻止β-catenin的降解，导致β-catenin的大量积聚并进入细胞核^[23]。β-catenin入核后与核内转录因子TCF/LEF(T细胞/淋巴细胞增强子)结合，与细胞内其他因子共同作用解除TCF/LEF的抑制，启动和激活下游基因的表达，如c-myc、cyclinD1等^[24]，这些基因在肿瘤的发生发展中有重要的作用。

肿瘤干细胞的信号通路常出现突变或异常激活，研究信号通路与肿瘤干细胞之间的关联以及化疗药物对肿瘤干细胞的信号通路的作用，成为目前肿瘤的研究热点。文章研究了紫杉醇联合顺铂对鼻咽癌干细胞的抗癌作用，并探索了两种药物对β-catenin信号通路的作用。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 2013年3月至2015年7月在南阳市中心医院病理室完成。

1.3 材料 人鼻咽癌细胞株CNE2购自上海拜力公司；RPMI 1640培养基、小牛血清、青霉素、链霉素、小牛血清白蛋白购自Gibco公司；人CD133细胞分选试剂盒购自Miltenyi Biotec公司；β-catenin siRNA购自Invitrogen公司；鼠抗Bcl-2抗体购自Santa Cruz公司；鼠抗caspase-3、兔抗c-myc、兔抗β-catenin抗体购自Abcam公司；MTT、FITC-Annexin V、Propidium Iodide、cocktail、XAV939购自Sigma公司；鼠抗GAPDH、HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠抗体购自中杉金桥有限公司；RIPA裂解液(强)购自碧云天公司；ECL显色液购自Pierce公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Scientific公司；流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司。

1.4 实验方法

1.4.1 鼻咽癌CNE2细胞的培养和传代 人鼻咽癌细胞株CNE2用含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养，置于 37 ℃，含体积分数5%CO₂的培养箱中培养，每隔2 d换1次培养基。细胞长到融合度为80%时用胰酶消化，按 1∶3的比例传代培养。

1.4.2 免疫磁珠分选CD133⁺细胞 将CNE2细胞用PBS冲洗，胰酶消化。用buffer(含0.5%小牛血清白蛋白、2 mmol/L EDTA、pH 7.2的PBS)重悬细胞，离心沉淀后用buffer重悬细胞。加入FC受体和抗CD133⁺的免疫磁珠各100 μL，混匀后4 ℃避光孵育30 min。离心沉淀细胞，用buffer重悬。用buffer润洗柱子，将柱子放在磁珠分选器上，加入细胞悬液，让细胞悬液缓慢流出，用buffer洗柱子。将柱子移出磁珠分选器，放在收集器上，加入buffer，收集含有CD133⁺细胞的液体，PBS洗涤细胞后加入无血清培养基培养。

1.4.3 紫杉醇和顺铂浓度梯度摸索 实验分为紫杉醇组和顺铂组，分别以0，1，2，4，8 mg/L和0，2，4，8，16 mg/L的紫杉醇和顺铂作用于细胞，每个质量浓度设置3个平行孔，48 h后收集细胞，MTT检测细胞增殖情况。选取合适的浓度用作后续实验。

1.4.4 RNA干扰及抑制剂抑制β-catenin活性 合成β-catenin的siRNA，用脂质体转染试剂lipofectamine 2000将siRNA转染到CD133⁺细胞中，将细胞置于含体积分数5% CO₂的37 ℃培养箱中转染6 h，转染后换成新鲜培养基继续培养。使用终浓度为1 μmol/L的XAV939处理细胞抑制β-catenin活性，细胞添加与XAV939中等量的二亚基亚砜作为溶剂对照。处理48 h后检测细胞的增殖和凋亡情况。

1.4.5 MTT检测鼻咽癌干细胞增殖 处理后的细胞取3个孔进行MTT实验，每孔换成新鲜的RPMI1640培养液，加入10% MTT反应液(5 g/L)，37 ℃反应4 h使细胞形成不溶蓝紫色甲臜结晶，移去培养基，细胞用PBS洗2次，加入150 μL 二亚基亚砜溶解甲臜，将培养板均匀振荡 5 min，用酶标仪测定细胞在570 nm处的吸光值，计算细胞增殖率。

1.4.6 流式细胞仪检测鼻咽癌干细胞凋亡 离心收集5×10⁵的细胞，加入缓冲液(10 mmol/L HEPES/ NaOH，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl₂，pH=7.4)洗1次，再加入含1 g/L FITC-Annexin V和Propidium Iodide的缓冲液，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测凋亡率。通过western blot检测细胞凋亡相关蛋白caspase-3、活化的caspase-3和Bcl-2的表达。

1.4.7 Western blot 将细胞用冷的PBS洗2次，使用RIPA裂解液(添加蛋白酶抑制剂cocktail)裂解细胞， 4 ℃，12 000×g离心5 min，取上清，BCA法定量细胞总蛋白浓度，每组样品取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后将蛋白从胶转移至PVDF膜上，100 V转膜1 h。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入鼠抗Bcl-2、鼠抗caspase-3、兔抗c-myc、兔抗β-catenin的抗体作为一抗，以GAPDH作为内参，37 ℃孵育2 h。HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠作为二抗，37 ℃孵育1 h。加入ECL显色液，胶片曝光检测蛋白表达。

1.5 主要观察指标 ①不同质量浓度紫杉醇和顺铂对鼻咽癌干细胞增殖的影响；②紫杉醇联合顺铂对鼻咽癌干细胞增殖和凋亡的影响；③紫杉醇联合顺铂作用细胞后β-catenin及下游c-myc蛋白的表达；④使用RNA干扰或抑制剂抑制Wnt/β-catenin通路活性后鼻咽癌干细胞增殖和凋亡的变化。

1.6 统计学分析 实验数据均以x(_)±s表示，采用GraphPad Prism 5软件进行处理。组间差异使用t 检验或单因素方差分析，P < 0.05即为差异有显著性意义。

讨论

CD133是目前常用的肿瘤干细胞筛选表面抗原，多篇研究报道将其作为鼻咽癌干细胞标记物^[25-26]。研究采用免疫磁珠的方法从鼻咽癌细胞CNE2中分选出CD133⁺的鼻咽癌干细胞，将分离出的鼻咽癌干细胞用紫杉醇和顺铂处理后检测细胞增殖和凋亡情况及凋亡相关蛋白的表达。实验结果表明紫杉醇或顺铂均会抑制鼻咽癌干细胞的增殖，促进其凋亡，凋亡标志蛋白活化caspase-3表达上升，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降，联合用药时抑制增殖和促进凋亡的效果更显著，表明紫杉醇和顺铂具有协同作用。

研究还探索了紫杉醇和顺铂对鼻咽癌干细胞Wnt/β-catenin通路的影响，结果表明紫杉醇或顺铂均会抑制Wnt/β-catenin通路的活性及下游靶基因c-myc的表达，联合作用时抑制作用更强。Wnt/β-catenin通路与鼻咽癌干细胞的增殖和凋亡密切相关，因此，推测紫杉醇和顺铂可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路调控鼻咽癌干细胞的增殖和凋亡。敲降β-catenin表达或抑制Wnt/β-catenin通路活性均会抑制鼻咽癌干细胞的增殖，促进其凋亡，进一步证实紫杉醇和顺铂可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路的活性抑制鼻咽癌干细胞的增殖并促进其凋亡。c-myc与肿瘤的发生发展密切相关，是常见的原癌基因，在转录过程中可以绑定到DNA上激活启动从而推进细胞周期进程^[27]。在成神经管细胞瘤患者中，高c-myc表达是预后不良的重要标志^[28]。研究发现紫杉醇和顺铂可以抑制Wnt/β-catenin通路的活性从而抑制c-myc的表达，可能具有抑制癌症的效应。

Wnt/β-catenin信号通路在调控细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤的发生发展中起着重要的作用^[29]，同时也在肿瘤干细胞的干细胞特性维持方面也起着重要的作用^[30]。抑制Wnt/β-catenin信号通路可以抑制肠道干细胞的自我更新^[31]。在癌症中β-catenin过度激活或β-catenin抑制基因APC的失活都会导致β-catenin在细胞内的积聚，促进癌症的发展^[32]。Wnt/β-catenin信号通路异常和肿瘤的发生发展密切相关。根据统计，有90%以上的结直肠癌患者Wnt/β-catenin信号通路异常^[33]。在卵巢癌中，Wnt-1和β-catenin异常高表达，可能是卵巢癌晚期的重要标志^[34]。在多种鼻咽癌细胞系中，β-catenin蛋白异常高表达^[35]，在癌症的发生中有重要的作用。紫杉醇和顺铂对Wnt/β-catenin信号通路的影响也有一定研究。在卵巢癌中β-catenin的转录受到紫杉醇调控^[36]。在非小细胞肺癌中，紫杉醇可以下调β-catenin的表达^[37]。紫杉醇可以抑制宫颈癌中β-catenin的表达，阻断Wnt/ β-catenin信号通路，引起宫颈癌细胞凋亡，起到抗肿瘤的作用^[38]。在肺癌A549细胞中，紫杉醇以剂量依赖的方式下调β-catenin的表达，从而减少c-myc的表达^[39]。顺铂可以诱导Wnt抑制因子FrpHE和DDK-1的mRNA表达，进而抑制Wnt通路，导致β-catenin表达水平降低^[40]。

研究发现紫杉醇和顺铂均会抑制鼻咽癌干细胞的增殖，促进其凋亡，联合用药具有协同作用。紫杉醇和顺铂均会抑制Wnt/β-catenin通路的活性及下游靶基因c-myc的表达，抑制Wnt/β-catenin通路活性抑制鼻咽癌干细胞的增殖，促进其凋亡。这些结果表明紫杉醇和顺铂可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调控细胞的增殖和凋亡。