白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞凋亡：是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡属于主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
锥虫蓝染色：正常的活细胞胞膜结构完整，能够排斥锥虫蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被锥虫蓝染成蓝色。因此，借助锥虫蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。锥虫蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。

摘要
背景：骨髓微环境是白血病的发病根源，微环境的改变对白血病细胞的生物学行为和性能有一定的影响。
目的：探讨白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO2细胞生长增殖及凋亡的影响。
方法：体外环境下进行K562/AO2细胞单独悬浮培养，K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养。锥虫蓝染色计数活细胞数，描绘两组细胞生长曲线，PI单染法检测细胞周期，Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况。
结果与结论：①单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变，第4天开始细胞增殖速度明显加快，并于培养第6天达到最高峰。共培养组整体增殖曲线较为平缓，无明显的增殖高峰；②单独培养组的G₀-G₁期细胞比例显著低于共培养组，S期细胞比例显著高于共培养组(P < 0.05)。两组G2-M期细胞比例差异无显著性意义；③单独培养组的细胞凋亡数显著高于共培养组(P < 0.05)；④结果表明，与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后K562/AO2细胞生长受到抑制，细胞周期阻滞在G₀-G₁期，且会对K562/AO2细胞凋亡产生抵抗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1793-8332(雷春霞)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 白血病, 骨髓间充质干细胞, 白血病细胞株, 细胞增殖, 细胞凋亡, 细胞周期

Abstract:

BACKGROUND: Leukemia comes from the damage to bone marrow microenvironment, and changes in bone marrow microenvironment lead to some effects on biological characteristics and behavior of leukemia cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cells from children with leukemia on K562/AO2 cell line growth, proliferation and apoptosis.
METHODS: K562/AO2 cells were cultured alone in vitro, or co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells from leukemia children. The living cells in the two groups were counted using trypan blue staining, and the cell growth curves were described. PI single staining method was used to detect the cell cycle, and cell apoptosis was detected by V/PI Annexin method in the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: After single suspension culture, the cells showed no marked changes within the first 3 days, but began to proliferate fast at 4 days and reached the proliferation peak at 6 days. Co-cultured cells showed a gentle growth curve with no presence of obvious proliferation peak. Compared with the co-culture group, the proportion of G₀/G₁ phase cells was significantly lower, but the proportion of S phase cells was significantly higher in the single culture group (P < 0.05). The number of cells in the G2/M phase showed no significant difference between the two groups (P > 0.05). All these findings indicate that co-culture with bone marrow mesenchymal stem cells from leukemia children inhibits the proliferation of K562/AO2 cells through G₀/G₁ phase arrest, and also resists apoptosis in K562/AO2 cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Leukemia, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

雷春霞. 白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6112-6117.

Lei Chun-xia. Correlation between growth, proliferation and apoptosis of leukemia cell lines K562/AO2 and bone marrow mesenchymal stem cells in children with leukemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6112-6117.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在武汉市儿童医院新生儿内科实验室完成。

1.3 材料 K562/AO2细胞株均由武汉市儿童医院标本室提供，白血病患儿骨髓标本来自武汉市儿童医院血液科，患儿家属知情同意。研究相关方案经武汉市儿童医院医学伦理部门批准。

主要试剂与仪器：肝素(北京世纪奥科生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(上海时代生物科技有限公司)；Percoll 分离液(北京华夏远洋科技有限公司)；DF-12培养液(北京奥博来科技有限责任公司)；胎牛血清(上海弘顺生物科技有限公司)；青霉素(北京四正柏生物科技有限公司)；地塞米松(上海博谷生物科技有限公司)；表皮生长因子(上海美吉生物医药科技有限公司)；链霉素(上海美季生物技术有限公司)；谷氨酰氨(爱必信(上海)生物科技有限公司)；Annexin V/碘化丙啶凋亡检测试剂盒(北京艾然生物科技有限公司)；二氧化碳培养箱(北京博蕾德科技发展有限公司)；培养板(北京成萌伟业科技有限公司)；倒置显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养与鉴定^[7] 参照《细胞培养技术》进行白血病患儿骨髓间充质干细胞培养。取白血病患儿骨髓液，用肝素抗凝后利用PBS进行等比稀释，于另一离心管中以1︰1比例添加Percoll分离液(1.073 g/mL)，将骨髓液缓慢滴加于Percoll分离液上，离心后收集单个核细胞层，PBS洗涤，去掉上清液，用DF-12培养液(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、10^-⁹ mol/L地塞米松、10 μg/L表皮生长因子、10 U/mL链霉素、0.2 mol/L谷氨酰氨)进行细胞重悬，以1×10¹⁰ L^-¹细胞浓度接种在培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养。培养2 d后半量换液，第5天全量换液，去掉非贴壁细胞，以后每3 d换液1次，当细胞生长达80%-90%融合时进行传代培养，收集第3代细胞，胰蛋白酶消化后进行细胞表面标志物检测CD29，CD90呈阳性表达，并选择第3代细胞用于后续实验^[8]。

1.4.2 实验分组^[9] 实验分2组：①单独培养组：行K562/AO2细胞单独悬浮培养；②共培养组：K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养。

1.4.3 细胞增殖情况检测^[10-12] 收集生长良好的K562/AO2细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，接种在24孔培养板，每孔1 mL，作为单独培养组。第3代白血病患儿骨髓间充质干细胞接种在24孔培养板上，待融合后直接添加1 mL上述K562/AO2细胞悬液，作为共培养组，两组均3 d换液1次，观察细胞增殖情况，连续7 d，每天收集两组K562/AO2细胞进行锥虫蓝染色，计数活细胞数。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，描绘两组细胞生长曲线。

1.4.4 细胞周期与细胞凋亡检测^[13-15] 利用PI单染法检测细胞周期，K562/AO2细胞换用无血清DF-12培养，将白血病患儿骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，⁶⁰Co照射，吸弃上清，接种K562/AO2细胞于白血病患儿骨髓间充质干细胞上，培养48 h收集细胞，PBS洗涤，乙醇固定，添加RNA酶水浴消化，离心，弃上清，添加400 μL 50 mg/L PI，室温避光存放，过滤，上流式细胞仪进行检测。使用Muhicycle分析软件进行细胞周期分析，计算G₀-G₁期，S期和G₂-M期的相对比例。利用Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况，严格按照Annexin V/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作。

1.5 主要观察指标 ①K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞培养结果；②两组K562/AO2细胞生长曲线；③两组K562/AO2细胞周期与细胞凋亡情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 15.0统计软件，组间比较予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓造血微环境不仅影响造血实质细胞的生长、分化，而且也影响白血病细胞的增殖和分化^[16-18]。以往研究发现，白血病骨髓基质细胞黏附功能异常，且出现细胞因子异常分泌的情况，与健康者比较，急性白血病患者的骨髓细胞外基质成分会出现明显的变化^[19]。在白血病细胞的恶性增殖和分化过程中，骨髓基质细胞会发挥出重要的作用。

骨髓间充质干细胞具有多向分化能力，属于骨髓基质细胞的前体细胞^[20-23]。骨髓间充质干细胞不仅对正常造血具有调控作用，也对造血系统恶性肿瘤细胞的增殖和分化以及凋亡等具有重要作用^[24-28]。实验结果发现，单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变，第4天开始细胞增殖速度明显加快，并于培养第6天达到最高峰。共培养组整体增殖曲线较为平缓，无明显的增殖高峰，表明与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后，K562/AO2细胞生长缓慢。此外，细胞周期检测结果显示，单独培养组的G₀-G₁期细胞比例显著低于共培养组，S期细胞比例显著高于共培养组(P < 0.05)，表明与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后，K562/AO2细胞阻滞在G₀-G₁期。以往Lin等^[29]将健康者的骨髓间充质干细胞与K562细胞进行黏附培养，通过观察发现K562细胞增殖受到明显抑制，处于G₀-G₁期的细胞数显著增加，证实了骨髓间充质干细胞会对细胞周期进程产生一定的阻滞作用，此次实验结果与之基本一致，提示抑制K562/AO2细胞增殖是治疗白血病的有效方法，但也是根治该病的重要障碍^[30]。大多数化疗药物主要通过作用于白血病细胞增殖期而发挥出杀伤细胞的作用，达到治疗疾病的目的。如果白血病细胞的细胞周期出现改变，被阻滞在静止期，逃避了化疗药物的杀伤作用，无法获得彻底的治疗效果，导致骨髓微小残留病的发生^[31-33]。

白血病的出现与细胞增殖异常有关，也与细胞的凋亡受到抑制存在十分密切的关系。细胞凋亡是一种主动的程序化细胞死亡过程，会受到多种内源性基因控制^[34]。正常状态下，机体可通过诱导凋亡来清除受损或无生理意义的细胞，有利于机体内环境的稳定，而肿瘤细胞却可通过抑制凋亡来实现自我保护，维持自身的存活，导致各种病变的出现^[35-36]。实验结果显示，单独培养组的细胞凋亡显著高于共培养组(P < 0.05)，表明白血病骨髓间充质干细胞有抵抗白血病细胞凋亡的作用。

综上所述，白血病骨髓间充质干细胞能够延迟白血病细胞周期，抑制其增殖，并能抵抗白血病细胞凋亡，由此推测出白血病骨髓间充质干细胞能够形成白血病干细胞龛室，储备其增殖潜能和自我更新能力，维持其恶性进展^[37-39]，但是关于其具体的作用机制以及相关的细胞信号通路等，还有待在今后予以进一步的分析。