CARM1维持羊水干细胞干性的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.014

摘要/Abstract

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文题释义：
羊水干细胞：羊水细胞是由多种来源细胞组成的异质细胞群，包括来源于胎儿表皮、呼吸道、消化道和泌尿道等体腔、管道的脱落细胞和羊膜脱落细胞。近年来研究发现，羊水中含有具多向分化潜能的干细胞，称之为羊水干细胞。目前对于羊水干细胞的自身特征和分子机制的研究非常有限，制约了其向临床应用的进一步转化。
CARM1：作为一种蛋白精氨酸甲基转移酶，CARM1可催化一系列组蛋白和非组蛋白精氨酸残基的甲基化修饰，进而影响一系列生物功能的发生。甲基转移酶活性在调控基因转录过程中起着非常重要的作用。据报道，CARM1介导的组蛋白H3R17和H3R26的精氨酸甲基化修饰，在胚胎干细胞干性的维持上起着非常重要的作用。然而，CARM1在其他成体干细胞，尤其是羊水干细胞干性维持中的作用机制目前仍然不甚明了。

摘要
背景：研究表明，CARM1催化的组蛋白H3R17/R26的甲基化修饰对于胚胎干细胞干性的维持起着非常重要的作用，但其在羊水干细胞干性维持中的作用及机制目前尚不明确。
目的：初步探讨CARM1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制。
方法：分离、培养人妊娠晚期羊水干细胞，RT-PCR鉴定干细胞标志物及CARM1基因的表达。利用CARM1的两条shRNA慢病毒表达载体，沉默羊水干细胞中CARM1基因的表达。RT-qPCR检测CARM1基因的表达沉默效率，Western blot检测组蛋白H3R17的甲基化水平。RT-qPCR检测干细胞标志物OCT4，SOX2和NANOG基因的表达水平。
结果与结论：①人妊娠晚期羊水干细胞能够表达干细胞标志物，包括OCT4、SOX2、Nanog和KLF4，并表达CARM1基因；②CARM1的两条shRNA均能够有效沉默CARM1基因的表达；③CARM1表达沉默后，羊水干细胞中组蛋白H3R17的甲基化水平降低，OCT4和SOX2的表达也降低，而NANOG的表达没有发生变化；④结果表明，CARM1可能通过调控OCT4和SOX2基因的表达，进而起到维持羊水干细胞干性的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0647-8980(吴静)

关键词: 干细胞, 分化, 羊水干细胞, 妊娠晚期, CARM1, 慢病毒, shRNA, 表达沉默, OCT4, SOX2, H3R17甲基化, 干性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that methylation modification using CARM1-catalyzed histone H3R17/R26 can maintain the stemness of embryonic stem cells. However, mechanism underlying CARM1 effect on the stemness of amniotic fluid-derived stem cells is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the function and underlying molecular mechanism of CARM1 to maintain stemness in the amniotic fluid-derived stem cells.
METHODS: Amniotic fluid-derived stem cells from term pregnancy were isolated and cultured. RT-PCR was used to identify the stem cell mark and CARM1 gene expression. CARM1 expression in amniotic fluid-derived stem cells was knocked down by using two shRNA. RT-qPCR was used to detect the silencing efficiency, and western blot employed to examine the methylation level of Arginines 17 at N terminus of histone 3 (H3mR17). Moreover, the expression of embryonic stem cell markers, including OCT4, SOX2 and NANOG, were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Amniotic fluid-derived stem cells from term pregnancy could express CARM1 and stem cell markers, including OCT4, SOX2, Nanog and KLF4. Both of the shRNAs could knock down the expression of CARM1 efficiently. When CARM1 was knocked down, the H3mR17 level was decreased and OCT4, SOX2 expression was also reduced, but NANOG expression had no change. All these indicate that CARM1 is required for amniotic fluid-derived stem cells to maintain stemness through regulating OCT4 and SOX2 expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Amniotic Fluid, Pregnancy Trimester, Third, Protein-Arginine N-Methyltransferases, Lentivirus Infections, Methylation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吴静，赵利华. CARM1维持羊水干细胞干性的机制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5412-5418.

Wu Jing, Zhao Li-hua . CARM1 is required to maintain stemness of amniotic fluid-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5412-5418.

图/表（结果） 1

2.1 妊娠晚期羊水干细胞的分离、培养和鉴定 原代培养7 d后换液，倒置显微镜下观察可见成纤维细胞样细胞呈克隆样生长。继续培养至10 d进行传代培养，标记为第1代。取第2代妊娠晚期羊水干细胞，将人胚胎肝细胞作为阳性对照，293T细胞为阴性对照，RT-PCR检测干细胞标志物的表达情况。结果表明，与人胚胎干细胞相同，人妊娠晚期羊水干细胞也能够表达干细胞标志物OCT4、KLF4、SOX2和Nanog基因(图1)。

2.2 人妊娠晚期羊水干细胞能够表达CARM1基因 取第2代人妊娠晚期羊水干细胞以及人胚胎干细胞，RT-qPCR检测CARM1基因的表达情况。结果发现，人妊娠晚期羊水干细胞能够表达CARM1基因，且其表达水平显著高于其在人胚胎干细胞中的表达水平(图2)。

2.3 利用慢病毒感染系统建立CARM1表达沉默的羊水干细胞系 将慢病毒质粒pGIPZ-GFP-CARM1- shRNA1/2及其包装质粒psPAX2和pMD2G共转入293T细胞中，48 h后于倒置荧光显微镜下观察带有GFP的慢病毒载体的表达。结果显示，95%以上的细胞都表达绿色荧光，保证了重组病毒可被有效获得(图3)。Millipore超滤离心管对所得病毒原液进行浓缩，最终浓缩体积为200-300 μL。将6孔板中长势良好、汇合度约为50%的羊水干细胞中加入2 mL羊水干细胞完全培养基，再加入50 μL上述浓缩病毒，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱，24 h后置换新鲜培养基后继续培养，48 h后置于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光的表达。结果显示，90%以上的羊水干细胞都表达绿色荧光(图3)。

2.4 CARM1 shRNA可显著沉默CARM1基因的表达 RT-qPCR检测shRNA的干扰效率，结果显示，2条shRNA均可有效沉默CARM1基因的表达水平(图4)。

2.5 CARM1表达沉默后，组蛋白H3R17的甲基化水平降低 蛋白质免疫印迹实验检测野生型和CARM1表达沉默型人妊娠晚期羊水干细胞中CARM1的催化底物，即组蛋白H3第17号位精氨酸的甲基化水平。结果表明，CARM1表达降低后，H3R17的甲基化水平降低(图5)。

2.6 CARM1表达沉默后，干细胞标志物表达情况 RT-qPCR检测野生型羊水干细胞和CARM1表达沉默的人妊娠晚期羊水干细胞中干细胞标志物，包括OCT4，SOX2和NANOG的表达情况。结果表明，CARM1表达沉默后，OCT4和SOX2的表达明显降低，而NANOG的表达没有变化(图6)

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引言

近年来发现羊水中含有干细胞，并命名为羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cell，AFSC)^[1-3]。羊水干细胞具有获取方便、增殖速度快、分化潜能大以及无体内致瘤性等优点，在细胞治疗和组织工程研究中具有广阔的应用前景^[3-6]。

目前很多研究都已证明羊水干细胞具有干细胞的特性，即具有自我复制能力和多向分化潜能，但其干性维持的分子机制目前尚未被阐明，其自身一些特征和特性也不清楚，从而限制了向临床应用的转化。事实上，在胚胎干细胞中的研究已经表明，表观遗传修饰，例如DNA的甲基化和组蛋白修饰等，在胚胎干细胞干性维持方面，起到了非常重要的作用，改变细胞的表观遗传修饰，能够改变胚胎干细胞的分化潜能^[7-9]。目前羊水干细胞表观遗传修饰在维持其干性方面的作用及分子机制仍然不甚明了。

CARM1即共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶 1(coactivitor-associated arginine methyltransferase 1，CARM1)，也称蛋白精氨酸甲基转移酶4(protein argine methyltransferase 4, PRMT4)，属于蛋白精氨酸甲基转移酶家族中的蛋白成员，可催化细胞内组蛋白及非组蛋白精氨酸残基的甲基化修饰。作为一种转录共激活因子，CARM1主要催化组蛋白H3第17号位(R17)和26号位(R26)精氨酸的甲基化修饰，促进基因的转录激活^[10]。研究表明，CARM1介导的组蛋白H3R17和H3R26的甲基化修饰，作为一种重要的表观遗传修饰，在胚胎干细胞干性的维持上起着非常重要的作用^[7^，⁹^，^11-12]。然而，CARM1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制犹未可知。

实验初步探讨了CARM1在羊水干细胞干性维持中的作用及其分子机制，旨在帮助研究者更深入了解羊水干细胞的特性，为今后其在细胞治疗及组织工程方面的广泛应用提供坚实的理论基础和技术支持。

材料方法

1.1 设计 细胞学基础实验研究。

1.2 时间及地点 实验于2013年1月至2015年2月在上海市儿童医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 标本 羊水标本取自妊娠期34-40周正常剖宫产产妇，于剖宫产术时抽取羊水标本20-50 mL。标本取样前经产妇知情同意。研究获上海交通大学附属上海市儿童医院伦理委员会批准。

1.3.2 质粒和细胞 人胚胎干细胞、pGIPZ-GFP- CARM1-shRNA、psPAX2和pMD2G质粒均由上海市调控生物学重点实验室翁杰敏教授惠赠；293T细胞购自ATCC。

1.3.3 主要试剂 高糖DMEM培养基、α-MEM培养基、胎牛血清(Gibco)；0.25%胰蛋白酶、Chang B、Chang C培养基(Irvine Scientific)；opti-MEM (Life Technology)；反转录试剂盒(RR037A, TAKARA)；SYBR^® Premix Ex Taq™Taq酶(RR420Q，TAKARA)；FuGENE6 (Promega)；anti-H3R17me2抗体(ab8284，Abcam)；anti-H3抗体(ab1791, Abcam)。

1.3.4 主要仪器 荧光倒置显微镜(Leica Germany)；全自动细胞计数仪(Countstar)；二氧化碳恒温细胞培养箱(HealForce)；双色红外激光成像系统(ODYSSEY)；实时荧光定量PCR仪(安捷伦Mx 3000P)。

1.4 实验方法

1.4.1 孕晚期羊水干细胞的分离、培养和鉴定 收集的羊水于常温下1 000 r/min离心10 min，弃上清，收集细胞。加入含有1%双抗的PBS洗涤3次，1 000 r/min离心10 min，弃上清。将细胞接种至6 cm培养皿中，加入羊水干细胞培养液(α-MEM培养基+体积分数为10%胎牛血清+ 18% Chang B+ 2% Chang C + 1%青链霉素)，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养10 d，弃去培养基上清及未贴壁细胞，PBS清洗一两次，用0.25%胰酶将贴壁细胞消化后重新铺板，标记为第1代。RT-PCR鉴定干细胞标志物OCT4、KLF4、SOX2和Nanog基因的表达。

1.4.2 慢病毒包装及感染

慢病毒的制备：转染前1 d将3.4×10⁶个293T细胞铺在10 cm培养皿中，第2天待细胞融合至60%-70%后进行转染。利用Roche公司的非脂质体型(non-liposomal)转染试剂FuGENE 6，将pGIPZ-GFP-CARM1-shRNA、psPAX2和pMD2G质粒按照1.65 μg，1.1 μg和1.1 μg的比例进行转染。转染过程按照FuGENE 6的说明书进行。培养48 h和72 h后分别收集上清，Millipore超滤离心管4 000 r/min离心30 min对病毒进行浓缩。浓缩好的病毒用于感染羊水干细胞，剩余的病毒分装后置于-80 ℃保存。

慢病毒感染：感染前1 d将羊水干细胞消化后重新铺于6孔板中培养，待第2天细胞融合至50%左右进行感染，感染时取50 μL浓缩病毒加入羊水干细胞培养基中。48 h后置于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光以检测感染效率，收集细胞以便后续实验。

1.4.3 RT-qPCR

RNA的提取：取置于6孔板中1个孔的细胞，加入1 mL Trizol，充分裂解后，移入1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，静置2.0-3.0 min，12 000 r/min离心15 min，小心吸取上清，加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温静置10 min，12 000 r/min离心15 min，弃上清，体积分数为75%乙醇洗涤后晾干，加入DEPC水溶解，得总RNA。

RT-PCR：按照TAKARA反转录试剂盒说明说要求，取上述1 μg RNA反转录成为cDNA。普通PCR及qPCR反应按照TAKARA PCR反应试剂盒说明书要求(R001B和RR071A)操作，取1 μL cDNA为模板，进行PCR反应。引物序列表1。

1.4.4 蛋白质免疫印迹实验 利用RIPA裂解液 [50 mmol/L Tris(pH 7.4)、150 mmol/L KCl、1% Triton X-100、0.1% Sodium Deoxycholate、1% SDS、1 mmol/L EDTA]，获取妊娠晚期羊水干细胞全细胞裂解液。2×SDS上样缓冲液对倍稀释，95 ℃煮样10 min，利用15%十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶进行电泳。经过电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光成像，检测蛋白表达水平。

1.5 主要观察指标 ①通过检测CARM1基因的表达水平以及组蛋白H3R17的甲基化水平，检测两条shRNA干扰CARM1基因表达的效果；②检测干细胞标志物OCT4、SOX2和Nanog基因在CAMR1野生型羊水干细胞和CARM1表达沉默型羊水干细胞中的表达差别。

讨论

2007年，De Coppi等从人孕中期羊水中分离出CD117阳性细胞，将其培养至250代后，仍可保持正常的核型和二倍体结构；在特定的诱导条件下，其能够分化出全部3个胚层的细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞、生肌细胞、内皮细胞、神经细胞和肝细胞，将其命名为羊水干细胞^[1^，⁸^，^13-15]。后续的研究证实，羊水干细胞可在妊娠各个阶段收集的羊水中获得，具有获取方便，增殖速度快，分化潜能大以及无体内致瘤性等优点，引起了人们的极大重视^[2-4^，^6]。

目前，关于羊水干细胞的研究大都集中组织工程研究^[14^，^16-19]，即其多向分化潜能，而对于羊水干细胞本身特点的认识却不够深入，使得其无法在向临床转化上取得突破。例如羊水干细胞是如何维持其干性，保持其多向分化潜能的分子机制目前仍然不甚明了。

研究发现，表观遗传修饰在胚胎干细胞干性维持方面起到了非常重要的作用，改变细胞的表观遗传修饰，能够改变干细胞分化的潜能。Torres-Padilla等^[7]研究表明，CARM1介导的组蛋白H3R17和H3R26的甲基化修饰程度将影响早期小鼠胚胎的分化潜能。Wu等^[11]发现CARM1做为一种组蛋白精氨酸甲基化酶，对于维持胚胎干细胞的干性以及抑制其分化是必须的，CARM1通过甲基化Oct4/Pou5f1和Sox2基因启动子区域组蛋白H3R17和H3R26，促进其转录激活，进而促进了胚胎干细胞干性的维持。因此，CARM1介导的组蛋白H3R17和H3R26的精氨酸甲基化修饰，在胚胎干细胞干性的维持上起着非常重要的作用。

CARM1属于PRMT家族中的Ⅰ型蛋白成员，即可催化精氨酸侧链的ω-N形成非对称双甲基(asymmetric ω-NG，N’G-dimethylarginine，aDMA)，在所检测的组织中都有表达，在心、肾和睾丸中表达较多。CARM1可催化组蛋白H3氮端的2、17和26号位，碳端的128、129、131、134号位以及H2A上的精氨酸甲基化，其中精氨酸17号位(R17)和26号位(R26)是CARM1的主要催化位点。除组蛋白外，CARM1还可甲基化许多非组蛋白，进而影响一系列生物功能的发生，具有广泛的生物学意义^[10^，^20-25]。

目前，CARM1在羊水干细胞中的表达及其对羊水干细胞干性维持方面的作用目前尚未见报道。实验通过贴壁法从人妊娠晚期的羊水中成功分离培养出羊水干细胞。RT-PCR检测结果表明，人妊娠晚期羊水干细胞与人胚胎干细胞一样，都能够表达干细胞标志物OCT4、SOX2、Nanog和KLF4基因，而阴性对照组293T细胞中则没有上述基因的表达。同时，还成功地将分离得到的妊娠晚期羊水干细胞诱导成为成骨细胞(数据尚未发表)，说明妊娠晚期羊水干细胞仍然具有羊水干细胞的特性。RT-qPCR实验表明，人妊娠晚期羊水干细胞中的确存在CARM1基因的表达，且其表达量高于其在人胚胎干细胞中的表达。然而CARM1在羊水干细胞中高表达的作用及机制犹未可知。

研究基因功能常用的方法即在细胞水平沉默(Knock down，KD)或过表达(Over expression，OE)该基因。然而，羊水干细胞的质粒转染效率十分低下。据Karlmark等^[26]的报道，羊水干细胞的转染效率仅为0.97%。如此低下的转染效率严重阻碍了羊水干细胞的功能研究进程。实验利用三质粒慢病毒感染系统感染羊水干细胞，以此提高羊水干细胞的质粒导入效率。结果表明，三质粒慢病毒感染系统具有很高的感染效率，感染48 h后通过荧光显微镜观察绿色荧光的表达，大约90%以上的羊水干细胞均可表达绿色荧光。随后的实验表明，所选取的2条shRNA均可有效干扰CARM1基因的表达，且CARM1表达被沉默后，其作用底物组蛋白H3R17的甲基化水平也明显降低。

众所周知，转录因子OCT4、SOX2和NANOG通过调节胚胎干细胞的基因转录，对其多潜能性和自我更新能力具有关键性的调控作用^[8^，^26-30]。实验发现，CARM1表达沉默的人妊娠晚期羊水干细胞中，其干细胞标志物OCT4和SOX2基因的表达明显降低，而NANOG基因的表达没有变化。这与Wu等在鼠源胚胎干细胞中的研究有所不同。Wu等^[11]发现，当在鼠源胚胎干细胞中沉默CARM1基因表达后，OCT4、SOX2和Nanog的表达均降低。造成这种差异的原因可能是由于两次研究中所使用细胞系的物种及种类不同导致的。尽管此研究与Wu等研究提示，CARM1在维持鼠源胚胎干细胞与人源羊水干细胞干性方面均起到一定作用，但其具体作用机制可能有所差异。事实上，Wu等^[11]研究还发现，CARM1野生型鼠源胚胎干细胞中，CARM1能够结合在OCT4和SOX2的启动子区域，但却不能结合在Nanog基因的启动子区域，说明在生理状态下，CARM1正是通过调控OCT4和SOX2基因的表达来维持鼠源胚胎干细胞的干性。实验表明，CARM1可能通过调控OCT4、SOX2基因的表达，起到维持羊水干细胞干性的作用。

综上所述，实验首次从分子以及表观遗传修饰水平上探讨了羊水干细胞干性维持的机制，将使研究者深入了解羊水干细胞的特性，为今后其在细胞治疗及组织工程方面的广泛应用提供坚实的理论基础和技术支持；同时，对羊水干细胞干性维持的分子机制的研究，还可深化干细胞研究的基础理论，有助于建立稳定、优化羊水干细胞的培养体系，保证稳定培养能满足临床治疗或药物开发等需求的羊水干细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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延伸阅读

由于临床需求，干细胞在现代医学的基础研究与应用中发挥越来越重要的作用。但因伦理问题，胚胎干细胞的研究和临床应用受到制约，而成体干细胞自身分化潜能和增殖能力均有限，只能分化出部分细胞和组织。羊水干细胞的发现为干细胞的研究开辟了新的领域。与成体干细胞相比较，羊水干细胞具有获取方便、增殖速度快、分化潜能大、以及在无体内致瘤性等优点。从已有的研究结果来看，羊水来源干细胞有望作为一种新的种子细胞，应用于组织工程领域的研究与细胞治疗。尽管目前对于羊水干细胞的应用研究取得很大进展，但羊水干细胞本身的特点认识却不够深入，其干性维持的分子机制也不明了，限制了其向临床应用的转化。
近年来关于表观遗传修饰在干细胞干性维持和多向分化潜能中的作用和机制成为干细胞研究的热点，而对表观修饰在成体干细胞中的作用和机制研究较少。事实上，成体干细胞与胚胎干细胞存在着较大的差异性，胚胎干细胞中的研究成果并不能完全适用于成体干细胞。因此，对成体干细胞进行更深入的研究是必须的。研究从表观遗传修饰的水平上探讨了羊水干细胞干性维持的分子机制，首次提示CARM1可能通过调节OCT4和SOX2基因的表达，起到维持羊水干细胞干性的作用。实验进一步从分子及表观遗传修饰的水平上探讨羊水干细胞干性维持的机制，将使研究者深入了解羊水干细胞的特性，为今后其在细胞治疗及组织工程方面的广泛应用提供坚实的理论基础和技术支持。