不同年龄脑出血大鼠海马齿状回神经干细胞增殖与分化差异的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
齿状回：齿状回位于海马区，与情节记忆有关，有助于对新环境的自发探索。有氧运动可能使得齿状回神经再生，实验表面成年小鼠的齿状回因为新环境的刺激而发生再生。齿状回也作为一个前处理单位，能够将非常近似的信息拆分成不同的细节，这为海马CA3区的信息存储做了准备。
神经干细胞：神经干细胞是来源于神经组织或能分化为神经组织的细胞，具有自我更新能力和通过不对称分裂产生不同子代的细胞，临床可用来对脑出血患者进行治疗。治疗过程中，神经干细胞在局部进行分裂增殖，在局部微环境的影响下分化成相应的受损细胞，重建神经环路，产生神经营养因子或神经保护因子，从而抑制神经变性或促进神经再生利用。

摘要
背景：脑出血后，海马齿状回的神经干细胞会被激活，导致其增殖分化能力的不断增强。通过内源性神经干细胞的不断分化和增殖，可以逐渐对老化、受损的神经元予以取代，进而发挥出保护脑结构等作用。
目的：对比分析不同年龄脑出血大鼠的海马齿状回神经干细胞增殖分化差异情况。
方法：成年和老年SD大鼠各96 只，随机各自分为正常组(18 只)、假手术组(18 只)、脑出血模型组(60 只)。其中，脑出血模型组制备脑出血模型，并进行BrdU标记，出血6 h、出血24 h、出血48 h、出血72 h、出血7 d，获得大鼠脑组织标本，计算脑含水量。术后3，7，14，21，28 d，进行BrdU/NeuN、BrdU/GFAP 双标染色，计算双标阳性细胞数。
结果与结论：①成年与老年大鼠脑出血组不同时间的脑含水量均显著高于正常组和假手术组(均P < 0.05)。老年组正常组和假手术组的脑含水量均显著低于成年组(均P < 0.05)；②脑出血组不同时间的两侧BrdU 阳性细胞数均显著高于正常组和假手术组(均P < 0.05)，且出血组不同时间的出血侧BrdU 阳性细胞数均显著高于对侧(均P < 0.05)；③成年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组织化学双标BrdU/NeuN和BrdU/GFAP 结果显著高于正常组(均P < 0.05)；④成年大鼠3组脑出血后出血侧海马齿状回BrdU 阳性细胞数均显著高于相应的老年组大鼠(均P < 0.05)；⑤结果表明，正常大鼠海马齿状回存在少量神经干细胞增殖现象，且老年大鼠的细胞增殖能力弱于成年大鼠。在发生脑出血后，大鼠的海马齿状回神经干细胞会出现增殖增强的情况，且老年大鼠的细胞增殖能力弱于成年大鼠。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8114-9442(谢强)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 脑出血, 海马齿状回, 年龄, 细胞增殖, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Cerebral hemorrhage can activate the proliferation and differentiation of neural stem cells in the dentate gyrus of the hippocampus. Through continuous differentiation and proliferation, endogenous neural stem cells can gradually replace aging and damaged neurons, thus protecting the brain structure.
OBJECTIVE: To compare the difference of the proliferation and differentiation of neural stem cells in the dentate gyrus of the hippocampus of rats with different ages.
METHODS: Ninety-six adult rats and 96 aged rats were randomly divided into normal group (n=18 per group), sham operation group (n=12 per group) and cerebral hemorrhage group (model group, n=66 per group), respectively. Cerebral hemorrhage models were made in the two model groups in which, the rats were subjected to cerebral hemorrhage for 6, 24, 48, 72 hours and 7 days, respectively. Then, brain tissues were collected to measure brain water content. BrdU/NeuN and BrdU/GFAP double staining were performed at 3, 7, 14, 21, 28 days after surgery to calculate the number of positive cells.
RESULTS AND CONCLUSION: For both adult and aged rats, the brain water content was significantly higher than that in the normal group and sham operation group (P < 0.05), while in the normal and sham operation groups, the brain water content was significantly lower in the aged rats than the adult rats (P < 0.05). The number of bilateral BrdU-positive cells in the adult and aged model groups was significantly higher than that in the corresponding normal and sham operation groups (P < 0.05), and moreover, the positive cell number at the hemorrhage side was significantly higher than that at the opposite side (P < 0.05). In addition, the number of BrdU-positive cells at the hemorrhage side in the adult rats was significantly higher than that in the aged rats at different time after cerebral hemorrhage (P < 0.05). Results from immunohistochemical double staining showed that the BrdU/NeuN and BrdU/GFAP expression in the hippocampal dentate gyrus of adult rats with cerebral hemorrhage was significantly higher than that of normal adult rats. All these experimental results show that there are a few neural stem cells proliferating in the hippocampal dentate gyrus of normal rats, and the proliferation ability is stronger in the adult rats than the aged rats. Cerebral hemorrhage can significantly strengthen the proliferation of neural stem cells in the dentate gyrus in the adult rats compared with the aged rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cerebral Hemorrhage, Stem Cells, Neural Stem Cells, Hippocampus, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

谢强，王飞，周国平，张惠，马进显. 不同年龄脑出血大鼠海马齿状回神经干细胞增殖与分化差异的比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5426-5431.

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图/表（结果） 1

2.1 实验流程与动物数量分析 入组的动物均进入最后的结果分析，未出现死亡和脱落现象。

2.2 各组大鼠脑含水量检测结果 对成年组和老年组大鼠的脑含水量进行检测，显示两组脑含水量均呈现出不断增加的情况，并于出血后72 h达到最大值，之后逐渐下降(见图1)。成年与老年大鼠脑出血组不同时间的脑含水量均显著高于正常组和假手术组(均P < 0.05)，正常组和假手术组经比较差异无显著性意义(P > 0.05)。老年组正常组和假手术组的脑含水量均显著低于成年组(均P < 0.05)。脑出血不同时间点老年组和成年组经比较差异无显著性意义(均P > 0.05)。见表1。

2.3 成年大鼠脑出血后海马齿状回BrdU阳性细胞数统计结果 成年大鼠正常组和假手术组的海马齿状回BrdU 阳性细胞数经比较差异无显著性意义(均P > 0.05)。正常组和假手术组经比较差异无显著性意义(P > 0.05)。脑出血组不同时间的两侧BrdU 阳性细胞数均显著高于正常组和假手术组(均P < 0.05)，且出血组不同时间的出血侧BrdU 阳性细胞数均显著高于对侧(均P < 0.05)，见表2。

2.4 老年大鼠脑出血后海马齿状回BrdU阳性细胞数统计结果 老年大鼠正常组和假手术组的海马齿状回BrdU 阳性细胞数经比较差异无显著性意义(均P > 0.05)。正常组和假手术组经比较差异无显著性意义(P > 0.05)。脑出血组不同时间的两侧BrdU 阳性细胞数均显著高于正常组和假手术组(均P < 0.05)，且出血组不同时间的出血侧BrdU 阳性细胞数均显著高于对侧(均P < 0.05)，见表3。

2.5 成年、老年大鼠脑出血后出血侧海马齿状回BrdU阳性细胞数统计结果 成年大鼠脑出血后出血侧海马齿状回BrdU 阳性细胞数正常组、假手术组、脑出血组均显著高于相应的老年组大鼠(均P < 0.05)，见表4。

2.6 大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组织化学双标结果 ①成年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫疫组织化学双标结果显著高于正常组(P < 0.05)。②老年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组织化学双标结果显著高于正常组(P < 0.05)。③成年大鼠海马齿状回神经干细胞免疫组织化学双标BrdU/NeuN结果显著高于老年大鼠，BrdU/GFAP 结果显著低于老年大鼠(均P < 0.05)。见表5。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在南阳市中心医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：成年SD大鼠96只，均为3月龄，健康状况良好，体质量250-300 g；老年大鼠96只，均为18-24月龄，健康状况良好，体质量400-550 g。此次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

主要试剂：BrdU 单克隆抗体(上海广锐生物科技有限公司)；NeuN 单克隆抗体(上海瑞齐生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与脑出血模型制备 成年和老年SD大鼠随机各自分为正常组(18只)、假手术组(18只)、脑出血模型组(60只)^[7-8]。其中，脑出血模型组按照时间点划分为3，7，14，21，28 d组。制备脑出血模型制备^[7-8]，模型制备完毕后对大鼠进行行为学评分，如果评分达到1-4分视为造模成功。

1.4.2 BrdU标记^[9-11] 对各组不同时间段神经干细胞进行BrdU脉冲标记，注射后7 d，水合氯醛麻醉后处死正常组和假手术组，并于3，7，14，21，28 d处死其他各组。并进行BrdU累积标记，每天注射50 mg/kg，连续注射3 d，注射完毕后28 d，麻醉后处死大鼠。

1.4.3 鼠脑含水量测定^[12] 脑出血6，24，48，72 h及脑出血7 d，麻醉大鼠，获得大鼠脑组织标本，去掉嗅球和脑干，利用电子精密天平对组织湿质量进行称质量。之后置于干燥箱中进行烘烤，烘烤后对组织干质量进行称质量。记录称质量结果，计算脑含水量。计算公式为：含水量=(湿质量-干质量)÷湿质量×100%。

1.4.4 BrdU/NeuN、BrdU/GFAP双标染色^[13-16] 术后3，7，14，21，28 d，麻醉后处死大鼠，获得脑组织标本，常规制备切片后进行BrdU/NeuN、BrdU/GFAP 双标染色。严格按照试剂盒说明书进行操作，并置于光学显微镜下进行观察，在400倍光镜下，对5个视野中的双标阳性细胞进行计数，并计算平均值。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠脑含水量。②大鼠脑出血后海马齿状回BrdU 阳性细胞数统计结果。③大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组化双标结果。

1.6 统计学分析 对研究过程中的相关数据予以完整记录与收集，使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。组内比较予以配对t 检验，组间比较予以单因素方差分析。计算P 值，差异存在统计学意义的标准为P < 0.05。

讨论

神经干细胞是来源于神经组织或能分化为神经组织的细胞，具有自我更新能力和通过不对称分裂产生不同子代的细胞，临床可用来对脑出血患者进行治疗^[17-19]。治疗过程中，神经干细胞在局部进行分裂增殖，在局部微环境的影响下分化成相应的受损细胞，重建神经环路，产生神经营养因子或神经保护因子，从而抑制神经变性或促进神经再生利用^[20-24]。利用神经干细胞具有自我更新能力，在病变部位不断增殖，重建神经网络，产生神经营养因子或神经保护因子，从而抑制神经变性或促进神经再生利用。

临床治疗过程中，外源性神经干细胞移植治疗存在一定的不足之处，内源性神经干细胞则具有明显的应用优势^[25-27]。但是，关于年龄对脑出血后海马齿状回神经干细胞的增殖影响相关问题，相应的研究和报道相对较少。实验中以老年大鼠和成年大鼠为例进行对比分析。脑出血后，引起细胞内水肿，会导致不同程度脑水肿的出现，导致脑含水量的增加。研究结果显示，成年与老年大鼠脑出血组不同时间的脑含水量均显著高于正常组和假手术组(均P < 0.05)，正常组和假手术组经比较差异无显著性意义(P > 0.05)。老年组正常组和假手术组的脑含水量均显著低于成年组(均P < 0.05)。上述结果表明，在发生脑出血之后，较之成年大鼠，老年大鼠更容易发生脑水肿。

脑出血后，海马齿状回的神经干细胞会被激活，导致其增殖分化能力的不断增强。通过内源性神经干细胞的不断分化和增殖，可以逐渐对老化、受损的神经元予以取代，进而发挥出保护脑结构等作用^[28-30]。在对神经干细胞增殖情况进行检测的时候，利用 BrdU对增殖细胞进行标记和观察是常用的方法^[31-33]。实验结果显示，成年和老年大鼠的脑出血组不同时间的两侧BrdU阳性细胞数均显著高于正常组和假手术组，且出血组不同时间的出血侧BrdU阳性细胞数均显著高于对侧。且成年、老年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组织化学双标结果显示，成年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组化双标结果显著高于正常组。上述结果显示，随着年龄的增加，大鼠神经干细胞的增殖能力会出现不断减弱的情况。即表明，随着年龄的增加，脑内神经的再生能力会出现不断下降的情况。另外，研究结果还显示，成年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞免疫组化双标BrdU/NeuN结果显著高于正常组，BrdU/GFAP结果显著低于正常组，成年大鼠脑出血后出血侧海马齿状回BrdU阳性细胞数正常组、假手术组、脑出血组均显著高于相应的老年组大鼠。分析出现这一结果的原因，可能是因为成年大鼠神经干细胞具有较强的神经元分化能力，但老年大鼠神经干细胞则更多的倾向于分化为胶质细胞。内源性神经干细胞的激活与脑或脊髓损伤区释放的神经生长因子、炎症因子及趋化因子有关，其中生长因子对神经干细胞的增殖、迁移和分化起重要作用^[34]。但是，内源性神经干细胞的增殖、迁移能力有限，分化成神经元的数量不多，难以形成损伤区神经组织结构和功能的重建^[35-37]。因此，临床对脑出血患者进行治疗的过程中，需要结合实际情况，进行必要的外源性神经干细胞移植，以提高治疗效果^[38]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程