α-硫辛酸联合神经生长因子可促进股骨骨折的愈合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.001

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
α-硫辛酸：是一种兼具脂溶性与水溶性的万能抗氧化剂，更是自由基捕手，广泛用于治疗糖尿病性神经病或神经系统并发症，同时又是广泛使用的养颜美容抗老化营养剂。最近一些回顾性研究发现长期使用α-硫辛酸能明显减少绝经后妇女骨量的丢失，因而α-硫辛酸在骨代谢中的有益作用引起了一些研究者的兴趣。
神经生长因子：是较早被发现的一种具有神经营养、发育、再生等多种生物学功能的神经营养因子，已经作为药品用于治疗神经系统损伤及疾病。神经生长因子在骨生长、修复中也发挥重要作用，对于它促进骨折修复的研究已经取得了一些进展。

摘要
背景：骨折愈合过程中，除需要适当的生物力学环境外，细胞因子的作用也日益引起重视。
目的：观察神经生长因子联合α-硫辛酸治疗对大鼠股骨骨折愈合的影响。
方法：建立SD大鼠股骨骨折模型，将72只大鼠随机分为3组：对照组肌肉注射生理盐水；神经生长因子治疗组肌肉注射神经生长因子200 ng/kg，1次/d；联合治疗组肌肉注射神经生长因子200 ng/kg，口服α-硫辛酸25 mg/kg，1次/d。给药后1，2，3周测量骨痂体积，ELISA检测血清骨形态发生蛋白2水平，Western blot检测骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白的表达，半定量RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达。
结果与结论：①给药后1周，3组间骨痂量无明显差异，神经生长因子治疗组和联合治疗组血清骨形态发生蛋白2水平、骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达、血管内皮生长因子mRNA表达均明显高于对照组(P < 0.05)，但两组间差异无显著性意义；②给药后2周，神经生长因子治疗组和联合治疗组骨痂量、血清骨形态发生蛋白2水平、骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达、血管内皮生长因子mRNA水平均明显高于对照组(P < 0.05)，而且联合组高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)；③给药后3周，神经生长因子治疗组血清骨形态发生蛋白2水平、骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达、血管内皮生长因子mRNA明显下降，但联合治疗组仍维持较高水平，明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)；④结果表明，神经生长因子联合α-硫辛酸比单纯神经生长因子对大鼠股骨骨折愈合的治疗作用更明显。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3290-3584(刘建军)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 神经生长因子, α-硫辛酸, 骨折, 骨愈合, 骨形态发生蛋白2, 血管内皮生长因子, 骨折模型

Abstract:

BACKGROUND: During fracture healing, in addition to the need for appropriate biomechanical environment, the role of cytokines is also increasingly attracted attention.
OBJECTIVE: To study the effect of nerve growth factor and alpha-lipoic acid on fracture healing in rat models of femoral fracture.
METHODS: Sprague-Dawley rat models of femoral fracture were established. Seventy-two rats were randomly divided into three groups. In the control group, rats were intramuscularly injected with physiological saline. In the nerve growth factor group, rats were intramuscularly injected with nerve growth factor 200 ng/kg, once a day. In the combined therapy group, rats were intramuscularly injected with nerve growth factor 200 ng/kg and orally taken alpha-lipoic acid 25 mg/kg, once a day. At 1, 2 and 3 weeks after administration, bony callus volume was measured. Enzyme linked immunosorbent assay was used to measure serum bone morphogenetic protein-2 levels. Western blot assay was utilized to detect bone morphogenetic protein-2 protein expression at the broken end of fracture. Semi-quantitative RT-PCR was applied to examine vascular endothelial growth factor mRNA expression.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 1 week after administration, no significant difference in bony callus volume was detected among the three groups. Serum bone morphogenetic protein-2 level, bone morphogenetic protein-2 protein expression, and vascular endothelial growth factor mRNA expression were significantly higher in the nerve growth factor group and combined therapy group compared with the control group (P < 0.05), but no significant difference was found between the two groups. (2) At 2 weeks after administration, the amount of callus, serum bone morphogenetic protein-2 levels, bone morphogenetic protein-2 protein expression, and vascular endothelial growth factor mRNA levels were significantly higher in the nerve growth factor group and combined therapy group compared with the control group (P < 0.05). Above expression levels were higher in the combined therapy group than in the nerve growth factor group (P < 0.05). (3) At 3 weeks after administration, serum bone morphogenetic protein-2 levels, bone morphogenetic protein-2 protein expression, and vascular endothelial growth factor mRNA levels were significantly decreased in the nerve growth factor group. However, above expression levels were still high in the combined therapy group, and significantly higher than in the nerve growth factor group (P < 0.05). (4) These results indicate that nerve growth factor combined with alpha-lipoic acid had better effects on the fracture healing compared with the nerve growth factor alone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Nerve Growth Factor, Thioctic Acid, Femoral Fractures, Bone Morphogenetic Proteins, Vascular Endothelial Growth Factors, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘建军，黄亮，韩庆斌，李新志，阙祥勇. α-硫辛酸联合神经生长因子可促进股骨骨折的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(37): 5477-5482.

Liu Jian-jun, Huang Liang, Han Qing-bin, Li Xin-zhi, Que Xiang-yong. Alpha-lipoic acid and nerve growth factor promote healing of femoral fracture[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5477-5482.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 SD大鼠72只，无脱失，全部进入结果分析。

2.2 骨痂体积给药后1周，各组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；给药后2周，神经生长因子治疗组和联合治疗组骨痂体积多于对照组(P < 0.05)，但两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；给药后3周，神经生长因子治疗组和联合治疗组骨痂体积多于对照组(P < 0.05)，而且联合治疗组骨痂体积明显多于神经生长因子治疗组(P < 0.05)，见表1。

2.3 ELISA法测血清骨形态发生蛋白2水平给药后1周，神经生长因子治疗组和联合治疗组骨形态发生蛋白2水平均明显高于对照组(P < 0.05)，虽然联合治疗组骨

形态发生蛋白2水平高于神经生长因子治疗组，但这种差异无显著性意义(P > 0.05)；给药后2周，各组骨形态发生蛋白2水平继续升高，而且神经生长因子治疗组明显高于对照组(P < 0.05)，联合治疗组明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)；给药后3周，骨形态发生蛋白2水平明显下降，但神经生长因子治疗组仍明显高于对照组(P < 0.05)，联合治疗组仍维持较高水平，明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)，见表2。

2.4 骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达给药后1周，神经生长因子治疗组和联合治疗组骨形态发生蛋白2蛋白表达均明显高于对照组(P < 0.05)，但两组间差异无显著性意义(P > 0.05)；给药后2周，各组骨形态发生蛋白2蛋白表达继续升高，而且神经生长因子治疗组明显高于对照组(P < 0.05)，联合治疗组明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)；给药后3周，骨形态发生蛋白2蛋白表达下降，但神经生长因子治疗组仍明显高于对照组(P < 0.05)，联合治疗组仍维持较高水平，明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)，见表3，图1。

2.5 骨折断端血管内皮生长因子mRNA表达给药后1周，神经生长因子治疗组和联合治疗组血管内皮生长因子mRNA表达均明显高于对照组(P < 0.05)，但两组间差异无显著性意义(P > 0.05)；给药后2周，各组血管内皮生长因子mRNA表达继续升高，而且神经生长因子治疗组明显高于对照组(P < 0.05)，联合治疗组明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)；给药后3周，血管内皮生长因子mRNA表达下降，但神经生长因子治疗组仍明显高于对照组(P < 0.05)，联合治疗组仍维持较高水平，明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)，见表4，图2。

参考文献

[1] Zhuang YF, Li J. Serum EGF and NGF levels of patients with brain injury and limb fracture. Asian Pac J Trop Med. 2013;6(5):383-386.
[2] Giannoudis PV, Mushtaq S, Harwood P, et al. Accelerated bone healing and excessive callus formation in patients with femoral fracture and head injury. Injury. 2006;37 Suppl 3:S18-24.
[3] Stefani CM, Machado MA, Sallum EA, et al. Platelet-derived growth factor/insulin-like growth factor-1 combination and bone regeneration around implants placed into extraction sockets: a histometric study in dogs. Implant Dent. 2000;9(2):126-131.
[4] 邓江,黄文良,阮世强,等.胰岛素样生长因子-Ⅰ活化组织工程骨修复骨缺损的实验研究[J].第三军医大学学报, 2011, 33(2):145-147.
[5] 姚建华,李亚非.神经生长因子对骨折愈合影响的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2000,7(10):996-998.
[6] Roberts JL, Moreau R. Emerging role of alpha-lipoic acid in the prevention and treatment of bone loss. Nutr Rev. 2015;73(2):116-125.
[7] Polat B, Halici Z, Cadirci E, et al. The effect of alpha-lipoic acid in ovariectomy and inflammation- mediated osteoporosis on the skeletal status of rat bone. Eur J Pharmacol. 2013;718(1-3):469-474.
[8] 刘冠华,张柳,梁春雨.脑损伤合并骨折可加速骨折愈合及异位骨化[J].中国组织工程研究,2012,16(46):8721-8726.
[9] Morley J, Marsh S, Drakoulakis E, et al. Does traumatic brain injury result in accelerated fracture healing. Injury. 2005;36(3):363-368.
[10] 杨森,王海龙,盛伟斌,等.骨折合并脊髓损伤患者血清中转化生长因子β1变化：有利于促进骨折愈合[J].中国组织工程研究,2015,19(2):165-169.
[11] Bidner SM, Rubins IM, Desjardins JV, et al. Evidence for a humoral mechanism for enhanced osteogenesis after head injury. J Bone Joint Surg Am. 1990;72(8):1144-1149.
[12] 王林.合并中枢神经损伤骨折愈合过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2011, 15(33):6168-6171.
[13] 郑少涛,林喜容,周少鹏.脑外伤合并骨折患者血清胰岛素生长因子Ⅱ水平的变化[J].中国现代医生,2014,52(2):19-23.
[14] Zhuang YF, Li J. Serum EGF and NGF levels of patients with brain injury and limb fracture. Asian Pac J Trop Med. 2013;6(5):383-386.
[15] 怀文娟,韩晓峰,朱颖华.经皮局部注射神经生长因子对骨折愈合的影响[J].中国药业,2015,34(12):41-42.
[16] Jehan F, Naveilhan P, Neveu I, et al. Regulation of NGF, BDNF and LNGFR gene expression in ROS 17/2.8 cells. Mol Cell Endocrinol. 1996;116(2):149-156.
[17] 刘振刚,刘宇鹏,李放,等.神经生长因子在骨折愈合中的作用[J].中国医药指南,2013,11(4):491-493.
[18] 赵重熙,马军,何宁,等.局部应用神经生长因子对周围神经损伤后骨折早期愈合的影响[J].中国组织工程研究,2015, 19(15):2320-2324.
[19] Mainini G, Rotondi M, Di Nola K, et al. Oral supplementation with antioxidant agents containing alpha lipoic acid: effects on postmenopausal bone mass. Clin Exp Obstet Gynecol. 2012;39(4):489-493.
[20] Fu C, Xu D, Wang CY, et al. Alpha-Lipoic Acid Promotes Osteoblastic Formation in H2O2 -Treated MC3T3-E1 Cells and Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats. J Cell Physiol. 2015;230(9):2184-2201.
[21] Aydin A, Halici Z, Akoz A, et al. Treatment with α-lipoic acid enhances the bone healing after femoral fracture model of rats. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2014;387(11):1025-1036.
[22] Koh JM, Lee YS, Byun CH, et al. Alpha-lipoic acid suppresses osteoclastogenesis despite increasing the receptor activator of nuclear factor kappaB ligand/osteoprotegerin ratio in human bone marrow stromal cells. J Endocrinol. 2005;185(3):401-413.
[23] Akman S, Canakci V, Kara A, et al. Therapeutic effects of alpha lipoic acid and vitamin C on alveolar bone resorption after experimental periodontitis in rats: a biochemical, histochemical, and stereologic study. J Periodontol. 2013;84(5):666-674.
[24] 叶夏云,罗晓红,戴永利.硫辛酸联合神经生长因子治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察[J].军医进修学院学报, 2011,32(12):1226-1277.
[25] 侯波,王毅,沈宇辉.骨形态发生蛋白-2信号通路与骨发生发育及损伤修复[J].中国组织工程研究,2013,17(2): 342-346.
[26] 陈雯辉,王大业,麻松,等.脑外伤后血小板衍生因子及血管内皮生长因子对骨折愈合影响的实验研究[J].首都医科大学学报,2007,29(6):745-752.
[27] Khan AH, Capilla E, Hou JC, et al. Entry of newly synthesized GLUT4 into the insulin-responsive storage compartment is dependent upon both the amino terminus and the large cytoplasmic loop. J Biol Chem. 2004;279(36):37505-37511.
[28] 张孝丽,郭晖.α硫辛酸治疗糖尿病周围神经病变的研究进展[J].医学综述,2011,17(2):281-283.
[29] 刘宇鹏,赵德伟,王卫明,等.神经生长因子可促进骨折愈合过程中血管内皮生长因子的表达[J].中国组织工程研究, 2014,18(24):3863-3869.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年7月至2015年8月在三峡大学第二临床医学院中心实验室及基础医学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康雄性SD大鼠72只，10周龄，体质量(260±20) g，由三峡大学实验动物中心提供。

1.3.2 药物、试剂注射用鼠神经生长因子(批号S20060051)由武汉海特生物制药股份有限公司提供；α-硫辛酸药粉(批号H20100158)由江苏万禾制药有限公司提供；ELISA试剂盒购自上海宸凛生物公司；骨形态发生蛋白2抗体购自武汉博士德公司。
1.4 实验方法

1.4.1 股骨骨折模型制作大鼠经5%水合氯醛腹腔内注射麻醉后，对右后肢脱毛、消毒，取股外侧切口，长约1.5 cm，沿股外侧肌间隙钝性分离，充分显露一侧股骨后，用线锯在股骨中段锯断，造成股骨干的横行骨折，以直径1.5 mm的克氏针作髓内固定，生理盐水冲洗，逐层关闭切口。

1.4.2 实验分组及给药方法将实验动物随机分为3组：对照组、神经生长因子治疗组、联合治疗组。术后第1天开始给药，对照组给予肌肉注射生理盐水；神经生长因子治疗组给予肌肉注射神经生长因子200 ng/kg，1次/d；联合治疗组除肌肉注射神经生长因子外，还口服α-硫辛酸25 mg/kg，1次/d。给药1，2，3周后，每个时间点随机从各组中选取8只大鼠进行各项指标测定。

1.4.3 骨痂评定取股骨全长，采集时注意保护骨折附近区域组织以免破坏骨痂。骨痂体积测量采用Perkins法，卡尺分别测得矢状面和冠状面骨痂直径，取其平均值换算为骨痂半径r₂，同法测得股骨半径r₁，测得骨痂长度L，按照Perkins的公式V=2πr₁(r₂-r₁)L计算出骨痂体积。

1.4.4 ELISA法检测血清骨形态发生蛋白2水平取心脏血液，离心分离血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。按ELISA检测试剂盒说明书，配制标准液，取冻存的大鼠血清，按如下步骤进行检测：①分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加入标准品或待测样品各100 μL，将反应板充分混匀后经37 ℃孵育反应120 min，用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，每次静置10-20 s，滤纸上印干；②每孔中加入第一抗体工作液100 μL，将反应板充分混匀后经37 ℃孵育反应60 min，洗板、静置、印干；③每孔加酶标抗体工作液100 μL，将反应板经37 ℃孵育反应30 min，洗板、静置、印干；④每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min，每孔加入100 μL终止液混匀；⑤30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光度值，绘制标准曲线，在标准曲线上查找对应的浓度值。

1.4.5 Western blot检测骨折断端骨形态发生蛋白的表达股骨标本脱钙1周，取脱钙骨组织按组织裂解法提取蛋白；上样电泳，制作胶膜夹心，100 V电压4 ℃条件下转膜100 min。取出硝酸纤维素薄膜封闭清洗，依次加入抗体孵育。洗涤液洗膜，NCIP/NBT显色，待蛋白条带显示清晰时，终止反应，扫描。利用Gene Genius生物图像凝胶分析仪测定目的蛋白条带亮度。以β-actin作为内参照，并以正常对照组样品条带亮度为100%，计算各种样品的相对值作为蛋白的相对表达量。

1.4.6 RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达于骨折处上、下各2 mm处截取骨痂标本，液氮冻存。标本研磨匀浆后，以Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，随后进行反转录和PCR，分别以各自的引物扩增β-actin、血管内皮生长因子。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min；72 ℃延伸5 min，进行30个循环，以β-actin为内参照。凝胶成像仪测定吸光度，以待测基因与相应内参照吸光度比值作为mRNA的相对表达量。图像分析采用真彩色医学图像分析软件(Image-proplus6.0)对结果进行半定量分析。

1.5 主要观察指标 ①骨痂体积；②血清骨形态发生蛋白2水平；③骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达；④骨折断端血管内皮生长因子mRNA表达。

1.6　统计学分析　实验数据以x(_)±s表示，用SPSS10.0统计软件，组间比较采用t 检验，P < 0.05 为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨折愈合是一个复杂的骨再生过程，除适当的生物力学环境等因素外，多种组织细胞及各种细胞因子之间的相互作用在骨折愈合中也发挥了重要的作用。研究表明，合并中枢神经系统损伤的骨折患者，骨痂形成以及骨折愈合明显加速，提示神经体液因素在骨折愈合过程中发挥着重要作用^[8-9]。

研究认为中枢神经损伤后，某些生长因子能够透过血脑屏障释放出来，作用于骨折局部发挥作用^[10-11]。在合并脑外伤的骨折患者血清中也检测到生长因子水平明显升高^[12-13]。众多神经因子，特别是神经生长因子，对骨折愈合的促进作用日益得到证实^[14-15]。早期的形态学研究发现，骨痂生长1周就观察到神经纤维长入，而缺乏神经纤维的骨痂，机械强度明显降低。在胚胎骨组织以及骨痂组织中也检测到神经生长因子受体及神经生长因子mRNA表达^[16]。国内国外学者的研究都证实神经生长因子对骨折修复起着重要作用，甚至在骨折断端局部注射神经生长因子后，可以观察到骨痂生成量明显增多，骨痂刚度和抗折弯强度也显著增加^[17-18]。在此实验中观察到，应用神经生长因子后骨痂的生成明显增加，与上述报道一致。

α-硫辛酸作为一种强效抗氧化剂，广泛应用于改善糖尿病周围神经病变。但是最近的临床观察发现，口服α-硫辛酸能明显减少绝经后妇女骨量的丢失^[19]。Fu等^[20]随后进行了动物实验，发现α-硫辛酸明显减少去除卵巢大鼠的骨量丢失，而对于体外培养的过氧化氢处理的MC3T3-E1细胞，α-硫辛酸则能增加成骨细胞的形成，促进成骨细胞的分化、矿化和成熟，并抑制成骨细胞凋亡。在大鼠股骨骨折模型中，Aydin等^[21]发现给予α-硫辛酸口服1个月后，行CT检查以及生物力学测试，骨折愈合明显优于对照组。此外，α-硫辛酸能够抑制破骨细胞活性，抑制骨吸收^[22-23]。

在治疗糖尿病周围神经病变时，曾发现α-硫辛酸联合神经生长因子时疗效更加显著，表明二者之间存在协同作用^[24]。而作者在实验中也观察到，神经生长因子与硫辛酸联合用药时，骨痂的生成量明显多于单纯神经生长因子治疗组，而且骨形态发生蛋白的表达量也明显增高。骨形态发生蛋白2是一种重要的骨生长因子，在骨折修复中发挥着至关重要的作用，具有多重诱导成骨的效应，它在刺激间充质细胞的分化、加强细胞外基质的合成以及维持成骨细胞表型等各个方面发挥着重要作用^[25]。在实验中发现，早期阶段单纯神经生长因子治疗组与联合治疗组间骨形态发生蛋白2表达并无明显差别，但在后期阶段，神经生长因子联合α-硫辛酸能更持久维持骨形态发生蛋白2的表达，相应的骨痂生成也更多。血管内皮生长因子是另外一个在骨折愈合过程中发挥重要作用的细胞因子，它诱导血管新生，帮助局部血液循环重建^[26]。在大鼠骨折模型中观察到，早期阶段单纯神经生长因子治疗组与联合治疗组间血管内皮生长因子表达无明显差别，但在后期阶段，神经生长因子联合α-硫辛酸能更持久地维持血管内皮生长因子的表达。

综上所述，神经生长因子联合α-硫辛酸可能比单纯神经生长因子治疗有着更显著的疗效。α-硫辛酸除了强大的抗氧化作用外，还可以通过营养作用纠正大鼠神经肽类的缺陷，使神经肽Y、神经营养因子和P物质恢复正常并促进神经纤维再生^[27]。另外，α-硫辛酸可以保护血管内皮细胞抑制细胞内细胞黏附分子的表达，改善局部血液循环^[28]。神经生长因子的成骨作用也包括诱导肽类神经纤维的长入，释放肽类递质发挥对骨的营养作用^[17]，促进血管内皮分化，改善局部血循环等^[29]，因而二者在治疗骨折时可能存在协同作用。而且，α-硫辛酸有着明确的抗骨质疏松作用，神经生长因子联合硫辛酸治疗骨折，尤其是绝经后妇女骨质疏松性骨折，值得进一步探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程