脂肪间充质干细胞移植后肝硬化大鼠血生化指标的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪间充质干细胞移植：人或者动物的脂肪组织经培养后可能得到具有复制和分化潜能的脂肪源性间充质干细胞，脂肪间充质干细胞具有和骨髓间充质干细胞相似的特性，具有相似的标记抗原、基因转导能力、多向分化能力等。与骨髓间充质干细胞相比，具有取材方便、细胞获得率高、增殖不需要特定血清或基质补充等优点，因此具有比骨髓间充质干细胞更为广泛的应用前景。
肝纤维化：是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现肝为内细胞外间质成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经之阶段。肝纤维化形成过程已趋明朗，其形成过程与血清生化有关，大致可分为慢性肝损害，细胞因子网络失调和细胞外间质代谢异常3个环节。任何原因如肝炎病毒、血吸虫病、酒精、药物及毒物等长期持续损害肝脏，都将导致肝纤维化形成，所以肝纤维化的病因是多样的、复杂的。

摘要
背景：干细胞移植是晚期肝病比较有前景的治疗方法，脂肪间充质干细胞是继骨髓间充质干细胞后的又一研究热点。
目的：观察脂肪间充质干细胞移植后对肝硬化大鼠血生化指标的影响作用。
方法：将60只大鼠随机分为正常对照组、模型组及脂肪间充质干细胞组，各20只。模型组及脂肪间充质干细胞组采用四氯化碳灌胃诱导建立肝硬化大鼠模型。建模成功后1周，脂肪间充质干细胞组腹腔注射脂肪间充质干细胞悬液，正常对照组及模型组注射生理盐水。
结果与结论：与对照组相比，模型组大鼠肝组织中丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、总蛋白含量及血清丙二醛含量显著升高，血清白蛋白、血清蛋白含量与球蛋白比值及肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶及环磷酸鸟苷含量明显下降，且吲哚氰绿 15 min滞留率及肝纤维化程度明显上升，而与模型组相比，脂肪间充质干细胞组相比丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、总蛋白含量及血清丙二醛含量显著下降，血清白蛋白、血清蛋白含量与球蛋白比值肝组织中明显升高，且吲哚氰绿 15 min滞留率及肝纤维化程度明显减轻，同时脂肪间充质干细胞组大鼠肝脏组织中可见CM-Dil标记的阳性脂肪间充质干细胞。提示脂肪间充质干细胞能够影响大鼠肝硬化的血生化指标水平，脂肪间充质干细胞移植后可以减轻大鼠肝硬化程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0801-0866(韩海燕)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪间充质干细胞, 肝硬化, 肝纤维化, 肝功能

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation is a promising treatment of advanced liver disease, and adipose-derived mesenchymal stem cells have become another kind of popular cells following bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the influence of adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation on blood biochemical indices of liver cirrhosis rats.
METHODS: Sixty rats were equally randomized into normal control, model and cell transplantation groups. Model rats of liver cirrhosis were made in the latter two groups through intragastric administration of carbon tetrachloride. One week after successful modeling, rats were given intraperitoneal injection of adipose-derived mesenchymal stem cell suspension in the cell transplantation group, and given normal saline in the other two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, the model group showed a significant increase in the levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, total bilirubin, total protein in liver tissues, serum level of malondialdehyde, 15-minute indocyanine green retention rate and degree of hepatic fibrosis, and a significant decrease in serum albumin level, serum albumin/globulin, levels of glutathione peroxidase and cyclic guanosine monophosphate in liver tissues. On the contrary, these indicators were all improved in the cell transplantation group compared with the model group. Moreover, CM-Dil-positive cells were visible in the liver tissue of rats undergoing adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation. All these findings indicate that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation can reduce liver cirrhosis in rats by acting on blood biochemistry levels.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Cirrhosis, Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

韩海燕，宋文广. 脂肪间充质干细胞移植后肝硬化大鼠血生化指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5364-5370.

Han Hai-yan, Song Wen-guang. Variation of blood biochemical indices in liver cirrhosis rats after adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5364-5370.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞的形态 脂肪间充质干细胞复苏后体外培养48 h，可见长梭形、纺锤状或不规则形态的脂肪间充质干细胞，传代培养后的脂肪间充质干细胞生长模式与原代培养的脂肪间充质干细胞相似，但细胞增殖速度要比原代显著加快。传代2 h后即可贴壁，3 d后成纤维样细胞明显增多，胞质丰富，胞核清晰。7 d后脂肪间充质干细胞单层融合可达90%，细胞呈平行排列生长或漩涡状克隆样生长。第3代脂肪间充质干细胞生长旺盛，形态渐趋一致、愈趋向长梭形，以一点为中心向两头呈放射状。细胞呈复层生长，胞膜完整、细胞状态良好，细胞间联系紧密(图1)。

2.2 实验动物数量分析 体内实验所用大鼠60只，全部进入结果分析。

2.3 血清生化检测结果与对照组相比，模型组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、总蛋白含量均显著升高(P < 0.05)，血清白蛋白、血清蛋白与球蛋白比值含量明显下降(P < 0.05)，而与模型组相比，脂肪间充质干细胞组上述指标明显恢复(P < 0.05；表1，图2)。

2.4 肝组织丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶及环磷酸鸟苷水平 与对照组比较，模型组中丙二醛含量显著升高，而与模型组比较，脂肪间充质干细胞组大鼠肝组织中丙二醛含量均显著下降(P < 0.05)，与对照组比较，模型组大鼠肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶及环磷酸鸟苷含量明显下降，而与模型组比较，脂肪间充质干细胞组大鼠肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶及环磷酸鸟苷含量明显升高(P < 0.05；表2，图3)。

2.5 大鼠ICGR₁₅及肝纤维化程度 与对照组比较，模型组ICGR₁₅及肝纤维化程度明显上升，而与模型组比较，脂肪间充质干细胞组ICGR₁₅及肝纤维化程度明显减轻(P < 0.05；表3)。

2.6 脂肪间充质干细胞移植效果 移植后4周，苏木精-伊红染色，正常对照组未见明显肝组织纤维化，肝纤维化程度为0级，模型组可见明显的肝组织纤维化组织，肝纤维化程度为4级，脂肪间充质干细胞组可见少量肝组织纤维化，肝纤维化程度为1级(图4)。脂肪间充质干细胞组可见CM-Dil标记的阳性脂肪间充质干细胞，阳性率可达90%，正常对照组及模型组未见CM-Dil标记阳性细胞(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2015年8月在天津医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级雌性Wistar大鼠80只，体质量120-250 g，鼠龄4.0-5.0周，由天津医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号为SYXK(津)2013- 0001。

脂肪间充质干细胞由天津医科大学内分泌研究所提供，脂肪间充质干细胞来自48岁女性吸脂患者的臀上方深层脂肪组织，经过离心、分离、培养后得到^[16]，实验获得患者的知情同意。

1.4 方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的体外培养 复苏冻存的脂肪间充质干细胞，加入完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清、100×双抗的HG-DMEM培养基)，在培养皿中接种少量悬浮液后置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度条件下培养进行培养，当培养时间达72 h时，用胶头滴管将培养基取出，置入新的培养基，弃上清同时将未贴壁的细胞一同弃去，之后每隔1 d以同样的方法更换一次培养基，同时察看细胞的贴壁情况，当贴壁细胞达80%以上时，用1∶1混合的胰蛋白酶与EDTA消化传代，将获得的脂肪间充质干细胞体外持续传代培养。消化收集生长状态良好的第3，25代脂肪间充质干细胞置于倒置显微镜下观察细胞的生长形态。

1.4.2 动物分组及肝硬化模型的建立 将Wistar大鼠共60只随机分成3组：正常对照组、模型组及脂肪间充质干细胞组，各20只。

将CCl₄溶于橄榄油，配成浓度为10%的溶液，分别于每周一、三、五灌胃模型组及脂肪间充质干细胞组大鼠，每次灌胃剂量为3.0 mL/kg，连续10周，采用相同的方法为正常对照组大鼠进行橄榄油灌胃。成模标准：①门静脉穿刺测压大于对照组的门脉压力区间；②以肉眼观察到肝硬化结节形成及肝脏组织切片要求能够看到假小叶的形成。

1.4.3 脂肪间充质干细胞移植 建模成功后1周，脂肪间充质干细胞组腹腔注射1 mL脂肪间充质干细胞悬液，约含5×10⁶个脂肪间充质干细胞；正常对照组及模型组各注射1 mL的生理盐水。

1.4.4 血液生化指标的检测 脂肪间充质干细胞移植后4周，用2.5%氯胺酮20 mg/kg于大鼠腹腔注射麻醉，打开腹腔，穿刺下腔静脉，抽取2 mL血液，全自动生化分析仪检测各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、血清白蛋白、总蛋白的含量以及血清蛋白与球蛋白的比值。

1.4.5 丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶及环磷酸鸟苷的检测脂肪间充质干细胞移植后4周，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，打开腹腔，取大鼠肝脏组织，研磨，洗涤，沉淀，去渣后，按试剂盒说明检测丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶及环磷酸鸟苷含量。

1.4.6 测定吲哚氰绿 15 min滞留率(ICGR₁₅)：配制0.1 g/L吲哚氰绿，于脂肪间充质干细胞移植后4周，按照1 mg/kg比例经大鼠尾静脉注射，15 min后，抽取心腔血液4 mL，注入含肝素试管中，3 000 r/min离心10 min，取1 mL血浆，加2 mL生理盐水稀释，紫外分光光度计检测805 nm处吸光度，根据标准曲线计算出吲哚氰绿的浓度。ICGR₁₅=吲哚氰绿浓度/1.0×100%。

1.4.7 肝纤维化程度的检测 脂肪间充质干细胞移植后4周，用2.5%氯胺酮20 mg/kg于大鼠腹腔注射麻醉，将大鼠处死，取肝脏组织，体积分数10%的甲醛固定，石蜡包埋，切片(厚10 μm)、苏木精-伊红染色及Masson’s染色，全自动图像分析系统检测肝纤维化程度。肝纤维化程度分级标准如下：0级：无纤维化；1级：汇管区纤维化扩大、局限窦周及小叶内纤维化；2级：汇管区周围纤维化、纤维间隔形成、小叶结构保留；3级：纤维结构使小叶结构紊乱、无肝硬化；4级：早期肝硬化；纤维组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有3级同样改变。

另取切片用苏木精-伊红染色、中性树胶封固，光镜及荧光显微镜下观察病理组织学改变及CM-Dil标记的脂肪间充质干细胞存活及分部。

1.5 主要观察指标 ①血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、血清白蛋白、总蛋白含量及血清蛋白与球蛋白比值；②丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、环磷酸鸟苷含量；③肝脏病理变化。

1.6 统计学分析 数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着干细胞的相关研究越来越多，使得干细胞移植的研究以及延伸到包括肝衰竭在内的各个领域。大量研究显示干细胞可以在特定条件下分化成为各种组织器官，为多种疾病治疗提供了新的思路，并且已经取得了令人瞩目的成果^[17-18]。尽管干细胞移植治疗肝衰竭的机制尚未完全阐明，目前已有大量研究显示干细胞移植在治疗慢性肝病时是由于其可以在特定的条件下分化为肝脏干细胞^[19-21]，对损伤的肝组织进行修复、重构以及对肝功能进行不同程度的改善^[22-24]。脂肪间充质干细胞作为干细胞的另一个来源因其取材方便，来源广泛受到广泛关注，研究证实脂肪间充质干细胞在体外可以稳定增殖传代，同样具有干细胞的特性，即具有高度分化的潜能^[25-27]。作者对肝硬化模型大鼠腹腔注射脂肪间充质干细胞，结果显示，4周后大鼠肝脏组织可见CM-Dil标记的脂肪间充质干细胞，表明了移植的脂肪间充质干细胞在肝脏组织中存活，且大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、总蛋白含量均显著下降，而血清白蛋白、血清蛋白与球蛋白比值含量明显升高，同时丙二醛含量下降，而谷胱甘肽过氧化物酶和环磷酸鸟苷含量上升，表明脂肪间充质干细胞移植使大鼠肝硬化程度减轻。

目前研究发现脂肪间充质干细胞治疗肝硬化的机制可能包括：①直接分化：在肝脏损伤微环境的影响下定植、增殖，并分化成为肝细胞发挥作用^[28-30]。②旁分泌途径：在肝损伤环境中脂肪间充质干细胞可以分泌不同水平的细胞因子相互影响，表现出抗炎症反应的作用，并可能激活肝内的肝干细胞，促进肝细胞再生。③细胞融合：脂肪间充质干细胞可能直接与肝细胞融合，进而启动细胞的增殖过程。④抑制产生细胞外基质的肝星状细胞的活化，并促进肝星状细胞的凋亡^[31-33]。⑤脂肪间充质干细胞通过高表达基质金属蛋白酶降解细胞外基质，直接降解肝内过量沉积的细胞外基质，减轻肝纤维化^[34]。⑥激活肝内残存肝细胞、Kuppffer细胞，在一定程度上启动内源性肝细胞增殖过程和Kuppffer细胞分泌基质金属蛋白酶降解细胞外基质等^[35]。⑦脂肪间充质干细胞不仅能分化为肝细胞，而且在体内具有免疫调节的功能，减轻肝脏炎症反应和损伤。

综上所述，脂肪间充质干细胞不仅能够影响肝硬化大鼠的血生化指标水平，而且还能够减轻肝硬化的程度。尽管目前对于干细胞移植的研究多数处于动物实验阶段^[36-37]，具体由动物实验走向临床运用治疗各种疾病尚需不断地努力探索，需要大量的相关性实验研究推动，但是干细胞强大的治疗潜力一定会为终末期肝病患者带来新的希望。