miR-126调节骨髓间充质干细胞对游离皮瓣组织学活性的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
游离皮瓣：根据血供解剖上的不同，游离皮瓣可分为4种。①直接皮肤血管皮瓣：其主要特点是营养皮肤的动脉在穿出深筋膜后与皮肤表面平行，走行与皮下组织内，并沿途发出小支以供养皮下组织及皮肤。这种皮瓣即典型的轴形皮瓣，腹股沟皮瓣、胸三角皮瓣均属之；②肌皮血管皮瓣：也称肌皮瓣，特点是通过肌组织发出营养支，垂直穿透深筋膜至皮下组织及皮肤，皮瓣在移植时决不能将皮瓣与其深面肌分离，否则不能成活。这种皮瓣实际上是一种复合组织瓣，胸大肌皮瓣，背阔肌皮瓣等均为此种类型；③动脉干网状血管皮瓣：特点是由动脉干上直接发出许多微细的血管支，组成丰富的网状结构，直接营养其所属的皮肤。这种皮瓣的动脉多为体表浅的动脉主干，口径较粗，易于吻合成功；而且主干的两端均较粗，皆可供吻合，在此基础上，可成为桥梁皮瓣与其他皮瓣连接成的二级串联皮瓣。足背皮瓣以及前臂皮瓣均属此种类型；④肌间隔血管皮瓣：其特点是动脉行走于肌间隔内，然后发出分支至皮肤，并与其他皮肤动脉吻合，皮瓣常可分离出较长一段血管蒂，切多有2条静脉伴行。上臂内、外侧皮瓣及小腿内侧皮瓣均属这种类型。
血管生成：是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。

摘要
背景：miRNA具有组织特异性及细胞特异性，其中内皮细胞特异性高表达miRNA-126(miR-126)在血管新生中具有举足轻重的作用。
目的：研究miR-126调节游离皮瓣移植后皮瓣成活以及组织学活性的影响，探讨其在血管新生中的作用机制。
方法：①利用瞬时转染技术提高骨髓间充质干细胞中miR-126的表达，利用Real-Time PCR检测巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1 mRNA表达及Western blot检测ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白表达；②将48只SD大鼠随机分为3组，每组16只，均制备腹部游离皮瓣模型。A-C组分别在游离皮瓣远端1 cm和3 cm处注射miR-126 mimics转染的骨髓间充质干细胞、miR-126 mimics control转染的骨髓间充质干细胞及PBS。
结果与结论：①转染miR-126 mimics后的骨髓间充质干细胞较对照组骨髓间充质干细胞中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1 mRNA表达量分别下降36倍、3.5倍和14倍；②A组大鼠皮瓣远端组织中 ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT 的蛋白表达水平比B和C组明显增高，且pAKT/AKT及pERK1/2/ERK1/2比值高于B和C组，且皮瓣组织液中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1蛋白水平明显低于B和C组；③结果提示miR-126可以促进游离皮瓣组织中血管新生腺管蛋白的活化，进而促进皮瓣的成活。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9622-2219(陈勇)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 游离皮瓣, miR-126, 骨髓间充质干细胞, 瞬时转染, 巨噬细胞炎性蛋白1α, 肿瘤坏死因子α, 血管细胞黏附分子1, 血管生成

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNA has tissue and cell specificity, and high expression of endothelial cell-specific microRNA-126 (miR-126) plays an important role in angiogenesis.
OBJECTIVE: To explore the effect of miR-126 on transplanted free flap survival and histological activity as well as its mechanism in angiogenesis.
METHODS: Transient transfection technology was used to enhance the expression of miR-126 in bone marrow mesenchymal stem cells. Expression levels of macrophage inflammatory protein-1α, tumor necrosis factor-α and vascular cell adhesion molecule-1 mRNA were detected by real-time PCR, and expression levels of ERK1/2, AKT, pERK1/2, pAKT protein were measured by western blot assay. Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups (n=16 per group), followed by preparation of abdominal free flap models. Rats in the three groups were given injection of miR-126 mimics-transfected cells, miR-126 mimics control-transfected cells and PBS 1 cm and 3 cm distal to the free flap, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Expression levels of macrophage inflammatory protein-1α, tumor necrosis factor-α and vascular cell adhesion molecule-1 mRNA in the cells transfected with miR-126 mimics were decreased by 36, 3.5 and 14 times compared with those in the PBS group, respectively. Expressions levels of ERK1/2, AKT, pERK1/2, pAKT protein in the distal free flap increased significantly in the miR-126 mimics group than the other two groups, as did the ratios of pAKT/AKT and pERK1/2/ERK1/2. In addition, the expression levels of macrophage inflammatory protein-1α, tumor necrosis factor-α and vascular cell adhesion molecule-1 protein in the flap tissue fluid were significantly lower in the miR-126 mimics transfection group than the other two group. All these findings suggest that miR-126 can promote free flap survival by creating favorable conditions for angiogenesis in the free flap tissue.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Surgical Flaps, Transfection, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈勇，范龙坤. miR-126调节骨髓间充质干细胞对游离皮瓣组织学活性的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5332-5337.

Chen Yong, Fan Long-kun. MicroRNA-126 effects on free flap activity by regulating bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5332-5337.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验及随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2012年6月至2013年5月在河北医科大学口腔医院完成。

1.3 材料 ①雄性SD大鼠，鼠龄10 d；②成年SD大鼠48只，鼠龄85-110 d，体质量200-280 g，雌雄不限。2种大鼠均由河北医科大学动物实验中心提供，实验方案经河北医科大学动物实验伦理委员会批准，符合动物伦理学的要求。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和传代 无菌条件下分离10 d龄SD大鼠双下肢股骨，PBS冲洗，切除双侧干髓端。注射器吸取含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基5 mL，吹打均匀，用DMEM完全培养液重悬细胞。调整细胞以1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于培养瓶中，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱，每3 d全量换液1次。待贴壁细胞达到80%-90%融合后，弃培养液，PBS清洗3次，胰酶消化液室温下消化，以1∶3比例传代，流式细胞仪行骨髓间充质干细胞鉴定。

1.4.2 瞬时转染 常规胰蛋白酶消化第3代骨髓间充质干细胞，用无双抗含体积分数10%胎牛血清的α-MEM重悬，计数，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱备用。

用OPTI-MEM^®Ⅰ稀释miRNA-126 mimics和mimics control，调整终浓度为100 nmol/L，室温下静止10 min，加入骨髓间充质干细胞培养基中，8-24 h后更换培养液，转染完成24-72 h后进行实时PCR检测。平均每5 d转染1次。当细胞80%融合时更换诱导液。

1.4.3 实时PCR检测 提取经转染完成后细胞的总RNA，取0.05 μg总RNA在SuperscriptⅡ反转录酶作用下反转录形成第一链cDNA，以实时定量miRNAs特异引物和第一链cDNA为模板进行 PCR反应，GAPDH和U6为内参照。参照GenBank数据库，采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物，由Takara公司合成。反应条件参考产品说明书。分别进行巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1 mRNA检测。

1.4.4 Western blot检测 加入全蛋白裂解液提取经转染完成后细胞的总蛋白，严格按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)操作方法检测制备的蛋白品浓度，绘制标准曲线，根据标准曲线计数样品蛋白含量。采用SDS凝胶试剂盒配制12%的分离胶和3%的浓缩胶，灌胶与上样→跑电泳→转膜→封闭→一抗孵育：用一抗稀释1 000倍配制的一抗ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT以及稀释2 000倍配制GAPDH抗体，试管固定于滚筒架上 4 ℃过夜；二抗孵育：洗膜，用5%奶粉配制山羊抗兔二抗(1∶2 000，用于 ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT 检测)，山羊抗小鼠二抗(1∶2 000，用于GAPDH检测)，室温孵育1 h，用TBST洗膜6次，每次4 min；在化学发光仪中发光，使用Quantity One分析结果。

1.4.5 实验动物分组 48只成年SD大鼠随机分为A，B，C 3组，每组16只。

1.4.6 动物模型的建立 参照Ozkan^[7]方法，在所有大鼠右下腹部设计一块大小为4.0 cm×3.0 cm游离皮瓣(皮瓣的蒂部靠近腹股沟)，此皮瓣的血供主要由股动、静脉分支的腹壁浅动、静脉供应。消毒后沿设计线切至腹外斜肌肌膜浅层，自头端向尾端钝性分离皮瓣,分离出股动、静脉主干及腹壁浅动、静脉，结扎并剪断股动、静脉远端，保留接连皮瓣的腹壁浅动、静脉作为蒂部相连，以保证其为惟一的血供。仔细分离近心端股动、静脉；于股动静脉发出腹壁浅动、静脉处上方1.0 cm左右上微血管夹并切断股动、静脉，两断端先后用肝素、利多卡因、生理盐水冲洗后，在外科显微镜下以8-0缝合线依次吻合股静脉及股动脉，松开微血管夹，确认腹壁浅血管血流恢复、皮瓣颜色逐步红润为血管吻合成功(吻合时间不超过2 h)，最后原位缝合皮瓣。

1.4.7 miR-126转染的骨髓间充质干细胞的移植 A组大鼠游离皮瓣远端1 cm和3 cm处左右两侧，分别注入 1 mL含有1×10⁶ miR-126 mimics转染骨髓间充质干细胞的PBS；B组注射为miR-126 mimics control转染的骨髓间充质干细胞；C组注射等量的PBS。

1.4.8 ELISA分析 治疗后7 d，戊巴妥纳麻醉下颈椎脱臼法处死大鼠，切取皮瓣远端标本约200 mg组织在冰上剪成碎片，用含蛋白酶抑制剂PMSF预冷PBS洗涤2次，离心弃PBS，加入2 mL预冷的蛋白裂解液；置于4 ℃下超声波碎破仪，直到95%的细胞被破碎；4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清转移到新的离心管中，加入loading buffer，煮沸5 min，体积分数20%甘油 -70 ℃保存。按ELISA使用说明书对各组皮瓣组织液中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1进行定量分析。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1 mRNA的表达情况；②骨髓间充质干细胞中ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白表达情况；③皮瓣组织液中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1蛋白水平。

1.6 统计学分析 选用SPSS 15.0统计软件包进行数据处理。数据以x(_)±s表示，分别采用t 检验和重复测量设计资料的方差分析进行组间比较。

讨论

近年来研究发现miR-126是在内皮细胞中特异性高表达的一个小分子miRNA，参与调控血管发育、新生血管形成、血管完整性的维持以及血管炎症反应等，是调节功能性血管新生的重要因素^[4-6]。

骨髓间充质干细胞具有向表皮细胞和成纤维细胞分化的潜能，可能作为种子细胞构建具有生物学功能的组织工程化全层皮肤，并且自体来源的骨髓间充质干细胞构建的皮肤组织无免疫排斥风险，有研究表明骨髓间充质干细胞分泌的基质细胞衍生因子1α能促进小鼠皮肤血管增生和放射伤口的愈合，同时也证明骨髓间充质干细胞能明显加速创面愈合，促进上皮再生和血管生成^[8]。游离皮瓣移植后机体的自我修复作用可因炎性反应及细胞外基质的影响而被削弱，炎症可诱导骨髓间充质干细胞往损伤组织进行迁移及渗透，同样炎症也加速骨髓间充质干细胞与损伤组织的融合。实验证明，人为引进外源性干细胞到受损组织或器官，可明显地改善临床预后，明显加快创伤组织的修复过程^[9]。Maggini等^[10]研究证明，骨髓间充质干细胞一方面抑制巨噬细胞促炎症因子如肿瘤坏死因子α的产生，另一方面促进抗炎症因子生成。通过这样的过程，激活免疫细胞，减少局部炎症反应，降低组织损伤。同时骨髓间充质干细胞也增强了凋亡细胞的吞噬功能，清除创伤部位的损伤^[11]。另外骨髓间充质干细胞可以表达及分泌血管内皮生长因子，其是血管再生的重要促进因素，能明显促进已存在的血管出芽生长，增加了皮瓣的血管密度，从而提高了皮瓣的存活率^[12]。

炎症调节作用是骨髓间充质干细胞促进皮瓣成活的重要机制^[13-18]，应用外源性生长因子减轻皮瓣缺血、促进皮瓣存活已成为临床研究一个重要的策略。在局部注射治疗SD大鼠游离皮瓣模型中发现并证实miR-126在转录后水平靶向抑制肿瘤坏死因子α、血管细胞黏附分子1的翻译，来抑制血管炎症，从而更有利于促进皮瓣新生血管形成。实验还发现游离皮瓣组织局部被动高表达miR-126，可以明显促进pERK1/2及pAKT的活化，说明miR-126是激活了血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等生长因子介导的MAPK和PI3的信号通路。虽然实验找出了miR-126与血管新生及促进游离皮瓣成活的相关因子，但有关机制方面仍存在许多未知，仍需进一步探索。