中药川芎对成骨细胞作用最佳浓度的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
川芎嗪：是从中药川芎中分离的一种生物碱，即四甲基吡嗪，无色针状结晶，具有特殊异臭，现已人工合成。川芎嗪具有解痉镇痛、扩张冠状动脉、改善微循环、抗血小板聚集等多种作用。
口腔正畸学的机制：是通过一定的外力作用在牙齿上，引起局部牙槽组织产生相应的变化，这种骨组织的改变主要是牙槽骨表面的成骨细胞和破骨细胞相互作用产生的生物力学反应的过程，其中成骨细胞能够调节破骨细胞在骨表面附着，同时参与破骨细胞的分化成熟，成骨细胞是骨组织在形成、生长和发育过程中的主要功能细胞。

摘要
背景：已有研究报道中药川芎具有促进成骨细胞增殖及分化的作用。
目的：进一步观察中药川芎中川芎嗪成分对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达的作用。
方法：以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为研究对象，在1，5，10，15，20 mg/L 5个不同质量浓度川芎嗪干预下分别应用CCK-8方法测定成骨细胞增殖能力，酶联免疫法测定碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原蛋白表达。
结果与结论：①1，5，10，15，20 mg/L川芎嗪对成骨细胞的增殖均有促进作用，与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.005)；②1，5，10，15，20 mg/L川芎嗪可以提高成骨细胞内碱性磷酸酶活性，其中1，5，10 mg/L川芎嗪组与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.005)，15，20 mg/L川芎嗪组与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.005)；③1，5，10，15，20 mg/L川芎嗪均促进Ⅰ型胶原蛋白表达，与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.005)；④结果表明，中药川芎提取物川芎嗪对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达均有促进作用，质量浓度为10 mg/L效果理想。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3647-510X(赵刚)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 川芎嗪, 成骨细胞, 细胞增殖, 碱性磷酸酶, Ⅰ型胶原蛋白

Abstract:

BACKGROUND: It has been proved that Rhizoma Chuanxiong can promote osteoblast proliferation and differentiation.
OBJECTIVE: To further observe the effects of tetramethylpyrazine (Ligustrazine) extracted from Rhizoma Chuanxiong on osteoblast proliferation and type I collagen expression.
METHODS: Mouse osteoblast cell line MC3T3-E1 was cultured in medium containing 1, 5, 10, 15 and 20 mg/L Ligustrazine, respectively. Osteoblast proliferation was detected by cell counting kit-8 assay, and alkaline phosphatase activity and type I collagen level measured using ELISA method.
RESULTS AND CONCLUSION: Different concentrations of Ligustrazine all significantly promoted the osteoblast proliferation and type I collagen level compared with the blank control group (P < 0.005). The activity of alkaline phosphatase in all Ligustrazine groups except 15 and 20 mg/L groups was significantly higher than that in the blank control group (P < 0.005). These results show that Ligustrazine isolated from Rhizoma Chuanxiong can effectively promote the osteoblast proliferation and type I collagen expression, with the optimum concentration of 10 mg/L.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoblasts, Cell Proliferation, Alkaline Phosphatase, Collagen Type I, Drugs, Chinese Herbal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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Lu Wei, Guo Rui, Zhao Gang. Effects and optimum concentration of Rhizoma Chuanxiong on osteoblasts in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5483-5488.

图/表（结果） 3

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引言

近几年来随着人们生活条件和文化水平日益的提高，对于口腔牙齿整齐和美观的需求越来越高，促进了口腔正畸学的快速发展，对于如何减轻患者治疗过程中的疼痛，缩短疗程，防止复发已是一个重要问题。口腔正畸学的机制是牙槽骨表面的成骨细胞和破骨细胞相互作用的生物力学反应过程^[1]。牙齿的移动是正畸力作用于牙齿，引起牙槽骨的改建，这在牙齿移动的速度和治疗效果的稳定性中起着关键作用。20世纪70年代末就有国内外学者对此进行了大量的研究，从物理疗法运用激光、超声、磁疗、超短波等手段，到全身或局部应用激素及细胞因子类药物等方法来解决这些问题^[2]，但由于操作复杂、安全性差、费用昂贵，临床中难以推广。

中国的中医药学历史悠久，几千年来积累的丰富理论基础、临床实践经验、广泛的临床用途、明显的治疗效果，得到学者的关注。中药具有标本兼治，不良反应小、价格低廉等优点，已被广大患者接受。现已有很多学者将中药对成骨细胞作用的研究应用到正畸牙齿的移动、牙周炎、牙槽骨缺损重建等一些临床疾病的治疗上。它们普遍具有改善牙周组织血液循环，促进成骨细胞生长和牙槽骨骨小梁改建的作用^[3-4]。刘侃^[5]研究了10种中草药对牙移动的作用，结果表明灯盏花能在压力侧显著促进牙槽骨吸收，骨碎补在张力侧发挥积极的成骨作用。薛京伟等^[6]对补肾和血中药在口腔正畸中临床应用的研究结果表明，用药后30 min症状逐渐缓解，疼痛发生的时间和程度有逐渐减轻的趋势。丛淑敏等^[7]研究表明灌服中药骨碎补、丹参可加快正畸牙齿的移动，减缓牙槽骨密度的降低。目前，关于中药对于成骨细胞的研究大多为葛根素、骨碎补、丹参、川续等较多。中药川芎提取物川芎嗪对小鼠成骨细胞作用的研究较少。已有文献报道含有川芎的联合方剂可以用于治疗牙痛^[8-9]。杨艳^[10]研究了中药八珍汤对大鼠炎症牙周骨组织的影响，结果表明该方剂有利于牙周炎患者的正畸治疗和控制骨的改建，其中一味中药川芎具有活血健骨、镇静止痛之功效。还有文献报道中药川芎提取物川芎嗪具有预防骨质疏松及解痉镇痛等作用，其药理作用在预防疾病和治疗疾病方面也得到广泛的认可，对其研究也越来越深入^[11-13]。中医认为 “肾主骨”、“肾生骨髓”、“肾藏精”，具有促进骨髓生长、发育、修复的作用。“齿者，肾之”，齿与肾的功能紧密相连^[14]。

古有记载“齿为骨之余，故肾中精气充沛，则牙齿坚固，不易松动脱落”。所以在治疗牙齿疾病时多采用补肾实阴、活血化淤的药物进行调理，以达到滋阴补肾、消炎止痛、活血通络的作用。以往对中药的研究往往停留在成分复杂的提取液或者复方制剂的药理作用，很难揭示具体的作用机制。随着现代制药技术的发展，提取、分离、纯化技术的成熟，越来越多的中药有效成分被分离纯化出来。川芎属于伞形科植物范畴，始载于《神农本草经》被列为上品。川芎这种草本植物属多年草。根部茎部生长最好，并且这种纯植物草药在国内分布广泛，成本较低，十分符合患者需求。在民间有许多关于川芎的方剂，多用于安抚神经，治疗头风头痛等疾症。而川芎嗪是从中药川芎中分离得到的有效活性成分，是一种吡嗪类生物碱单体，其化学结构为四甲基比嗪，现已人工合成。川芎嗪具有解痉镇痛、扩张冠状动脉、改善微循环、抗血小板聚集等多种作用，临床上已用于治疗脑血管疾病、偏头痛、动脉粥样硬化、冠心病心绞痛、心肌梗死、高血压等多种疾病用途广泛。

根据这一理论，实验研究不同质量浓度川芎嗪对小鼠成骨细胞株MC3T3-E1增殖，碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响^[15-16]。实验结果表明川芎嗪对成骨细胞增殖及分化功能有促进作用，药物质量浓度为10 mg/L时作用明显。

该实验研究将传统中医药学与现代化研究手段相结合，将中药材运用到口腔正畸治疗过程中可缩短疗程，提高治疗效果，拓展了中药的作用及临床使用范围。

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材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点于2015年3至11月在佳木斯大学医学院生命科学研究实验室完成。

1.3 材料小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1，Subclone14)由上海生命科学研究院提供。

川芎嗪干预成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达实验所用试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM培养基、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液、胎牛血清	美国Hyclone公司
二甲基亚砜	美国Sigma公司
青链霉素溶液	美国 Invitrogen公司
CCK-8试剂盒	上海博古生物科技有限公司
碱性磷酸酶试剂盒	南京建成生物工程研究所
盐酸川芎嗪标准品	中国药品生物制品检定所
小鼠Ⅰ型胶原酶联免疫分析试剂盒	上海岚派生物科技有限公司
倒置显微镜	日本Olympus公司
酶标仪	日本TaKaRa公司
AIRTech超净工作台	苏净集团安奉公司
HEPACLASS100CO₂培养箱	美国Themofomma公司
自动高压蒸汽消毒器	日本SANYO公司
恒温水浴箱	北京六一仪器厂
低温高速离心机	日本TOMYGRX-220

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养将小鼠成骨细胞株MC3T3-E1接种于含有双抗的DMEM培养液中，在体积分数为5%CO₂，湿度95%，恒温37 ℃ CO₂培养箱中培养，每2 d更换1次培养液，当细胞生长到大部分覆盖瓶底壁时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.4.2 药品制备将纯度≥ 99%盐酸川芎嗪标准品用二甲基亚砜溶解后滤膜过滤。为避免二甲基亚砜造成细胞损伤，其浓度必须≤1%，然后用无血清DMEM培养液采用对倍稀释法将川芎嗪溶液配制成1，5，10，15，20 mg/L 5种不同质量浓度备用。

1.4.3 成骨细胞增殖测定将加入1，5，10，15，20 mg/L川芎嗪溶液作为实验组，加入DMEM培养液作为空白对照组，设5个复孔。调节细胞悬液的细胞浓度为 1×10⁷ L^-1，每孔100 μL溶液接种于96孔板，接种24 h待细胞贴壁后换成加入药物的培养液，药物作用1，2，3 d后按CCK-8试剂盒方法检测实验组与对照组细胞增殖率，具体步骤参照说明书，多功能酶标仪读取波长 450 nm处吸光度值。

1.4.4 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测将加入1，5，10，15，20 mg/L川芎嗪溶液作为实验组，加入DMEM培养液作为空白对照组，设5个复孔。调节细胞悬液的细胞浓度为1×10⁷ L^-1接种于96孔板，待24 h细胞贴壁后换成加入药物的培养液，作用2，4，6 d后按试剂盒要求加入试剂进行碱性磷酸酶活性检测。

1.4.5 成骨细胞Ⅰ型胶原含量测定将加入1，5，10，15，20 mg/L川芎嗪溶液作为实验组，加入DMEM培养液作为空白对照组，设5个复孔。调节细胞悬液的细胞浓度为1×10⁷ L^-1接种于96孔板，待24 h细胞贴壁后换成加入药物的培养液，作用48 h后进行加样，温育，洗涤，加酶结合物工作液，再温育，洗涤，加入底物溶液15 min后加终止液，立即用多功能酶标仪读取波长450 nm处吸光度值，详细步骤按ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.5 主要观察指标 ①川芎嗪对成骨细胞增殖的影响；②川芎嗪对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响；③川芎嗪对成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析利用 SPSS 20.0对数据进行方差分析检验及LSD检验，实验数据均以x(_)±s表示，α=0.05为检验水准，P < 0.05 为差异有显著性意义。

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讨论

最近几年，诸多国内外学者实验性采取不同方法加快牙齿移动过程中牙周组织的改建速度，以希望达到快速移动矫正牙齿，同时不易复发的目的。因此凡是理论上能够影响骨组织改建的药物都可以改变正畸治疗过程中牙齿移动的速度，其中能够促进骨代谢的药物可以加快牙齿的移动，而抑制骨代谢的药物则可增加支抗力量，所以在临床治疗过程中要合理使用这些药物，可以通过局部注射药物等方法达到减轻疼痛、增强支抗、缩短疗程、防止治疗后复发的目的^[17]。

随着中医中药事业飞速的发展，中药的广泛应用，中药对成骨细胞作用的研究也成为了热点^[18-20]。成骨细胞具有合成分泌骨基质的作用，通过钙化机制形成骨组织，是骨发生和骨形成的重要功能细胞。骨组织的改建是成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收的动态平衡的调节，而破骨细胞的活动受成骨细胞的调控，因此关于成骨细胞的研究意义重要。成骨细胞在骨发育过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。早期的成骨细胞增殖主要表现为成骨细胞数量及细胞活力增加，逐渐形成多层细胞^[21-22]。第二阶段是细胞外基质成熟分化期。在增殖期末开始出现与增殖相关的基因表达逐渐降低，与细胞外基质成熟的相关基因逐渐活跃，碱性磷酸酶此时表达明显加强，在骨形成过程中可以水解无机焦磷酸盐，清除钙化抑制物，促进骨组织的钙化和成骨的顺利进行，在骨组织的成熟和分化过程中发挥着重要作用。第三阶段是骨细胞外基质矿化期，与羟基磷灰石相关的基因表达至高峰，而碱性磷酸酶活性明显降低。第四阶段是成骨细胞凋亡期。在矿化晚期出现骨钙素逐渐降低，而胶原酶开始渐渐升高，出现了代偿性的细胞增殖与胶原合成，促使成骨细胞开始出现凋亡。

MC3T3-E1细胞株是1981年日本学者Kadama等由新生C57BL/6小鼠颅顶骨中分离培养所建立的成骨细胞株^[23]，该细胞株具备体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等，国际上常作为骨代谢研究的细胞模型^[24]。传统意义上成骨细胞主要来源于活体组织的原代细胞培养，这样更接近生物体内的生理状况^[25]。原代细胞体外培养易受取材条件和培养环境等多种因素的干扰，会对细胞增殖、分化等特性产生影响。此外，不同批次取得的原代细胞往往无法保持遗传稳定性^[26]，因此选用了增殖稳定、可连续体外培养的成骨细胞株MC3T3-E1作为研究对象。

成骨细胞是由间叶质干细胞分化而来，它是骨形成、发育与生长的主要功能细胞，也是骨代谢过程中的主要细胞，对于维持骨代谢的平衡及骨架的结构稳定都非常重要^[27-28]。它还参与了破骨细胞的分化和成熟，所以在局部组织中成骨细胞通过自身分泌或旁分泌作用促进有功能的细胞数目增加和提高分化功能^[29]，使其更好的发挥作用。实验通过CCK-8法检测了5组不同质量浓度川芎嗪溶液作用1，2，3 d成骨细胞的增殖活性，实验结果表明川芎嗪对成骨细胞增殖有促进作用，随着时间推移作用增强。

成骨细胞的分化包括细胞外基质的合成、矿化、成熟，整个过程中成骨细胞特异性地合成一些蛋白，参与细胞外基质的合成矿化、成熟^[30]。成骨细胞的分化能力是骨形成的关键。碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，参与骨代谢过程，在骨形成过程中可以水解磷酸酯为羟基磷灰石的沉淀提供磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除对骨盐形成的抑制作用，促进矿化，利于成骨的顺利进行。碱性磷酸酶活性的表达是成骨细胞分化的特异性标志^[31-33]，为成骨细胞分化的早期指标之一，它随着细胞分化的发展而表达加强，因此它的活性可以代表成骨细胞分化的活性^[34]。实验采用酶联免疫方法检测碱性磷酸酶活性，结果表明川芎嗪对成骨细胞碱性磷酸酶的活性有促进作用，但随药物作用时间的延长第6天时作用减弱。

骨矿化组织的有机基质则主要是由胶原蛋白与非胶原蛋白构成。胶原蛋白是一种多糖蛋白，是细胞外基质的主要组成成分^[35]。胶原蛋白中最主要的是Ⅰ型胶原蛋白，它是人体中含量最丰富表达最广泛的蛋白质^[36]，是骨、皮肤、血管、韧带、肌腱、牙体组织的主要成分，其表达具有特异性的特点。Ⅰ型胶原蛋白是骨组织形成和改建过程中重要的胶原蛋白，它对构建骨组织结构的完整性以及维持其生物力学特性都发挥了非常重要的作用^[37-38]，是成骨细胞分化的中期标志。实验采用小鼠Ⅰ型胶原ELISA试剂盒检测5组不同质量浓度川芎嗪溶液对Ⅰ型胶原蛋白的表达，结果表明5组质量浓度川芎嗪均能刺激Ⅰ型胶原蛋白的分泌。

综上所述，川芎嗪对小鼠成骨细胞株MC3T3-E1增殖、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原蛋白表达均有促进作用，10 mg/L是促进成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达的理想质量浓度。实验从细胞生物学角度研究了川芎嗪对小鼠成骨细胞增殖及分化的作用，这为动物实验及临床研究提供了具体准确的依据。今后仍需在此基础上进行更为深入的基因表达等方面的探讨。

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