果糖和二硫苏糖醇对骨髓间充质干细胞冻存后活性及多能性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.001

摘要/Abstract

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文题释义：
果糖和二硫苏糖醇：果糖是一种常见的己酮糖，已有研究发现，果糖预处理可以增加细胞碱性磷酸酶水平，提高冻存细胞的活性和能量状态。二硫苏糖醇是一种抗氧化物质，可通过加速分解培养基中产生的H2O2防止细胞毒性，在细胞冻存中作为冷冻保护剂提高细胞的活性。
低温保存技术：是一种广泛采用的长时间保存生物样本的方法。一般是将活的生物体采用特殊的方法冷却至低温(一般为-196 ℃)，并长期保存。待需要时，可将生物体按照特殊的方法加热至正常温度，仍可获得存活的生物体。该方法是贮藏细胞及保存细胞特性的有效方法。

摘要
背景：冻存是保证干细胞临床应用的关键步骤之一，但现有冻存技术常导致细胞活性降低、多能性丧失及分化能力下降。
目的：探究果糖及二硫苏糖醇是否有助于维持冻存后骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化潜能。
方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，在细胞冻存前分别用果糖(200 μmol/L)，二硫苏糖醇 (500 μmol/L)及果糖(200 μmol/L)+二硫苏糖醇(500 μmol/L)预处理1 h。冻存6个月后，复苏细胞并用倒置显微镜观察细胞形态，MTT实验检测细胞活性，定量PCR检测相关干性基因(Nanog，Oct4及Sox2)的表达，碱性磷酸酶活性测试及茜素红染色检测复苏骨髓间充质干细胞成骨分化能力。
结果与结论：①复苏后各组细胞在形态上无明显差别；②果糖预处理及联合预处理有助于骨髓间充质干细胞活性维持；③二硫苏糖醇预处理可显著促进骨髓间充质干细胞多能性相关基因Nanog及Sox2的表达；④果糖、二硫苏糖醇及联合预处理皆有助于维持骨髓间充质干细胞成骨分化潜能，但以二硫苏糖醇及联合预处理组效果最佳；⑤结果表明，果糖预处理有助于维持冻存骨髓间充质干细胞活性，二硫苏糖醇有助于维持冻存骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2511-5851(郑欣桐)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 果糖, 二硫苏糖醇, 骨髓间充质干细胞, 细胞冻存, 细胞活性, ；多能性, 成骨分化, 抗氧化

Abstract:

BACKGROUND: Cell cryopreservation is required for clinical use of stem cells, and the current process of cryopreservation however may be harmful to cell viability, pluripotency and differentiation capacity.
OBJECTIVE: To explore the effect of fructose and dithiothreitol on pluripotency and osteogenesis of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the bone marrow of Sprague-Dawley rats and pretreated with fructose (200 μmol/L), dithiothreitol (500 μmol/L) or combined components before cryopreservation. Then the cells were cryopreseved for 6 months and the morphology of cells was observed by inverted microscopy. The cell viability was evaluated by MTT, and real-time PCR was used to detect the mRNA expression of Nanog, OCT4 and Sox2. Alkaline phophatase activity assay and alizarin red staining were utilized to detect the osteogenic capacity of bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Images captured by inverted microscopy showed no significant difference in cell morphology between groups. The MTT results indicated that fructose and combined pretreatment could promote the cell viability of bone marrow mesenchymal stem cells after cryopreservation, while the real-time PCR results demonstrated that dithiothreitol significantly facilitated the expression of Naogo and Sox2 in bone marrow mesenchymal stem cells. Moreover, ALP activity assay and alizarin red staining confirmed the positive effects of fructose, dithiothreitol and combined pretreatment on osteogenic capacity of bone marrow mesenchymal stem cells after cryopreservation, and the best effects were found after pretreatment with dithiothreitol and combined components. Overall, these findings indicate that fructose pretreatment is beneficial for cell viability of cryopreseved bone marrow mesenchymal stem cells, and dithiothreitol contributes to maintaining the pluripotency and osteogenesis capacity of cryopreseved bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Freezing, Fructose, Dithiothreitol, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郑欣桐，刘钦，张璟霞，罗庆，陈哲，宋关斌. 果糖和二硫苏糖醇对骨髓间充质干细胞冻存后活性及多能性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6085-6091.

Zheng Xin-tong, Liu Qin, Zhang Jing-xia, Luo Qing, Chen Zhe, Song Guan-bin. Effect of fructose and dithiothreitol on cell viability and pluripotency of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6085-6091.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞复苏后形态学观察 复苏细胞贴壁24 h后，倒置显微镜下观察可见细胞仍呈长梭态，符合骨髓间充质干细胞一般形态特征，见图1。进一步发现果糖、二硫苏糖醇或果糖+二硫苏糖醇联合处理组细胞整体形态与对照组无明显差别。

2.2 复苏骨髓间充质干细胞活性 利用MTT实验检测骨髓间充质干细胞冻存后细胞活性，结果显示果糖或果糖+二硫苏糖醇预处理有助于冻存后细胞活性维持，与对照组比较差异有显著性意义，但保护程度有限。二硫苏糖醇单独预处理对冻存后细胞活性维持无明显促进作用，见图2。

2.3 复苏骨髓间充质干细胞多能性基因表达 定量PCR结果显示，二硫苏糖醇预处理有助于骨髓间充质干细胞冻存后Nanog基因表达，而果糖预处理无明显作用，见图3A。果糖或二硫苏糖醇预处理对骨髓间充质干细胞冻存后Oct4基因的表达无显著影响，见图3B。二硫苏糖醇亦促进了冻存骨髓间充质干细胞复苏后Sox2基因的表达，见图3C。

2.4 复苏骨髓间充质干细胞成骨分化潜能 经成骨诱导体系诱导7 d，检测各组细胞碱性磷酸酶活性。与对照组相比，果糖、二硫苏糖醇及果糖+二硫苏糖醇预处理均可一定程度上调复苏骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性，其中果糖+二硫苏糖醇预处理组效果最为明显(P < 0.05)，见图4。成骨诱导14 d时，茜素红染色结果显示，果糖、二硫苏糖醇及果糖+二硫苏糖醇预处理可明显促进钙节点形成，体现为钙节点数量增多、面积(团块状)增大，其中二硫苏糖醇及果糖+二硫苏糖醇组尤为明显，见图5。因碱性磷酸酶活性及钙节点分别是骨髓间充质干细胞成骨分化的早期及晚期标志，故以上结果说明果糖+二硫苏糖醇预处理可有效维持冻存骨髓间充质干细胞成骨分化能力。

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引言

骨髓间充质干细胞属于中胚层的一类多能干细胞，在不同理化环境和细胞因子的诱导下，可向成骨、软骨、脂肪和纤维细胞系等多方向分化^[1-2]。骨髓间充质干细胞具有易分离培养和体外扩增、免疫原性弱、移植后不发生免疫排斥反应和不涉及伦理等特点，是最具前景的组织工程种子细胞之一^[3-4]。为广泛开展骨髓间充质干细胞临床治疗，需长期低温保存骨髓间充质干细胞。如何在体外将骨髓间充质干细胞有效冻存，减少其冷冻损伤，是骨髓间充质干细胞临床应用的关键技术环节之一。

细胞冷冻保存需要首先将细胞降温，随着温度的下降，细胞内外会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器损伤^[5-8]。如何最大限度提高冷冻复苏后骨髓间充质干细胞的细胞活性，并具有相当的增殖和分化能力，是目前仍需要解决的问题。细胞低温冻存方法主要有2种，分别是慢速冷冻法及快速冷却非晶态固化法(玻璃化法)^[9-11]。玻璃化法虽然可在降温过程中部分或者完全避免细胞内外冰晶的形成，但其技术仍不成熟，诸多问题需要解决，例如玻璃化保护剂的选择、反玻璃现象及低温断裂避免等^[12-14]。大多数慢速冷冻法的研究主要是探索最佳的冷冻速率、寻求高效低毒的冷冻保护剂浓度和组合、冻存细胞的容器、复苏方法等^[15-18]，关于如何增强细胞抗冷冻损伤能力的研究较少。因此，实验拟对常规冻存体系进行改进，探究果糖及二硫苏糖醇预处理是否有助于维持骨髓间充质干细胞冻存后的多能性及成骨分化潜能。

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2015年1至10月在重庆大学生物工程学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性Sperague-Dawley(SD)大鼠6只，3周龄，体质量150-200 g，SPF级，购买于重庆医科大学动物实验中心。

1.3.2 主要试剂及设备 DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco)；噻唑蓝、RNA提取试剂盒、qPCR试剂盒(Bioteke)；地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、茜素红S、果糖、二硫苏糖醇(Sigma)；二甲基亚砜、碱性磷酸酶活检测试剂盒(碧云天)；超净工作台(上海博讯实验有限公司)；细胞培养箱(Thermo fisher)；倒置显微镜(Olympus)；L530型低速常温离心机(湖南湘仪)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养 取SD大鼠，断颈法处死，乙醇浸泡大鼠10 min。在超净工作台中提取大鼠后肢股骨和胫骨，去除周围肌肉组织，用10 mL注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清的培养基，冲洗骨髓腔3-5次，轻轻吹打培养基将细胞吹散，用移液枪吸取5 mL分别接种于2个25 cm²的细胞培养瓶，24 h更换培养液1次，以后每2 d换液1次，待细胞生长融合、铺满培养瓶底壁的80%-90%时，即可进行传代培养。

1.4.2 骨髓间充质干细胞预处理、冻存及复苏

预处理：取生长良好的第2代大鼠骨髓间充质干细胞，在超净工作台内倒去旧的培养基，用移液管吸取少量PBS轻柔冲洗培养瓶底壁2遍，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，加入5 mL完全培养基终止消化，并用滴管吹打制成单细胞悬液；用滴管将细胞悬液转至1.5 mL离心管内，置于离心机内1 000 r/min离心5 min，倒掉上清，分别加入完全培养基、完全培养基+果糖(200 μmol/L)、完全培养基+二硫苏糖醇(500 μmol/L)及完全培养基+果糖+二硫苏糖醇，小心吹打制成细胞悬液，放置于孵箱预处理1 h。

冻存：离心收集细胞，取刚配制好的含有10%二甲基亚砜及体积分数为20%胎牛血清的培养基加入离心管内，混匀并分装至冻存管内，用封口膜严格封口后，记号笔标记冻存日期。将冻存管放入冰箱内，4 ℃保存10 min后转入-20 ℃保存30 min，转至-80 ℃冰箱内隔夜，将含有骨髓间充质干细胞的冻存管转移入液氮罐中继续保存，冻存时间为6个月。

复苏：从液氮罐取出冻存管，检查冻存管盖是否旋紧后，立即放入37 ℃恒温水浴箱快速解冻，复温过程中轻轻摇冷冻管使其在1 min内全部融化解冻，用体积分数为75%医用乙醇擦拭冻存管，移入超净工作台继续操作。用移液管将刚复苏的细胞悬液移入离心管内，离心去除上清，再用5 mL完全培养基制成细胞悬液并分装至25 cm²的细胞培养瓶。

1.4.3 细胞活性测定 将计数后的各组细胞悬液加入96孔板中，每孔5×10³个细胞，待细胞贴壁24 h后，弃去96孔板内培养基并用PBS清洗，加入含5 g/L MTT的DMEM培养基继续培养4 h，弃去培养液，加入100 μL二甲基亚砜振荡溶解结晶物。以630 nm为参照，测量570 nm处的吸光度，根据吸光度测定相对细胞活性。

1.4.4 细胞多能性基因的检测 分别收集各组细胞，利用RNA提取试剂盒提取RNA并测浓度，A₂₆₀/A₂₈₀要求在1.8-2.0之间，利用反转录试剂盒将RNA合成为cDNA，通过实时荧光定量PCR仪，在mRNA水平检测Oct4、Sox2及Nanog 3种基因表达情况(引物见表1)，以GAPDH为内参。循环程序采用两步法：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火延伸30 s，反应39个循环，每完成1次循环，采集1次荧光信号。

1.4.5 成骨细胞的诱导 取冻存6个月骨髓间充质干细胞，复苏后制成单细胞悬液，接种于6孔板内(细胞数量1×10⁵)，常规培养48 h后，换成骨诱导培养基(1×10^-⁸ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸及含体积分数10%胎牛血清的DMEM)，连续培养14 d，每隔3 d换液1次。
1.4.6 碱性磷酸酶活性测定 成骨诱导至7 d，弃去培养液，PBS洗2次，室温加0.2% Triton X-100裂解液1 h，倒置显微镜下观察到细胞完全裂解后，利用碱性磷酸酶试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性。
1.4.7 茜素红染色 成骨诱导至14 d，弃去培养液，PBS洗2次，利用40 g/L多聚甲醛固定15 min，双蒸水洗3次，0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)于37 ℃下染色 30 min，弃去染色液，双蒸水清洗3次，风干，照相机拍照。
1.5 主要观察指标 ①细胞活性；②干性标志基因mRNA相对表达量；③碱性磷酸酶活性；④钙节点形成量。

1.6 统计学分析 使用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据用x(_)±s表示，组间比较应用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

细胞冻存对各种细胞及组织都能引起破坏作用。细胞在冻存过程中经历包括液体溶液的固化过程和水分子通过细胞膜的渗透过程，在此过程中的溶液冰晶形成、生长，高渗透压和防冻剂都会对细胞造成损害^[19-20]。已有研究亦证实随着冻存时间的延长，人骨髓间充质干细胞活性会不断降低^[21]。骨髓间充质干细胞作为成体干细胞，可分化为脂肪细胞、成骨细胞和肌细胞等多种细胞^[22]。骨髓间充质干细胞亦同时具有分泌多种细胞因子和参与免疫调节反应的作用，因此常作为移植和治疗的首选干细胞源性细胞^[23-24]。果糖是一种常见的己酮糖，已有研究发现，果糖预处理可以增加干细胞碱性磷酸酶水平，提高冻存干细胞的活性和能量状态^[25]。另有研究证实，二硫苏糖醇是一种抗氧化物质，可通过加速分解培养基中产生的H₂O₂防止细胞毒性，在干细胞冻存中作为冷冻保护剂提高干细胞的活性^[26]。这些研究结果提示，果糖和二硫苏糖醇对冻存细胞的活性和功能维持具有重要的保护作用。

实验中采用果糖、二硫苏糖醇及果糖+二硫苏糖醇预处理骨髓间充质干细胞并冻存，复苏后显微拍照显示细胞长梭状，并伴有漩涡生长特点，符合一般骨髓间充质干细胞形态特征^[27]，各组细胞形态无明显变化。为进一步探究各组细胞活性的差别，对复苏骨髓间充质干细胞进行MTT实验，结果显示果糖及果糖+二硫苏糖醇联合预处理皆促进了骨髓间充质干细胞冻存后细胞活性，与对照组比较差异有显著性意义，证实果糖在保护冻存骨髓间充质干细胞活性方面的积极作用，但果糖及果糖+ 二硫苏糖醇处理组细胞活性上调程度很低，说明效能有限。

Oct4、Sox2及Nanog是干细胞调控网络中的重要转录因子，它们之间复杂的相互作用维持干细胞多能性和自我更新能力。Oct4基因是POU转录因子家族中的一员，能够抑制分化基因、促进多能性基因的表达^[28]。Sox2基因常被作为一种多能性细胞谱系的分子标记，该基因在成体组织细胞中表达并具有广泛的调节作用，特别是保护组织稳定性的作用^[29]。因此，Sox2可作为一个共同的干性基因，调控不同类型干细胞和组织的自我更新。Nanog基因与Oct4及Sox2一样，在早期胚胎发育和维持干细胞自我更新和多能性方面起着重要作用，其通过调节Gata6、Gata4、Oct4、Sox2及其他因子的表达来维持干细胞的自我更新^[30]。为检测果糖及二硫苏糖醇预处理对冻存骨髓间充质干细胞复苏后多能性及自我更新能力的影响，实验利用定量PCR检测Nanog、Oct4及Sox2基因的表达，结果显示，二硫苏糖醇预处理可明显上调冻存骨髓间充质干细胞复苏后Nanog及Sox2基因的相对表达，果糖预处理没有明显作用，推测二硫苏糖醇通过与自由基作用，防止脂质过氧化或修复过氧化物，提高了冻存骨髓间充质干细胞复苏后自我更新能力和多能性。

为检测冻存骨髓间充质干细胞复苏后向成骨细胞分化的能力，对复苏骨髓间充质干细胞进行成骨诱导。目前认为，碱性磷酸酶和钙节点的形成是向成骨细胞分化的主要前期及后期标志。实验针对上述指标进行验证，结果显示二硫苏糖醇及果糖+二硫苏糖醇预处理可明显促进碱性磷酸酶活性及钙节点的形成，其中以果糖+二硫苏糖醇预处理组结果最为显著，这些证据均表明果糖+二硫苏糖醇预处理可有效促进冻存骨髓间充质干细胞复苏后向成骨分化的能力。

总之，实验验证了果糖预处理有助于维持冻存骨髓间充质干细胞活性，而二硫苏糖醇可有效促进冻存骨髓间充质干细胞多能性维持，果糖+二硫苏糖醇联合预处理可明显增强冻存骨髓间充质干细胞复苏后成骨分化能力，这为骨髓间充质干细胞冻存提供了一种新策略。