人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状与未来

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.020

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (36): 5458-5465.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.020

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人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状与未来

彭雅南，赵振强

海南医学院附属医院神经内科一病区，海南省海口市 570102

修回日期:2016-06-12 出版日期:2016-09-02 发布日期:2016-09-02
通讯作者: 赵振强，硕士，主任医师，海南医学院附属医院神经内科，海南省海口市 570102
作者简介:彭雅南，女，1990年，江西省万年县人，汉族，海南医学院在读硕士，医师，主要从事细胞疗法治疗帕金森病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31260231)；海南省国际合作项目(KJHZ2015-09)；海南省国际合作项目(2012-GH002)；海南省重大科技项目(ZDZX2013003)

Application of human induced pluripotent stem cells-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease models: present and future

Peng Ya-nan, Zhao Zhen-qiang

Department of Neurology, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China

Revised:2016-06-12 Online:2016-09-02 Published:2016-09-02
Contact: Zhao Zhen-qiang, Master, Chief physician, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China
About author:Peng Ya-nan, Studying for master’s degree, Physician, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31260231; the Major Scientific and Technical Project of Hainan Province of China, No. ZDZX2013003; International Science and Technology Cooperation Program of Hainan Province of China, No. 2012-GH002 and KJHZ2015-09

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
帕金森病：又称特发性帕金森病，简称Parkinson病，也称为震颤麻痹，是中老年人常见的神经系统变性疾病，也是中老年人最常见的锥体外系疾病。65岁以上人群患病率为1 000/10万，随年龄增高，男性稍多于女性。该病的主要临床特点为静止性震颤，动作迟缓及减少，肌张力增高，姿势不稳等为主要特征。
路易小体(Lewy body)：是以帕金森病为代表的路易体病患者脑内的特征性标志物。显微镜下为圆形粉红色均质状结构，其前体被称为灰体，而α-synuclein是路易小体及其前体灰体的主要成分。

摘要
背景：人诱导性多能干细胞源神经元的出现解决了胚胎干细胞来源的伦理学问题，为帕金森病移植提供了一个有前景的细胞替代资源。
目的：总结人诱导性多能干细胞分化为多巴胺能神经元的诱导流程及其移植治疗帕金森病动物模型的应用进展。
方法：以英文检索词“iPSC and Parkinson’s disease，induced pluripotent stem cells and Parkinson’s disease，ES cells and Parkinson，PD model，Parkinson and Lewy bodies”由第一作者检索1980至2015年PubMed数据库，查阅近年诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的相关文献，最终保留40篇文献。
结果与结论：文章综述了诱导性多能干细胞的不同来源，应用的各种诱导性多能干细胞的体外诱导分化方案，不同帕金森病模型的选择以及多位学者神经元移植试验的数据，详细呈现当前人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状。根据路易小体的帕金森病机制来分析移植后路易小体的产生机制，为将来避免移植后路易小体的产生以及移植效果的优化提供了参考。优化的诱导性多能干细胞体外诱导分化条件可以明显改善帕金森病模型动物的行为学表现，结合影像学检测、免疫组织化学试验等检测手段可以更系统的评价移植效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4956-2672(彭雅南)

关键词: 干细胞, 移植, 诱导性多能干细胞, 多巴胺能神经元, 帕金森病, 帕金森病模型, 路易小体, α-突触核蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The emergence of human induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived dopaminergic neurons solves the problem that the embryonic stem cell (ESC) shows an ethical issue on its source, providing a promising cell source for treatment of Parkinson’s disease.
OBJECTIVE: To summarize the differentiation methods of iPSCs-derived dopaminergic neurons in vitro, the choice of Parkinson’s disease models and the transplantation of iPSCs-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease treatment.
METHODS: In order to search relevant articles about the application of iPSCs-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease models from PubMed databases (from 1980 to 2015), a computer-based search was performed by the first author, using the key words of “iPSC and Parkinson’s disease, induced pluripotent stem cells and Parkinson’s disease, ES cells and Parkinson, PD model, Parkinson and Lewy bodies” in English. Finally 40 articles were chosen for further analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Here, this paper is detailed to show the research status of human iPSCs-derived dopaminergic neurons for treating Parkinson’s disease by reviewing the sources and in vitro differentiation schedules of iPSCs as well as the choice of Parkinson’s disease models and outcomes of transplantation of iPSCs-derived dopaminergic neurons for Parkinson’s disease treatment. According to the Parkinson’s disease mechanism of the Lewy body, we analyze the generation mechanism of the Lewy body, providing references to avert the presence of Lewy bodies and optimize the outcomes of transplantation. The improvement of differentiation conditions of iPSCs can markedly improve the behavior outcomes, and moreover, we can systematically evaluate the outcomes of transplantation by iconography and immunohistochemical results.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Multipotent Stem Cells, Dopamine, Neurons, Parkinson Disease

中图分类号:

R318

彭雅南，赵振强. 人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状与未来[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5458-5465.

Peng Ya-nan, Zhao Zhen-qiang. Application of human induced pluripotent stem cells-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease models: present and future[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5458-5465.

图/表（结果） 1

2.1 诱导性多能干细胞的来源 诱导性多能干细胞是指通过诱导重编程的方法，将已分化成熟的体细胞诱导成具有胚胎干细胞特性的细胞。诱导重编程所需的体细胞，通常来源于帕金森患者和健康成人的皮肤成纤维细胞、毛囊角化细胞、肝细胞和造血细胞^[3]。早在2006年，Takahashi小组利用反转录病毒，将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四种因子导入小鼠和人的成纤维细胞，筛选获得具有胚胎干细胞特性的诱导性多能干细胞^[4]。现如今，改良的诱导性多能干细胞诱导方法也不胜枚举，其中载体的优化成为关键的突破口之一。Rhee小组通过比较病毒和蛋白质分别作为载体，病毒组的诱导性多能干细胞分化的神经前体细胞相比蛋白质组，在传代过程中表现为早期的衰老和凋亡^[5]。诱导性多能干细胞另一方面诱导方法的改进是特异性转录因子的简化。Soldner小组应用DOX介导的携带有loxP剪切位点的慢病毒作为载体，将4种特异性转录因子导入帕金森患者成纤维细胞中，在获得有效的诱导性多能干细胞后，利用重组酶剪切外源性DNA，从而获得了无转录因子整合的诱导性多能干细胞^[6]。

2.2 诱导性多能干细胞源多巴胺能神经元诱导流程

2.2.1 标准的诱导流程 标准的诱导流程包括：诱导性多能干细胞诱导分化为神经前体细胞和神经前体细胞诱导分化为多巴胺能神经元^[7-9]。当然，不同的小组所采用的诱导方案存在差异，诱导方案的多样化也为人诱导性多能干细胞源多巴胺能神经元的诱导分化提供了更多的选择参考。

2.2.2 多样化的诱导性多能干细胞体外诱导分化方案 Cooper小组^[10]的体外诱导分化方案^[7]的具体流程如下：诱导性多能干细胞的维持和传代培养，参考美国国家科学院官方指导。神经外胚层的分化，用SRM培养基培养11 d，再用增补了600 μg/L的Noggin、100 μg/L的Wnt1、100 μg/L的成纤细胞生长因子8a和全反式维甲酸培养3 d。第14天人工挑取神经外胚层克隆，并将其接种在包被了多鸟胺酸和层粘连蛋白的培养皿中，并在培养皿内放入增补了生长因子的N2培养基。神经前体细胞向多巴胺能神经元分化所需的生长因子为：Shh-N、SHH-C24II、成纤细胞生长因子8b、成纤细胞生长因子8a、20 μg/L的脑源性神经营养因子、1 μg/L 的转化生长因子β3、10 μg/L的胶质细胞源性神经营养因子、0.5 mmol/L的cAMP、0.2 mmol/L的抗坏血酸。在21 d后(第35天)将培养好的细胞用胰酶替代物消化，1 000 r/min转 5 min。用N2培养基将离心后的细胞制成细胞悬液，再次接种到包被多鸟胺酸和层粘连蛋白的多孔培养板上培养 7 d，每孔1 000 000- 2 000 000个细胞，并加入脑源性神经营养因子，抗坏血酸，SHH，和成纤细胞生长因子8。在上述基础上，加入cAMP，胶质细胞源性神经营养因子，和转化生长因子β3等生长因子，再培养7 d，细胞在第49天分化。

Sundberg小组^[11]试图找到更优化的诱导性多能干细胞的体外诱导分化方案，故而拟定了4种方案同时进行以用于比较，具体流程如下：①方案A：诱导性多能干细胞传代培养后，加入LDN-193189、SB431542培养1 d后，在此基础上加入SHH、purmorp、成纤细胞生长因子8a培养12 d，第3天补充加入CHIR；第13天，在前面基础上加入转化生长因子β、DAPT培养17 d。②方案B:诱导性多能干细胞传代培养后，加入LDN-193189、SB431542、Noggin培养1 d后，补充加入Noggin、SAG培养2 d；第3天，加入CHIR、成纤细胞生长因子8a、Wnt1、RA培养8 d；第11天，加入CHIR培养2 d后，加入脑源性神经营养因子、cAMP、转化生长因子β、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、DAPT培养17 d。③方案C：诱导性多能干细胞传代培养后，加入LDN-193189、SB431542、Noggin、SAG、CHIR、成纤细胞生长因子8a、Wnt1、RA培养11 d；第11天，加入CHIR培养 2 d后，加入脑源性神经营养因子、cAMP、转化生长因子β、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、DAPT培养17 d。④方案D：诱导性多能干细胞传代培养后，加入SB、Noggin、SAG、CHIR、成纤细胞生长因子8a、Wnt1、RA培养11 d；第11天，加入CHIR培养2 d后，加入脑源性神经营养因子、cAMP、转化生长因子β、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、DAPT培养17 d。不论ABCD4种方案，在前5 d都采用SRM培养基，在5-11 d都采用N2培养基，在11-30 d都采用Neurobasal培养基。

Kwon小组^[12]对神经前体细胞的诱导分化方法相比上述2种则稍有不同^[9]：在室温下，诱导性多能干细胞被胰酶消化4.0-5.0 min，成为单个细胞；在培养皿中，用增补了LIF的胚胎干细胞培养基将消化好的细胞制成细胞悬液，反复20 min直至排除滋养层细胞。为了诱导分化，本试验采用悬滴法形成拟胚体。这些悬滴在室温且湿润的条件下，在10% CO₂恒温箱中孵育3 d。在第4天的时候，收集明显增大的细胞滴，并将其接种在1.5%明胶包被的培养皿中培养24 h。nestin为神经前体细胞的标志物，选择nestin阳性的细胞，将其培养在ITSFn培养基中。细胞用此培养基培养7-9 d，每一两天换1次液。将神经前体细胞从培养皿中剥离下来，并接种到包被了多聚鸟胺酸和纤连蛋白的培养皿中，细胞浓度大概为75 000个/cm²。培养24 h后，进行细胞扩增。将神经前体细胞置于ITSFn培养基中培养4 d，并增补20 nmol/L孕酮、100 nmol/L的腐胺、1 mg/L的层粘连蛋白、10 μg/L碱性成纤细胞生长因子、500 μg/L的SHH、100 μg/L的成纤细胞生长因子8b、100 U/mL的青霉素、100 mg/L的链霉素。神经前体细胞的体外分化用的N3培养基培养8-10 d，其中用200 μmol/L的抗坏血酸替代了碱性成纤维细胞生长因子。

Kikuchi小组^[13]采用无饲养层培养基，通过悬浮法诱导神经前体细胞：用Accumax细胞分离液，将人诱导性多能干细胞块分离成单个细胞，并快速接种到加入分化培养基的96孔低细胞黏度的培养板上，使其快速再聚集。分化培养基为DMEM/F12培养基，增补了5%的KSR、2 mmol/L的谷氨酸盐、0.1 mmol/L的非必需氨基酸和0.1 mmol/L的2-巯基乙醇。在前3 d，加入50 μmol/L的Y-27632， 2 μmol/L的dorsomorphin和 10 μmol/L的SB-431542到培养皿中。第14天，诱导性多能干细胞源细胞球形成，接种到Petri培养皿中，并加入增补了B-27和2 mmol/L左旋谷酰胺的neurobasal培养基。第14-28天，加入SHH、100 g/L的成纤细胞生长因子。28 d后，换用增补了B-27、2 mmol/L的左旋谷酰胺、2 μg/L的胶质细胞源性神经营养因子、 10 μg/L的脑源性神经营养因子、1 mmol/L的dbcAMP和200 nmol/L的抗坏血酸的neurobasal培养基，将神经前体细胞诱导分化为成熟的多巴胺能神经元。

Han小组^[14]采用鼠MEFs为饲养层细胞，诱导性多能干细胞体外诱导分化流程如下：首先将诱导性多能干细胞接种到加有胚胎干细胞培养基的六孔培养板上，以MEFs为饲养层细胞。在前4 d，用增补了SB431542和Noggin的标准胚胎干细胞培养基培养诱导性多能干细胞，并形成诱导性多能干细胞克隆。第5天，移除SB431542和Noggin，并加入200 μg/L的SHH。再维持培养5 d后，加用脑源性神经营养因子(20 μg/L)、抗坏血酸(200 mmol/L)、SHH(200 μg/L)和成纤细胞生长因子8b(100 μg/L)。维持培养7 d后，细胞被接种到多聚左旋鸟胺酸/层粘连蛋白包被的六孔培养板上，加入增补了脑源性神经营养因子、抗坏血酸、胶质细胞源性神经营养因子(10 μg/L) ，转化生长因子β(1 μg/L)和cAMP(500 mmol/L)的DMEM: F12/N2培养基，再培养1-3周。

2.2.3 总结上述诱导性多能干细胞体外诱导分化方案 诱导性多能干细胞体外诱导分化条件的不断改良，也致使其方案的不断优化。Cooper小组^[10]的诱导分化周期为49 d，其他小组的诱导分化周期均保持在28 d左右，周期的缩短也明显提高了诱导性多能干细胞体外诱导分化的效率。Cooper小组^[10]和Sundberg小组^[11]在诱导性多能干细胞的体外诱导分化中加入了11种乃至11种以上的生长因子，且重复加入同一生长因子的次数多；Han小组^[14]在Sundberg小组^[11]体外分化条件的基础上，将诱导性多能干细胞体外分化必需的生长因子缩减到8种，在一定程度上优化了实验；Kwon小组^[12]和Kikuchi小组^[13]分别通过悬滴法和悬浮法诱导诱导性多能干细胞分化为神经前体细胞，并减少了加入生长因子的种类和重复次数，简化了实验流程。

2.3 帕金森病模型的选择 目前用于帕金森病实验研究的常见帕金森病模型动物为：大鼠、灵长目类动物（猕猴、食蟹猴、恒河猴等）、小型猪。帕金森病模型的建立为日后的移植效果检测奠定了基础，目前常用的诱导剂为6-羟基多巴胺和MPTP^[15-16]。由于异种移植所无法避免的免疫排斥反应，单纯的6-羟基多巴胺和MPTP诱导损害的帕金森病模型在移植时都需加用免疫抑制剂。为了优化模型，避免移植后免疫反应对移植神经元的攻击，Samata小组^[17]巧妙的利用罹患X-性连锁重症联合免疫缺陷病的大鼠，建立了6-羟基多巴胺诱导的帕金森病模型；这种6-羟基多巴胺诱导的X-性连锁重症联合免疫缺陷病大鼠模型在后续的移植实验中，在不加用免疫抑制剂的条件下，并未产生免疫移植反应，且移植后大鼠的旋转行为得到改善^[17]。

2.4 人诱导性多能干细胞源神经元的移植

2.4.1 移植效果的评价手段 流式细胞仪为多巴胺能神经元的纯化提供了良好的保障^[18-19]。将纯化后的多巴胺能神经元制成细胞悬液，注射到模型动物纹状体的定位坐标位置^[20-25]。后续对模型动物进行行为学分析、影像学显影扫描和尸检后的大脑组织切片的免疫组织化学等检测^[26-27]。

2.4.2 各小组的多巴胺能神经元移植效果 Hallett小组^[28]分别采用了Cooper小组^[10]和Sundberg小组^[11]的诱导性多能干细胞体外诱导分化方案，并将2种方案分化所得的成熟的多巴胺能神经元进行移植试验。其中，MF25-04食蟹猴接受Cooper小组^[10]的诱导分化方案，而MF27-04和MF66-02食蟹猴接受Sundberg小组^[11]的诱导分化方案，这三系动物都经MPTP损害以构建帕金森病模型。移植后6个月，MF25-04模型动物日间肌动活动计数增加了146%，在接下来的18个月中，MF25-04模型动物的肌动活动保持上升趋势，增加范围从178%到292%，移植后2年，该模型动物的肌动活动是MPTP损害模型基线的188%。实验中，鉴于稳定的双侧MPTP 损害模型，通过运动分析面板实验给单侧移植提供了一个评价运动功能不对称的机会。相比基准值，MF25-04 模型在移植后12个月，左侧(移植对侧)上肢使用时运动机能的进行性改善被关注到，肌动活动的减少在移植后24个月有了一定的意义(统计学上)；而右侧上肢使用时的运动机能在移植后24个月并没有得到显著的改善。帕金森病症状的严重性，也通过帕金森病评定量表按月进行评估：Hallett小组^[28]观察到，MF25-04模型在量表中的运动功能减退部分改善了，从移植前的2分(最高3分)，到移植后12个月的0分，且0分一直稳定维持到研究结束。然而，相比MF25-04模型，移植后一两年，MF27-04和MF66-02 模型动物在总的肌动活动、运动分析面板实验或运动功能减退方面没有显著的改变，这也暗示了中脑多巴胺能神经元移植后的存活不足。在尸检时发现，接受移植后的食蟹猴的壳核区仅有不足50个多巴胺能神经元存活。自从观察到MF25-04动物自体移植后运动症状功能改善，Hallett小组^[28]采用¹¹C-CFT-PET 显影扫描神经元移植2年后的尾状核和壳核区的多巴胺能神经末梢。他们观察到，对比未移植的左侧壳核，2年后，右侧壳核¹¹C-CFT的结合位点有明显的增加，这正说明了移植区存在有功能的多巴胺能神经元。络氨酸羟化酶免疫反应活性多巴胺能神经元的体视学细胞计数表明移植区壳核有13 029个移植神经元存活。作为对照， MF27-04和MF66-02各自有8 551和7 938个络氨酸羟化酶免疫反应活性多巴胺能神经元存活。MF25-04，MF27-04和MF66-02络氨酸羟化酶免疫反应活性神经纤维在壳核区的生长的比较显示，MF25-04有更多更广泛的多巴胺能神经再支配，这个结果与动物功能恢复的观察结果相一致。这些数据都提示：运动功能的改善需要足够数量存活的中脑多巴胺能神经元和移植物在壳核内适当的神经再支配；反之，运动功能无法恢复。种种数据显示，在一系列的分化方案中，Cooper小组^[10]的神经元分化条件相比Sundberg小组^[11]更为成功。

Kikuchi小组^[13]选用MPTP损害的食蟹猴作为接受神经元移植的帕金森病模型动物，选取培养天数不同的2组神经前体细胞，28 d和42 d，进行移植试验。移植后6个月，MRI显示移植细胞存活并在食蟹猴的大脑中增殖。Kikuchi小组^[13]用MRI来测量移植物在宿主中的大小。根据MRI得出，42 d移植物明显小于28 d移植物，从生长速度来看，28 d也比42 d占优势。当然，日后的大脑切片苏木精-伊红染色也证实了MRI的显影结果：在28 d移植物中，有更多的细胞聚集，相比42 d移植物来说。免疫组织化学结果显示：相比42 d移植物，在d28移植物中，有更多的Vimentin⁺细胞和更少的Nestin⁺细胞。Ki67为增殖细胞的标记物，其表达的比率在28 d移植物中明显高于42 d移植物。28 d移植物中Ki67阳性的细胞也同时表现为Vimentin阳性，这表明移植物中增殖细胞为未成熟的神经细胞和间叶细胞。反之，d42移植物中Ki67阳性的细胞也同时表现为Nestin阳性，表明移植细胞的一部分仍然是神经前体细胞，一部分为增殖细胞。当然，Kikuchi小组^[13]还对移植物的体内分化情况进行了检测。TH⁺细胞位于移植物外围，其密度显然在42 d移植物组更高。同时，这些TH⁺细胞也表达成熟多巴胺能神经元的标志物，如：Nurr1，VMAT2，DAT，Girk2和Pitx3。结果表明在食蟹猴的大脑中，42 d移植细胞分化为多巴胺能神经元更为高效。后续还采用帕金森病运动等级评分和人工录像分析来评价移植后动物的行为学表现。根据帕金森病等级评分，移植后6个月猴的行为学表现得到轻微的改善；根据人工录像分析，移植后6个月猴的自发运动和拾物速度也有一定的改善。综合结果显示：42 d悬浮细胞球移植效果优于28 d，且移植的神经前体细胞在食蟹猴大脑中分化为多巴胺能神经元并存活。

Han小组^[14]与Kikuchi小组^[13]一样，也是将诱导性多能干细胞源的神经前体细胞移植到帕金森病模型。不同的是，采用的模型动物为6-羟基多巴胺损害的大鼠，并选用阿扑吗啡诱导的旋转试验作为行为学测验。平均来说，移植后4周和8周时，大鼠的旋转率分别下降到0.674和0.703(PBS对照组则分别为0.960和0.953)，然而，在统计学上实验组和对照组的旋转率无明显差别。移植后12周和16周，旋转率下降到0.577和0.518，对比对照组的0.997和1.008，此时统计学上实验组与对照组有差异，这也说明了移植细胞需要多于2个月的时间才能在体内发挥作用。移植后，转棒试验时间的进行性延长被观察到。移植后4，8，12和16周的转棒试验时间平均为74.63 s、89.63 s、110.25 s和120.37 s，相比对照组的29.25 s、29.75 s、34.25 s和47.50 s明显延长，且在统计学上有意义。这些运动行为测试都表明移植的诱导性多能干细胞源神经前体细胞能够恢复一部分的6-羟基多巴胺损害帕金森病的功能缺损。当然，后期的大脑切片免疫组织化学检测也印证了动物行为学检测的结果：移植物中仅有1/5左右的成熟神经元(Tuj1阳性)，大部分都分化为星形胶质细胞(阳性)。

2.4.3 总结各小组的移植结果 Hallett小组^[28]采用了2种分化条件所得的多巴胺能神经元进行移植试验，不仅通过移植后效果对两种分化条件进行评价，还采用了多种手段对模型动物进行检测以评估移植效果，给以后的实验研究提供了大量的参考依据。而Kikuchi小组^[13]和Han小组^[14]，移植的细胞都为未分化成熟的神经前体细胞，后期的检测更多的采用行为学测验和大脑切片免疫组织化学试验，然而移植细胞的体内分化效果并不如人意，后期行为学功能也只有部分得到恢复。4个小组的实验结果对比，提示了神经前体细胞移植后的体内分化难以把控。相比之下，优化诱导性多能干细胞的体外诱导方案，移植纯化的多巴胺能神经元更有前景和研究意义。

2.5 关于移植后路易小体的出现

2.5.1 路易小体为帕金森病的典型病理表现 黑质中的路易小体是帕金森病的典型病理表现，其主要成分为α-突触核蛋白、富含亮氨酸重复序列激酶2、组蛋白去乙酰化酶6、带电多泡体蛋白质2B ^[29-31]。帕金森病模型中，路易小体在大脑中广泛分布。究其原因，主要是蛋白质的错误折叠并聚集，从而形成的蛋白质包涵体——路易小体^[32]。对于帕金森病患者而言，具有聚集倾向的α-突触核蛋白是导致路易小体的最主要原因。α-突触核蛋白是由140个氨基酸组成的14 000大小的蛋白质，位于突触前末梢和细胞核、细胞质以及细胞膜上^[33]。

到目前为止，α-突触核蛋白在基因编码中发生的6种不同的错义突变——p.A53T，p.A30P，p.E64K， p.H50Q，p.G51D，p.A53E，已经被认为是引起常染色体显性形式的帕金森病的主要原因^[34]。尽管α-突触核蛋白准确的功能仍然未知，但目前实质的证据表明α-突触核蛋白的功能和它直接与细胞膜磷脂质相互作用的能力有关，尤其是有弧度的细胞膜，比如囊泡。这表现为在神经递质释放时，α-突触核蛋白能对囊泡转运这一过程发挥作用。在水溶液中，α-突触核蛋白通常被归类为天然的未折叠的蛋白质。然而，α-突触核蛋白在已经确定的病理条件下(比如突触核蛋白的基因突变，氧化应激和翻译后修饰)，会形成低聚物或者纤维状结构。

逐渐增加的证据表明：病理的α-突触核蛋白种类包括翻译后修饰的，基因突变的，低聚物的或者是聚合物的形式。这些病理的α-突触核蛋白种类，也许能通过某些机制诱发毒性反应，例如干扰神经递质释放时α-突触核蛋白的正常功能(此处也许α-突触核蛋白作为多巴胺释放的负调节蛋白)，损害线粒体结构、复合体Ⅰ活性、线粒体动力学和线粒体自噬，干扰内质网和高尔基体间囊泡的转运导致的中毒性内质网应激，和损害某些蛋白质降解机制的效能。这些毒性机制干扰了细胞的正常生理，因而导致了细胞的损伤和最终的死亡^[35]。α-突触核蛋白也许存在的自蔓延现象，和其通过细胞间的传输机制在互相连接的大脑区域进行性播散，这一概念在近年来被强烈推崇。帕金森病动物模型显示，α-突触核蛋白导致的损害不仅存在于黑质中，还存在于大脑的其他区域，包括周围神经系统和中枢神经系统。根据Braak分期假说^[36]，帕金森病也许起源于中枢神经系统以外，通过退化的轴索和跨神经元运输，促使病原体进入中枢神经系统，而在此错误折叠的α-突触核蛋白可能是该病原体的候选蛋白质。α-突触核蛋白病理学在罹患路易病的帕金森病患者外周自主神经系统中大量存在，这一点也支持了上述理念^[37-38]。

2.5.2 探讨多巴胺能神经元移植后路易小体的形成机制 继Braak假说后，又有2个小组分别报道了接受DA神经元移植的帕金森患者在多年后的病理学表现：实验表明，在人脑中，路易小体病理学表现从宿主播散到移植物中。紧随着这些发现，“阮病毒”和“类阮病毒”的学说时代被开启了，且被广泛的应用于α-突触核蛋白蛋白潜在发病机制的描述。在此学说中，α-突触核蛋白能被宿主本身的活细胞释放(通过胞外分泌的激活)，也能被死亡细胞释放到周围的细胞外环境。此后，移植的神经元能够通过不同的途径获取释放的α-突触核蛋白，包括内吞作用。一旦进入到移植神经元的内部，外源性的α-突触核蛋白会作为模版促进蛋白质的错误折叠，从而内生性的产生α-突触核蛋白，最终导致路易小体的形成。当然，路易小体病理学呈现的差异或者出现与否，与应用的组织学条件、移植环境、移植后的时间或者帕金森病患者之间的个体差异有关^[39-40]。

参考文献

[1] González C,Bonilla S,Flores AI, et al. An Update on Human Stem Cell-based Therapy in Parkinson's Disease.Curr Stem Cell Res Ther. 2015 May 31. [Epub ahead of print].
[2] Roger A, Barker, Drouin-Ouellet J, et al. Cell‐based therapies for Parkin-son disease-past insights and future potential.Nature Reviews Neurology. 2015; 11:492-503.
[3] Cao L,TanL,Jiang T,et al. Induced Pluripotent Stem Cells for Disease Model-ing and Drug Discovery in Neurodegenerative Diseases.Molecular Neurobiol-ogy. 2015;52(1):244-255.
[4] Takahashi K,Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse em-bryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell.2006;126(4): 663-676.
[5] Rhee YH, Ko JY, Chang MY, et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease.J Clin Invest. 2011 Jun; 121(6): 2326-2335.
[6] Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell.2009;136(5): 964-977.
[7] Perrier AL, Tabar V, Barberi T, et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. ProcNatlAcadSci U S A .2004;101: 12543-12548.
[8] Yang D, Zhang ZJ, Oldenburg M, et al. Human embryonic stem cell-derived dopaminergic neurons reverse functional deficit in parkinsonian rats. Stem Cells.2008;26:55-63.
[9] Chambers SM,Fasano CA,Papapetrou EP,et al.Highly efficient neural conver-sion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Bio-technol. 2009;27:275-280.
[10] Cooper O, Hargus G, Deleidi M,et al. Differentiation of human ES and Parkin-son's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid.Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):258-266.
[11] Sundberg M, Bogetofte H, Lawson T, et al. Improved cell therapy protocol for Parkinson’s disease based on differentiation efficiency and safety of hESC-, hiPSC and non-human primate iPSC-derived DA neurons. Stem Cells.2013;31(8):1548-1562.
[12] Kwon YW, Chung YJ, Kim J, et al.Comparative Study of Efficacy of Dopaminer-gic Neuron Differentiation between Embryonic Stem Cell and Protein-Based In-duced Pluripotent Stem Cell.PLoS One.2014; 9(1): e85736.
[13] Kikuchi T, Morizane A, Doi D, et al. Survival of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons in the Brain of a Primate Model of Parkinson’s Disease.J Parkinsons Dis. 2011;1(4): 395-412.
[14] Han F, Wang W, Chen B, et al. Human induced pluripotent stem cellederived neurons improve motor asymmetry in a 6-hydroxydopamineeinduced rat model of Parkinson’s disease. Cytotherapy.2015; 17(5): 665-679.
[15] Santana M, Palmér T, Simplício H, et al. Characterization of long-term motor deficits in the 6- OHDAmodel of Parkinson’s disease in the common marmoset. Behav Brain Res.2015;290:90-101.
[16] Franke SK, van Kesteren RE, Wubben JA, et al. Progression and re-covery of parkinsonism in a chronic progressive MPTP-induction model in the marmoset without persistent molecular and cellular damage. Neuroscience.2016;312:247-259.
[17] Samata B, Kikuchi T, Miyawaki Y, et al. X-linked severe combined immunodefi-ciency (X-SCID) rats for xeno-transplantation and behavioral evaluation.J Neu-rosci Methods. 2015;243:68-77.
[18] Hargus G, Cooper O, Deleidi M, et al. Differentiated Parkinson pa-tient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats.ProcNatlAcadSci U S A,2010;107(36):15921-15926.
[19] Doi D, Samata B, Katsukawa M, et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Rep.Stem Cell Reports. 2014;2(3):337-350.
[20] Ganat YM, Calder EL, Kriks S, et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment.JClin In-vest.2012;122(8): 2928-2939.
[21] Grealish S,Diguet E,Kirkeby A,et al. Human ESC-derived dopamine neurons show similar preclinical efficacy and potency to fetal neurons when grafted in a rat model of Parkinson's disease.Cell Stem Cell.2014;15(5):653-665.
[22] LindvallO.Treatment of Parkinson's disease using cell transplantation. Philos Trans R SocLond B Biol Sci. 2015;370(1680).
[23] Marei HE, Lashen S, Farag A, et al.Human olfactory bulb neural stem cells mitigate movement disorders in a rat model of Parkinson's disease.J Cell Physiol.2015; 230(7):1614-1629.
[24] Rumpel R, Hohmann M, Klein A, et al.Transplantation of fetal ventral mesencephalic progenitor cells overexpressing high molecular weight fibroblast growth factor 2 isoforms in 6-hydroxydopamine lesione-drats.Neuroscience.2015;286:293-307.
[25] Müller J, Ossig C, Greiner JF,et al.Intrastriatal transplantation of adult human neural crest-derived stem cells improves functional outcome in parkin-sonianrats. Stem Cells Transl Med.2015; 4(1): 31-43.
[26] Takagi Y,Takahashi J,Saiki H,et al.Dopamin- ergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model.J Clin In-vest. 2005;115:102-109.
[27] Saiki H, Hayashi T, Takahashi R, et al. Objective and quantitative evalua-tion of motor function in a monkey model of Parkinson’s disease. J Neurosci Methods, 2010;190:198-204.
[28] Hallett PJ, Deleidi M, Astradsson A, et al. Successful Function of Autologous iPSC-Derived Dopamine Neurons following Transplantation in a Non-Human Primate Model of Parkinson’s Disease.Cell Stem Cell, 2015;16:269-274.
[29] Vitte J, Traver S, Maués De Paula A, et al. Leucine-rich repeat kinase 2 is associated with the endoplasmic reticulum in dopaminergic neurons and accumu-lates in the core of Lewy bodies in Parkinson disease. J NeuropatholExp Neu-rol.2010;69:959-972.
[30] Miki Y, Mori F, Tanji K,et al. Accumulation of histone deacetylase 6, an aggresome-related protein, is specific to Lewy bodies and glial cytoplasmic inclusions. Neuropathology.2011;31:561-568.
[31] Tanikawa S, Mori F, Tanji K, et al. Endosomal sorting related protein CHMP2B is localized in Lewy bodies and glial cytoplasmic inclusions in alpha-synucleinopathy. Neurosci Lett.2012;527:16-21.
[32] Shults CW. Lewybodies.ProcNatlAcadSci U S A.2006; 103:1661-1668.
[33] Maroteaux L, Campanelli JT, Scheller RH, et al. Synuclein: a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal. J.Neurosci. 1988; 8:2804-2815.
[34] Lesage S, Anheim M, Letournel F, et al.G51D alpha-synuclein mutation causes a novelparkinsonian- pyramidal syndrome.Ann Neurol. 2013;73:459-471.
[35] Recasens A, Dehay B.Alpha-synuclein spreading in parkinson’s disease. Front Neuroanat.2014;8:159.
[36] Braak H, Del Tredici K, et al.Staging of brain pathology related to spo-radic Parkinson’s disease.Neurobiol Aging.2003;24:197-211.
[37] Navarro-Otano J, Gelpi E, Mestres CA,et al. Alpha-synuclein aggregates in epicardial fat tissue in living subjects without parkinsonism. Parkinsonism Relat. Disord.2013;19:27-31.
[38] Gelpi E, Navarro-Otano J, Tolosa E, et al. Multiple organ involvement by alpha-synuclein pathology in Lewy body disorders.Mov Disord.2014;29:1010-1018.
[39] Brundin P, Li JY, Holton JL,et al.Research in motion: the enigma of Park-inson’s disease pathology spread. Nat RevNeurosci.2008; 9: 741-745.
[40] Mendez I, Viñuela A, Astradsson A, et al. Dopamine neurons implanted into people with Parkinson’s disease survive without pathology for 14 years.Nat Med.2008;14:507-509.

人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状与未来

Application of human induced pluripotent stem cells-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease models: present and future

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.