经肝动脉途径兔自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.011

摘要/Abstract

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文题释义：
干细胞移植治疗肝硬化的途径：主要有肝动脉、门静脉、脾动脉、外周静脉、脾脏注射、腹腔内注射等途径。理论上经肝动脉或门静脉途径移植治疗肝硬化的效果最理想，因为肝脏本身才是干细胞定植、分化、增殖的最佳场所。肝硬化常常合并门静脉高压，经门静脉途径移植干细胞，可能经过广泛的门-体静脉循环或动脉-静脉-门静脉之间的分流引起门静脉的栓塞，从而导致肝功能的衰竭和严重的门静脉高压，消化道出血；同时移植的干细胞还有可能经过门-体静脉循环迁移到肺组织并引起肺栓塞，因此，临床上经门静脉途径移植干细胞受到一定限制。肝动脉血流速度快，移植的干细胞的“着床”时间过短，干细胞在肝脏内分化、增殖的数量较少。因此如何使移植的干细胞更多的在肝内停留、分化是一个重要问题，也是经肝动脉途径骨髓干细胞移植治疗肝硬化的关键。
谷丙转氨酶：存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中 1 000-3 000倍。肝细胞或某些组织损伤或坏死，都会使血液中的谷丙转氨酶升高。1%的肝细胞损伤可以使血液中的丙氨酸转氨酶浓度升高1倍。因此，谷丙转氨酶是反映肝细胞受损程度最灵敏的指标，在肝功能检查中最为常用。

摘要
背景：如何使移植的骨髓干细胞更多的在肝内停留、分化是一个重要问题，也是经肝动脉途径移植骨髓干细胞治疗肝硬化的关键。
目的：探讨经肝动脉途径移植自体骨髓干细胞对肝硬化的治疗效果。
方法：将30只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组，干细胞移植组，模型对照组，每组10只。正常对照组不做任何处理，其余2组均建立肝硬化模型，干细胞移植组经肝动脉途径给予自体骨髓干细胞。在骨髓干细胞移植后的第1，2，4，8，10周分别检测肝功能指标，在第10周进行肝脏病理学检查。
结果与结论：①骨髓干细胞移植第10周，干细胞移植组血清谷丙转氨酶、总胆红素、谷草转氨酶水平有所降低，活化部分凝血激酶时间明显减短，白蛋白水平升高，与模型对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；②干细胞移植组肝细胞形态完整，没有明显的水肿，假小叶结构仍然存在，与模型对照组比较，肝组织的纤维化程度明显减轻；③结果表明，经肝动脉途径移植自体骨髓干细胞可在短时间内提高体内白蛋白含量，改善机体肝功能，对肝硬化具有一定的治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1200-176X(王海舫)

关键词: 干细胞, 移植, 肝硬化, 细胞移植, 自体骨髓干细胞, 肝动脉

Abstract:

BACKGROUND: How to make more transplanted bone marrow stem cells stay and differentiate in the liver is an important issue, which is also crucial for treatment of liver cirrhosis via the hepatic artery.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of autologous bone marrow stem cell transplantation via the hepatic artery on liver cirrhosis.
METHODS: Thirty New Zealand white rabbits were equivalently randomized into normal control, stem cell transplantation and model groups. Animal models of liver cirrhosis were made in the latter two groups. Then, model rabbits in the stem cell transplantation group were subjected to autologous bone marrow stem cell transplantation via the hepatic artery. Liver function of rabbits was detected in 1, 2, 4, 8, 10 weeks after cell transplantation, and pathological detection of the liver was performed in the 10th week.
RESULTS AND CONCLUSION: At 10 weeks after cell transplantation, the liver function of the rabbits was improved significantly compared with the model group, including reduced activities of serum alanine aminotransferase, total bilirubin and aspartate aminotransferase, shortened activated partial thromboplastin time, and increased albumin level (P < 0.05). Pathological examination of the liver showed that the liver cells in the stem cell transplantation group were intact with no obvious edema and still had the structure of the pseudolobule, and compared with the model group, the degree of liver fibrosis was significantly reduced in the stem cell transplantation group. Our experimental results show that the transplantation of autologous bone marrow stem cells via the hepatic artery has a certain therapeutic effect on liver cirrhosis by increasing the body albumin content in a short time and improving the liver function.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Cirrhosis, Myeloid Progenitor Cells, Stem Cell Transplantation, Hepatic Artery, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王海舫，刘洪霞，邵菲，贾蓓，张岁，周靖. 经肝动脉途径兔自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5392-5397.

Wang Hai-fang, Liu Hong-xia, Shao Fei, Jia Bei, Zhang Sui, Zhou Jing. Autologous bone marrow stem cell transplantation for liver cirrhosis via the hepatic artery in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5392-5397.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] 李小红,叶军.中医及中西医结合治疗肝硬化研究进展[J].实用中医内科杂志,2011,25(12):49-51.
[2] 范婷婷,谢渭芬.肝纤维化和肝硬化治疗进展[J].国际消化病杂志,2010,30(6):349-351.
[3] 张海苗.不同干预方法对肝硬化住院患者心理社会状况、生活质量及疗效的影响[D].长沙:中南大学,2011.
[4] 卢昆云,杨晋辉.干细胞移植治疗肝硬化的移植途径及优缺点比较[J]. 临床肝胆病杂志,2011,27(11): 1226-1228, 1232.
[5] Yao P, Zhan Y, Xu W, et al. Hepatocyte growth factor-induced proliferation of hepatic stem-like cells depends on activation of NF-kappaB. J Hepatol. 2004; 40(3):391-398.
[6] 姚鹏,詹轶群,许望翔,等.细胞生长因子在体外对大鼠肝干细胞的影响[J].中华肝脏病杂志, 2003,11(1):33-36.
[7] Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 1999;284(5417):1168-1170.
[8] Miyazaki M, Akiyama I, Sakaguchi M, et al. Improved conditions to induce hepatocytes from rat bone marrow cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 298(1):24-30.
[9] Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 2004;364(9429):141-148.
[10] 金博,程留芳,孙涛,等.兔四氯化碳实验性肝硬化模型的建立[J].海军总医院学报,2005,18(3):129-131.
[11] 熊全,冯吉,王军,等.3种不同途径移植骨髓间充质干细胞治疗肝硬化模型大鼠的效果比较[J]. 第三军医大学学报, 2011,33(8):804-808.
[12] Kania G, Blyszczuk P, Jochheim A, et al. Generation of glycogen- and albumin-producing hepatocyte-like cells from embryonic stem cells. Biol Chem. 2004;385(10): 943-953.
[13] 李力,滕皋军.肝细胞移植实验研究中大鼠肝细胞的冻存与复苏初探[J].中华放射学杂志,2002,36(4):369-372.
[14] Malhi H, Gupta S. Hepatocyte transplantation: new horizons and challenges. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2001;8(1):40-50.
[15] Avital I, Feraresso C, Aoki T, et al. Bone marrow-derived liver stem cell and mature hepatocyte engraftment in livers undergoing rejection. Surgery. 2002;132(2):384-390.
[16] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418(6893):41-49.
[17] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001; 410(6829):701-705.
[18] Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 1999;284(5417):1168-1170.
[19] Oh SH, Miyazaki M, Kouchi H, et al. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2000;279(2):500-504.
[20] Zhou YM, Hu DR, Yao P, et al. Study of mouse marrow cells differentiation into a hepatocyte lineage in vitro. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2004;12(12):722- 725.
[21] Theise ND, Badve S, Saxena R, et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation.Hepatology. 2000; 31(1):235-240.
[22] Avital I, Inderbitzin D, Aoki T, et al. Isolation, characterization, and transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;288(1):156-164.
[23] Mitchell C, Fausto N. Bone marrow-derived hepatocytes : rare but promising. Am J Pathol. 2002; 161(2):349-350.
[24] Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J Clin Invest. 2002; 109(10):1291-1302.
[25] Okumoto K, Saito T, Haga H, et al. Characteristics of rat bone marrow cells differentiated into a liver cell lineage and dynamics of the transplanted cells in the injured liver. J Gastroenterol. 2006;41(1):62-69.
[26] Theise ND, Badve S, Saxena R, et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology. 2000; 31(1):235-240.
[27] Cantz T, Sharma AD, Jochheim-Richter A, et al. Reevaluation of bone marrow-derived cells as a source for hepatocyte regeneration. Cell Transplant. 2004;13(6):659-666.
[28] Yannaki E, Athanasiou E, Xagorari A, et al. G-CSF-primed hematopoietic stem cells or G-CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury, predominantly by promoting endogenous repair programs. Exp Hematol. 2005;33(1):108-119.
[29] Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, et al. Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells. Gastroenterology. 2008;134(7):2111-2121.
[30] Mohamadnejad M, Namiri M, Bagheri M, et al. Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis. World J Gastroenterol. 2007; 13(24):3359-3363.
[31] Yao P, Zhan Y, Xu W, et al. Hepatocyte growth factor-induced proliferation of hepatic stem-like cells depends on activation of NF-kappaB. J Hepatol. 2004; 40(3):391-398.
[32] Kushida T, Inaba M, Hisha H, et al. Crucial role of donor-derived stromal cells in successful treatment for intractable autoimmune diseases in mrl/lpr mice by bmt via portal vein. Stem Cells. 2001;19(3):226-235.
[33] 张强,李京雨,徐力扬,等.经肝动脉骨髓干细胞移植治疗肝硬化的初步临床应用[J].中国介入影像与治疗学,2005, 2(4):261-263.
[34] 曹葆强,林继宗,钟跃思,等.自体骨髓细胞经门静脉移植治疗肝硬化与肝功能不全的临床研究[J].中华普通外科杂志, 2007,22(5):386-389.
[35] 潘兴南,沈建坤,庄岳鹏,等.自体骨髓干细胞移植治疗终末期肝病临床研究[J].南方医科大学学报,2008,28(7): 1207-1209.
[36] Terai S, Ishikawa T, Omori K, et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy. Stem Cells. 2006; 24(10):2292-2298.
[37] Gordon MY, Levicar N, Pai M, et al. Characterization and clinical application of human CD34+ stem/ progenitor cell populations mobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor. Stem Cells. 2006; 24(7):1822-1830.
[38] Kharaziha P, Hellström PM, Noorinayer B, et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21(10):1199-1205.

引言

肝硬化是由一种或多种原因引起的肝脏损害，肝脏呈进行性、弥漫性、纤维性病变，具体表现为肝细胞弥漫性变性坏死，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生。肝硬化在临床上的大部分表现与传统医学“黄疸”、“瘤积”、“鼓胀”等记载相似^[1]。引发肝硬化的病因很多，最常见的是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒感染，致肝脏病变，假小叶形成等。各种病因所致慢性炎症或肝损伤后的组织修复过程中以胶原为主要成分的细胞外基质合成增多、降解相对不足，从而导致其过量沉积。细胞外基质的过量沉积、窦内皮细胞筛孔消失、毛细血管化，使肝脏细胞功能逐渐出现障碍，直到假小叶出现及再生结节形成^[2]。对于肝硬化可以采用疏通化纤，消除肝脏炎症，清除肝脏瘀滞，恢复肝脏功能，控制病情，防止并发症的治疗方法^[3]。肝硬化患者病程长、并发症多，病情呈进行性进展，且预后差，因此，肝硬化患者死亡率较高。

近年来，细胞移植成为治疗肝硬化的热点。此方法具有操作简单、可重复进行、免疫原性弱等优点^[4-7]。研究显示，骨髓干细胞是肝细胞的重要肝外来源^[8-9]。骨髓干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。骨髓干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。骨髓间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下能分化为肝细胞，可作为理想的种子细胞用于治疗肝脏疾病。

实验通过皮下注射四氯化碳橄榄油溶液的方法制备大白兔肝硬化模型^[10]，然后经肝动脉途径移植自体骨髓干细胞，探讨自体骨髓干细胞对肝硬化的治疗效果。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年5月至2014年8月在河北医科大学第一医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性新西兰大白兔30只，6个月龄，体质量(2.0±0.3) kg，购自河北省动物实验中心，实验前检测其体内血清谷丙转氨酶、白蛋白及球蛋白均正常。

1.3.2 试剂及仪器 精致食用橄榄油(上海化学试剂厂，分析纯)；D-Hank’s溶液、四氯化碳溶液(文睿化学试剂公司)；CM-DiI荧光染料(Invitrogen公司)；体积分数为10%甲醛溶液、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(Aladdin公司)；CD90-FITC抗体(Corning公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；CO₂培养箱、细胞培养瓶(Corning公司)；流式细胞分析仪(Becton Dickinson )；XAT-6Q型倒置电子显微镜(日本尼康公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔骨髓干细胞的体外分离培养 以10%水合氯醛按照4 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉。无菌条件下，以预先已经抽取了5 mL肝素溶液(100 U/mL)的20 mL注射器于股骨远端穿刺抽取骨髓。采用密度梯度离心法分离骨髓干细胞。加入Percoll液(相对密度为1.085)， 2 000 r/min离心20 min，取中间乳白色层，用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，接种于 25 cm²培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，4 d后更换培养液，培养7 d时第2次换液，加入Ad-GFP进行细胞标记，在倒置相差显微镜下观察细胞形态(图1)。

1.4.2 体外培养骨髓干细胞的收集 ①在无菌超净台内，用酒精灯消毒培养瓶口，轻轻振摇后，倒出含有不贴壁细胞的培养液；②加入无菌PBS约5 mL，轻轻振摇后倒出，重复3次，以除去残留的胎牛血清；③加入含0.02%EDTA的0.25%胰酶约2 mL，轻轻振摇，将其均匀铺满培养瓶底部；④置于相差显微镜10×下观察，见约半数细胞变圆后，即加入数滴含有胎牛血清的无菌培养基，轻轻振摇，以中止消化；⑤轻轻吹打，以促进贴壁细胞的悬浮，细胞计数；⑥将细胞悬液移入15 mL离心管中，配比平衡后，在20 ℃下进行离心，1 000 r/min离心5 min；⑦弃去上清液，以无菌PBS进行细胞重悬，使其细胞浓度为4×10¹⁰ L^-¹；⑧以100 μL的微量加样器取60 μL细胞悬液，即2.4×10⁶个细胞，即刻进行自体移植。

1.4.3 肝硬化模型制备及细胞移植 将30只大白兔完全随机分成3组，即正常对照组，干细胞移植组，模型对照组，每组10只。正常对照组大白兔实验前进行耳静脉采血，检验血清谷丙转氨酶、总胆红素、谷草转氨酶等指标。随后处死，取部分肝脏组织制成切片，作为正常对照。干细胞移植组、模型对照组大白兔每隔2 d皮下注射40%四氯化碳橄榄油溶液0.20 mg/kg，持续注射10周，直到造模结束，检查确认符合肝硬化的诊断标准(球蛋白增高，白蛋白降低，假小叶形成)。模型对照组不做其他处理。干细胞移植组大白兔造模完成后立即将自体骨髓干细胞悬液60 μL(2.4×10⁶个细胞)经肝动脉移植入大白兔肝脏内。

1.4.4 肝功能检测 在骨髓干细胞移植前和移植后第1，2，4，8，10周分别抽取各组大白兔的耳缘静脉血进行肝功能检测，包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、白蛋白、活化部分凝血激酶时间等项指标，对照组同步抽血化验作为对照。

在造模成功后将模型组动物处死，取其肝脏制成标本。细胞移植后第10周将干细胞移植组动物处死，取其肝脏制成标本。观察两组肝脏的大体形态，然后取一部分肝脏组织作成标本，常规石蜡包埋、切片和苏木精-伊红染色。

1.5 主要观察指标 ①肝功能检测结果；②肝脏大体形态及苏木精-伊红染色结果。

1.6 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料用x(_)±s表示，各组间均数比较进行t 检验，P ≤0.05为差异有显著性意义。

讨论

近些年来，随着细胞工程技术研究的日益深入，利用细胞移植治疗肝硬化成为一个新的研究热点。目前的实验研究显示治疗肝硬化疾病的细胞移植方法主要有3种：肝细胞移植、肝干细胞移植和骨髓干细胞移植。前两种方法存在细胞来源缺乏、细胞移植后在生物机体内存活率低等问题^[11-14]。骨髓干细胞来源方便，不受供者缺乏的限制，同时还可避免免疫排斥反应的发生^[15]。自体细胞移植步骤：首先用专用的细胞分离器采集、分离患病机体的外周血或骨髓血细胞，然后在无菌细胞实验室进行纯化、分离、鉴定和培养，最后通过静脉滴注或介入的方法，将生物细胞经肝动脉或门静脉输入到肝脏内，当生物细胞被移植到肝脏组织后，能继续分化为肝脏细胞，以替代因炎症损伤、病毒损伤而退变、坏死的肝细胞，恢复肝脏功能，达到治疗的目的。目前许多研究结果表明骨髓干细胞具有向一些成体细胞(例如肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞及心肌细胞等)分化的潜能^[16-17]。Petersen等^[18]制备肝硬化大鼠模型，造模成功后移植的骨髓干细胞能够在肝脏内生成肝干细胞。日本学者Oh等^[19]发现，体外培养的骨髓干细胞在特定的生长因子诱导作用下，可检测到类肝细胞及肝细胞特异性标记物的表达。Zhou等^[20]通过研究发现，KM小鼠骨髓干细胞诱导分化为肝细胞样细胞的最佳时间是第2，3周。Theise等^[21]发现，受试肝硬化患者体内4%-43%的肝细胞是由其骨髓干细胞横向分化而来，而这种细胞转化数量的多少，随着肝脏受到损伤程度和时间的增加而增加。Avital等^[22]实验将骨髓干细胞从大鼠骨髓中分离出来，并将其通过门静脉移植到同系大鼠体内，发现它们在受体内有很高的存活率并且能够定向分化为成熟的肝细胞。Mitchell等^[23]认为，正常情况下骨髓干细胞不会转化为其他细胞，只有在机体肝功能遭到持续性损害的前提下，其才能转化为肝细胞，进而促进机体肝脏功能修复。

体外研究与动物研究发现，骨髓干细胞移植到受体后，具有较高的存活率，并且可以在细胞因子诱导下分化成为成熟的肝细胞，参与肝结构和功能的修复^[24-28]。骨髓干细胞具有极强的向肝系细胞分化能力^[29-30]，这也是目前细胞生物学的研究热点^[31-32]。中国在2005年就已经有针对细胞移植法治疗肝硬化的报道出现^[33]，近期的实验疗效非常令人满意^[34-35]。Terai等^[36]将骨髓干细胞移植入患者体内，在随后的随访中发现患者白蛋白含量明显升高，且无明显的不良反应。Gordon等^[37]将骨髓干细胞分别经肝动脉和门静脉移植到患者体内，其中经肝动脉途径移植治疗的患者血胆红素下降，经门静脉移植治疗的患者血白蛋白明显升高。Kharaziha等^[38]将骨髓干细胞移植入患者体内，半年后患者肝功能明显改善，血清白蛋白含量增加，胆红素降低，且患者没有出现不良反应。

细胞移植法治疗肝硬化具有多种途径，如脾动脉、外周静脉、肝动脉、脾脏注射、门静脉、腹腔内注射等途径。实验经肝动脉途径移植自体骨髓干细胞治疗肝硬化，结果表明，大白兔的肝脏功能有所改善，与模型对照组比较，差异有显著性意义；干细胞移植组大白兔的肝脏纤维化程度有所缓解，但肝硬化的特征结构(假小叶)仍然存在，可能与干细胞移植的细胞数量及治疗后实验观察时间较短有关系。

综上所述，自体骨髓干细胞经肝动脉移植对机体肝硬化有一定的治疗作用，但其安全性、可行性、作用机制等还需要进一步的基础实验研究提供更多可靠的数据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程