心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
心脏干细胞：可以细分为多个亚类，不同的心脏干细胞其表面标志物或来源不同，在心脏的发生、发育、修复与重塑过程中发挥重要作用。利用心脏干细胞修复受损的心脏，改善患者的心功能，是干细胞临床研究领域的热点。
细胞凋亡：细胞凋亡属于一种细胞程序性死亡，在一定的条件下，细胞内一些相关基因被启动，便会激活相应的内源性DNA内切酶，导致细胞的主动性死亡。细胞凋亡涉及到不同的基因，包括促凋亡基因以及抗凋亡基因。

摘要
背景：心肌细胞凋亡会导致多种心脏疾病的出现，常规治疗大多无法获得理想的效果。心脏干细胞相关理论的出现，颠覆以往心肌细胞不可再生的观点，为各种心脏疾病的治疗提供了新思路。
目的：探讨心脏干细胞在心肌细胞凋亡中的保护机制。
方法：取5只新生大鼠进行心脏干细胞分离与培养，另取20只Wistar大鼠制备心肌梗死模型，然后随机分为2组，每组10只，分别设为观察组和对照组，建模后1 d，分别予以心脏干细胞与培养液注射。治疗后14 d，计算两组的心肌细胞凋亡指数，并检测两组心肌细胞凋亡相关蛋白表达情况。
结果与结论：①细胞形态：连续培养3 d，组织块呈现出完全铺展生长状态，组织块中爬出少量的类纤维细，磁珠分离后进行传代培养5 d后，可观察到细胞重新聚集成团；②心肌细胞凋亡情况及相关蛋白表达：观察组的心肌细胞凋亡指数、Fas蛋白吸光度值和Fasl蛋白吸光度值均显著小于对照组(P < 0.05)，Bcl-2蛋白吸光度值显著大于对照组(P < 0.05)；③结果表明，通过对心肌梗死大鼠进行心脏干细胞移植治疗，可有效调节细胞凋亡相关蛋白的表达情况，抑制心肌细胞的凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5644-5645(高学东)

关键词: 干细胞, 移植, 心脏干细胞, 心肌梗死, 心肌细胞, 细胞凋亡, Fasl蛋白, Fas蛋白, Bcl-2蛋白, 保护, 大鼠, 细胞分化, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Myocardial apoptosis can lead to many kinds of heart diseases, but most of the conventional treatments cannot get desired effects. The emergence of cardiac stem cell related theory that subverts the previous view of myocardial cells provides a new idea for the treatment of a variety of heart diseases.
OBJECTIVE: To investigate the protective mechanism of cardiac stem cells in myocardial apoptosis.
METHODS: Cardiac stem cells were isolated from five neonatal rats. Another 20 Wistar rats were selected to make myocardial infarction models, and then model rats were equivalently randomized into observation and control groups. One day after modeling, rats in each group were given injection of cardiac stem cells or culture solution. Fourteen days after injection, myocardial apoptosis index was calculated and expression of apoptosis-related proteins was detected in both groups.
RESULTS AND CONCLUSION: After continuous 3 days of culture, a completely spread growth in the cardiac tissues was visible, and a small amount of cells similar to fibrocytes climbed out from the cardiac tissue sample. These cells isolated using magnetic bead method were sub-cultured for 5 days, and found to be regrouped again. Compared with the control group, the apoptotic index, Fas and Fasl expression were significantly lower (P < 0.05), and Bcl-2 expression was significantly higher in the observation group (P < 0.05). All these findings show that cardiac stem cell transplantation can effectively regulate the expression of apoptosis-related proteins and inhibit the apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

高学东，胡科，魏虎. 心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5405-5411.

Gao Xue-dong, Hu Ke, Wei Hu. Protective mechanism of cardiac stem cells against myocardial apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5405-5411.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年2月至2015年4月在南阳医学专科学校动物实验室完成。

1.3 材料 新生雄性Wistar大鼠5只，体质量7-10 g，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，用于进行心脏干细胞分离与培养。健康雄性Wistar大鼠20只，用于进行动物实验，由北京隆安实验动物养殖中心提供，体质量约350 g。动物均饲养于本校动物中心SPF环境，常规喂养。

1.4 实验方法

1.4.1 心脏干细胞分离与培养 新生大鼠麻醉后处死，无菌环境下获得完整心脏组织，D-PBS液(Hyclone公司)进行洗涤，显微剪剪成小块(1.0-2.0 mm³)，添加胰蛋白酶(Sigma公司)+胶原酶Ⅳ(Sigma公司)混合液进行消化，连续吹打30 s，振荡后置于二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)中进行培养^[10]，5 min后取出，添加等体积DMEM(上海显益化学科技有限公司)，含胎牛血清(Sigma公司)，再次机械吹打后静置。待大部分细胞下沉至管底后收集上清液，过滤后利用CEM，含胎牛血清、L-谷氨酰胺(美国PeproTech公司)、青霉素(江苏凯基生物技术股份有限公司)、2-巯基乙醇(北京旷博生物技术股份有限公司)、链霉素(江苏凯基生物技术股份有限公司)进行洗涤，洗涤结束转移至培养皿中，添加CEM 2 mL，置于培养箱中进行培养。

连续培养4-6 h后，轻轻摇晃培养皿，若组织块牢固贴敷在底部，则添加5 mL培养液继续进行培养，培养三四天进行1次半量换液。进行常规传代培养，收集P3细胞用于随后的实验。

1.4.2 免疫磁珠分选 将丙烯醛加入磁性微球悬液中，与兔抗大鼠c-kit多克隆抗体(碧云天生物技术研究所)进行共同孵育。孵育12 h后利用MPC磁力架对磁珠进行回收，获得抗体标记的免疫磁珠，并将其保存在体积分数1%BSA的PBS中。实验严格按照产品说明书相关操作，利用免疫磁珠细胞分离产品实施富集纯化。对待分离细胞进行离心收集，添加少量PBE孵育液后，于真空条件下进行除菌，并进行液体内气体抽滤。处理完毕添加免疫磁珠包被的小鼠抗大鼠CD45抗体(碧云天生物技术研究所)，置于4 ℃条件下进行0.5 h的孵育。孵育结束利用PBE对细胞进行洗涤，离心后再添加PBE对混悬细胞。在磁场中安装分离柱，对分离柱进行预处理，添加0.5 mL PBE，利用重力作用自然流尽液体。预处理结束在分离柱尾部连接限速针头，对首次流下的细胞进行收集，即获得CD45^-细胞。细胞收集完毕后利用免疫磁珠包被的兔抗大鼠c-kit多克隆抗体进行孵育，孵育0.5 h后过柱，最后收集到的细胞即为为CD45^-/c-kit⁺细胞^[11]。

1.4.3 分组及心脏干细胞移植 对20只大鼠进行常规麻醉，达到麻醉效果之后于左胸前外侧做切口，暴露心脏，对冠状动脉左前降支进行结扎，制备心肌梗死模型^[12]。将20只大鼠随机分为观察组与对照组，结扎后即刻分别用微量注射器经心外膜下在梗死心肌周围分4点，予以400 μL的CD45^-/c-kit⁺细胞悬液(1×10⁷)或等量DMEM培养液注射治疗。术后常规关闭切口，常规喂养。

1.4.4 TUNEL染色 术后30 d，麻醉后处死动物，即刻获得心脏组织，PBS洗涤后利用甲醛溶液(北京众实迪创科技发展有限责任公司)进行固定。常规制备切片后，严格按照试剂盒说明书，利用凋亡细胞检测试剂盒(美国Biotium)，通过TUNEL法对凋亡细胞核进行标记，DAB显色试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)显色后进行苏木精复染。于高倍视野(×400)下对切片进行观察和细胞计数，对凋亡阳性心肌细胞核数目进行计数，并计算心肌细胞凋亡指数。计算方法为：心肌细胞凋亡指数=(凋亡阳性心肌细胞核数量/统计总细胞核数量)×100%。

1.4.5 免疫组织化学染色 使用Bcl-2，Fas，Fasl免疫组织化学试剂盒(Sigma公司)，严格按照试剂盒说明书进行操作，1∶100稀释的Bcl-2，Fas，Fasl，BrdU单克隆抗体作为一抗，DAB显色试剂盒显色后进行苏木精(上海万疆生物技术有限公司)复染。随机选择10个视野，利用彩色病理图文分析系统于400×下分别测量上述基因在260 nm处的平均吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①心脏干细胞培养观察结果；②两组心肌细胞凋亡相关蛋白吸光度值检测结果；③TUNEL染色检测细胞凋亡情况，免疫组织化学染色法检测两组心肌细胞凋亡相关蛋白表达情况。

1.6 统计学分析 计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。组间数据差异的比较采用t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心血管疾病是当今威胁人类健康最严重的疾病之一，其中由于心肌梗死引起心肌细胞死亡等是导致心力衰竭的主要原因之一^[13]。其高发病率、高致残致死率已成为中国重大健康问题，并且呈现发病患者数量持续增加、年轻化等趋势。但是，心肌细胞不可再生，因此，常规方法治疗心肌梗死无法获得理想的临床效果^[14-15]。

当前，干细胞移植已经成为多种疾病的重要治疗手段。近年来，人们不断探索新的治疗手段，干细胞被认为是再生和修复心肌的重要来源之一，已有多种类型的干细胞被证明具有向心肌分化的能力^[16-18]。目前，利用干细胞分化出心肌细胞从而修复受损心脏组织、治疗心脏病，在短期心功能改善方面效果显著，使得干细胞迅速进入到人类心肌梗死临床试验阶段，成为领域研究的一大热点^[19]。细胞治疗是通过将干细胞移至心肌梗死区，增加或保持心肌细胞数量，促进局部血管新生、改善心肌缺血、提高缺血心肌的收缩功能的治疗方法，或许能成为治疗末期缺血性心脏病的新方法^[20-22]。经过移植之后，干细胞可以在梗死心肌内发生存活，促进血管新生和局部微血管的增生，减少心肌细胞凋亡，改善心肌重构，促进心脏功能的恢复，达到治疗疾病，改善患者生活质量等目的^[23]。

心肌细胞凋亡与心肌梗死之间存在着十分密切的联系。心肌细胞凋亡可发生于多种心血管疾病，而且凋亡是心肌功能发生恶化时的重要表现。心肌细胞凋亡属于程序性死亡，整个过程由相关基因介导。心肌细胞凋亡会导致心肌梗死后心室重构期心肌收缩单元的不断丧失，与心功能进行性下降之间存在十分密切的联系^[24-26]。同时，心肌凋亡还可以与心室重构之间发生相互作用，共同促进心力衰竭的发展。而利用不同干细胞移植方式治疗的过程中，干细胞可以发挥出相应的作用来，对心肌细胞凋亡产生一定的影响^[27]。干细胞归巢或移植人心脏后能够使心肌组织再生，能够取代失去功能的心肌细胞以及抑制心肌细胞凋亡。杨水祥等^[28]利用人脐血间充质干细胞对心肌细胞予以干预，并观察干细胞的作用情况及其对心肌细胞凋亡的影响。通过研究发现，与安全性人脐血间充质干细胞可以发挥出明显的抑制人心肌细胞凋亡的作用。为此，在利用干细胞移植方式进行心肌梗死治疗的时候，需要考虑到心肌细胞凋亡问题，了解干细胞的相关作用机制。并采取有效方式，对心肌细胞予以保护，抑制其凋亡^[29-30]。

实验取5只新生大鼠心脏组织进行心脏干细胞分离、培养，并均制备心肌梗死模型，予以心脏干细胞注射治疗。在观察心脏干细胞对心肌细胞凋亡相关作用机制的时候，选择通过对相关凋亡基因的观察来了解细胞作用机制。细胞凋亡指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束自己生命的过程。细胞凋亡属于一种细胞程序性死亡，从基因角度进行分析，在一定的条件下，细胞内一些相关基因被启动，便会激活相应的内源性DNA内切酶，导致细胞的主动性死亡^[31-32]。在整个过程中，细胞凋亡的发生由不同的基因进行控制，其中包括bax等促凋亡基因以及bcl-2等抗凋亡基因。促凋亡基因可以对细胞凋亡产生促进作用，加快其凋亡。而抗凋亡基因则可以发挥出抑制作用，对细胞凋亡产生有效的抑制^[33]。抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例，在一定程度上决定了细胞是否发生凋亡，Bax/Bcl-2比值的变化通过减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成来抑制细胞凋亡。Bax/Bcl-2异源二聚体与Bax/Bax同源二聚体的比例，决定了细胞对凋亡信号的反应。其中，当bcl-2基因表达水平上调的时候，可以发挥出较强的细胞凋亡抑制作用，减弱细胞凋亡，繁殖，细胞凋亡加强。根据Bcl-2蛋白表达的变化，可以推测干细胞可能通过旁分泌的作用改善微环境，参与对心肌细胞凋亡蛋白家族的调控，保护线粒体而实现的，但其确切的分子机制仍有待进一步研究。高青等^[34]对急性心肌梗死家兔实施经bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗，术后通过检测发现，干细胞移植治疗可以有效减少模型动物心肌细胞的凋亡，并改善动物的心功能。Fas抗原属于肿瘤坏死因子受体超家族，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，可以发挥出介导细胞凋亡的作用，是一种特殊的细胞膜分子，与Fasl结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡^[35-37]。Fasl属于肿瘤坏死因子，主要表达于活化的T细胞和B细胞^[38]。Fasl可以通过三聚体的形式与Fas抗原发生结合，共同发挥出对神经鞘磷脂酶活化予以有效诱导的作用。进而对神经鞘磷脂予以分解，生成神经酰胺，并引发一系列的生化反应，发挥出重要的介导，促进心肌细胞的凋亡^[39-50]。实验结果显示，对两组的心肌细胞凋亡相关蛋白表达情况进行检测和比较，可得观察组的心肌细胞凋亡指数、Fas蛋白吸光度值和Fasl蛋白吸光度值均显著小于对照组，Bcl-2蛋白吸光度值显著高于对照组。即提示，经过心脏干细胞注射治疗之后，心机梗死动物心肌细胞凋亡相关蛋白表达水平会得到有效的调节，其中，上抗凋亡基因表达水平得到显著上调，促凋亡基因表达水平显著下调，达到理想的心肌细胞保护效果。

综上所述，实验结果初步证实，通过心肌组织体外培养，可以获得心脏干细胞，通过对心肌梗死大鼠进行心脏干细胞移植治疗，可以有效调节细胞凋亡相关蛋白的表达情况，发挥出良好的保护机制，抑制心肌细胞的凋亡。