脂肪源干细胞移植骨质疏松模型大鼠骨密度及骨形态计量学指标的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪干细胞：是指从脂肪组织中获取的具有干细胞特性的细胞群，具备自我增殖能力，可分化成多种功能细胞，也具有低免疫原性和免疫调节功能。近年来出现的“筋膜学假说”表明，未分化非特异性结缔组织(筋膜)支架构成的支持与储备系统中的主要细胞储备成分——脂肪源干细胞可以改善骨质疏松。
骨质疏松症的分级：WHO建议根据骨密度值对骨质疏松症进行分级，规定正常健康成年人的骨密度值加减1个标准差(SD)为正常值，较正常值降低(1-2.5)SD为骨质减少，降低2.5SD以上为骨质疏松症，降低2.5SD以上并伴有脆性骨折为严重的骨质疏松症。

摘要
背景：越来越多的研究者希望通过干细胞移植促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞增殖，从而治疗骨质疏松症。
目的：探讨外源性脂肪干细胞移植对卵巢切除骨质疏松大鼠的治疗作用。
方法：选取30只SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、脂肪干细胞移植组，每组10只。模型组和脂肪干细胞移植组进行双侧卵巢切除手术，建立骨质疏松模型，假手术组仅摘除卵巢附近的脂肪组织，但不摘除卵巢。脂肪干细胞移植组经尾静脉注射第4代脂肪干细胞(2×10⁶个脂肪干细胞)，模型组注射等量生理盐水，每周1次。细胞移植6周后，检测血清钙、磷、碱性磷酸酶水平及骨密度、骨形态计量学指标。
结果与结论：①与假手术组相比，模型组大鼠胫骨骨小梁体积百分比明显降低(P < 0.01)，与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠胫骨骨小梁体积百分比显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与假手术组相比，模型组大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与假手术组相比，模型组血清钙、碱性磷酸酶水平和骨密度显著降低(P < 0.05)，而血清磷水平显著升高(P< 0.05)；与模型组相比，脂肪干细胞移植组血清钙、碱性磷酸酶水平和骨密度显著升高(P < 0.05)，而血清磷水平显著降低(P < 0.05)；④结果表明，脂肪干细胞移植后能够改善卵巢切除骨质疏松大鼠的骨量流失。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-7151-0556(李广章)

关键词: 干细胞, 移植, 骨质疏松, 脂肪干细胞, 卵巢切除, 动物模型, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation is increasingly hoped to promote osteoblast differentiation and inhibit osteoclast proliferation in the treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effect of exogenous adipose-derived stem cell (ADSC) transplantation on osteoporosis in ovariectomized rats.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley female rats were equivalently randomized into sham, model, ADSC transplantation groups. Rats in all groups except the sham group underwent bilateral ovariectomy to make osteoporosis models. Surrounding adipose tissues instead of the ovary were removed in the sham group. After modeling, rats were given 2×10⁶ ADSCs at passage 4 via the tail vein in the transplantation group and the same volume of normal saline in the model group, once a week. After 6 weeks, levels of serum calcium, phosphorus, and alkaline phosphatase as well as bone mineral density and histomorphometry indicators were detected in rats.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, the trabecular bone volume fraction was significantly decreased in the model group (P < 0.01), but remarkably increased after ADSC transplantation (P < 0.05). After modeling, the bone trabecular absorption surface percentage and rate of bone trabecular formation were elevated significantly (P < 0.05 or P < 0.01), while these increases were improved by ADSC transplantation (P < 0.05). Additionally, the levels of serum calcium and alkaline phosphatase and bone mineral density were significantly decreased after modeling, but were increased after ADSC transplantation. In contrast, the serum level of phosphorus was significantly increased in the model group (P < 0.05) but decreased markedly in the ADSC transplantation group (P < 0.05). To conclude, ADSC transplantation can reduce the loss of bone mass in osteoporosis rats by ovariectomy.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Osteoporosis, Adipose Tissue, Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李广章，蒋召芹，刘志新. 脂肪源干细胞移植骨质疏松模型大鼠骨密度及骨形态计量学指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4825-4830.

Li Guang-zhang, Jiang Zhao-qin, Liu Zhi-xin. Adipose-derived stem cell transplantation for osteoporosis rats: evaluation by bone mineral density and histomorphometry measurement[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4825-4830.

图/表（结果） 3

2.1 脂肪干细胞形态学观察及鉴定 原代培养48 h后，细胞为多角形、梭形的成纤维样细胞；培养15 d左右细胞融合达到90%以上，传代后细胞逐渐纯化，胞浆丰富，核仁明显，呈长梭形(图1)。流式细胞仪检测结果显示：CD29和CD90呈强阳性表达，阳性率达到90%以上。

2.2 实验动物数量分析 参加实验大鼠30只，均进入结果分析，中途无脱落。

2.3 血清生化指标 表1结果显示，各组之间血清钙、磷、碱性磷酸酶水平差异有显著性意义(P < 0.05)。与假手术组相比，模型组血清钙、碱性磷酸酶水平显著降低，而血清磷水平显著升高(P < 0.05或P < 0.01)。与模型组相比，脂肪干细胞移植组血清钙、碱性磷酸酶水平显著升高，而血清磷水平显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 各组大鼠股骨骨密度及胫骨形态计量学指标 与假手术组相比，模型组大鼠股骨骨密度显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠股骨骨密度显著升高，差异有显著性意义 (P < 0.05)。脂肪干细胞移植6周后，与假手术组相比，模型组大鼠胫骨骨小梁体积百分比明显降低(P < 0.01)，与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠胫骨骨小梁体积百分比显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。与假手术组相比，模型组大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

骨质疏松症的主要特征为骨密度减少及骨微结构退化，常导致骨的脆性增加及易于发生骨折，是最为常见的骨代谢疾病之一^[1-2]。根据发病原因不同，骨质疏松症可以分为原发性和继发性两大类^[3]。临床最常见的骨质疏松症为老年性骨质疏松，主要原因是年龄老化伴随成骨细胞和骨钙素等激素失衡，导致骨形成能力降低^[4-5]。骨质疏松患者在确诊之前常无明显症状，往往错过了最佳诊断和治疗时机。因此，探索骨质疏松的发病原因及诊断标准尤为重要。

骨质疏松最重要的靶点为骨代谢，包括成骨作用和破骨作用，两者之间维持一个动态平衡，一旦打破这种平衡，则破骨作用大于成骨作用，就会导致骨质疏松。近年来大量研究表明，雌激素对骨质疏松的形成影响很大^[6-7]，其作用主要包括：①雌激素可影响钙调节激素^[6]；②雌激素可降低骨组织对甲状旁腺素的敏感性，致使骨吸收减少；③雌激素水平降低时，破骨细胞的数量和活性增强，超过成骨细胞，致使骨代谢失去平衡；④雌激素还可以通过调节某些细胞因子来影响骨代谢过程^[8-9]。

目前，干细胞移植在骨质疏松症的治疗中越来越受到重视^[10]。越来越多的研究者希望通过干细胞移植促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞增殖，从而治疗骨质疏松症。脂肪源干细胞移植治疗骨质疏松症有许多其他干细胞不可比拟的优势，如获取方便、数量充足、价格低廉、成活率高、可自体异体移植、无道德伦理学争议^[11-13]。实验从SD大鼠的腹股沟皮下脂肪中成功分离和培养得到脂肪干细胞，将其植入卵巢切除骨质疏松大鼠体内，观察血清钙、磷、碱性磷酸酶水平及骨密度、骨形态计量学指标，探讨脂肪干细胞移植治疗骨质疏松的作用机制。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年5月至2015年7月在秦皇岛市第一医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雌性SD大鼠，SPF级，其中5只(体质量120-180 g，4周龄)用于分离脂肪干细胞，30只(体质量180-220 g，7周龄)用于动物体内实验。所有大鼠均购于河北省医学实验动物中心。

1.3.2 主要试剂 Ⅰ型胶原酶(美国Milliopre公司)；胎牛血清、L-DMEM培养基、链霉素、胰酶(Gibco公司)；二甲基亚砜(Sigma公司)；水合氯醛(江苏永华精细化学品有限公司)；小鼠单克隆抗大鼠CD29，CD45，CD49d，CD90(Biolegend公司，美国)。

1.3.3 主要仪器 MCV-16BSU超净工作台(Sanyo公司，德国)；CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)； Milli-Q labconco 纯水仪(美国Millipore公司)；普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；细胞培养箱(日本三洋MCO-15AC)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；FA1004N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；冻存管、培养瓶、培养板(美国Corning公司)；低温离心机(Sigma，美国)；血球计数板(浙江玉环县求精医用仪器厂)；微量加样器(德国GILSON公司)；Leica EG1140石蜡包埋机、LEICA-RM2025组织切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞的分离培养 4周龄SD雌性大鼠，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，乙醇消毒大鼠腹股沟部位，在无菌条件下，剪去皮下脂肪垫，去除肉眼可见的微小血管，Hank’s缓冲液冲洗3次，眼科剪剪碎，加入2倍体积的0.15% Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡消化40 min，待充分消化后，加入等体积的含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1 000 r/min离心6 min，弃去上清液，沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，200目钢筛过滤，接种于25 cm²培养瓶中，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，传代，收集第4代脂肪干细胞用于表面标志鉴定和移植实验。

1.4.2 脂肪干细胞的表面标志鉴定 收集第4代脂肪干细胞，用1%胰酶-0.02% EDTA消化，1 000 r/min离心 6 min，弃去上清液，PBS重悬，细胞计数后按每管2×10⁶个细胞分装至离心管，1 000 r/min离心6 min，弃去上清液，用100 μL PBS重悬，分别加入FITC标记的小鼠抗大鼠单克隆抗体CD90，PE标记的小鼠抗大鼠单克隆抗体CD29，室温下避光孵育20 min，加入PBS， 1 000 r/min离心6 min，弃去上清液，再次加入PBS重悬，离心，弃上清，上流式细胞仪检测，实验共重复3次。

1.4.3 卵巢切除法建立骨质疏松大鼠模型^[14] 选取30只SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、脂肪干细胞移植组，每组10只。模型组和脂肪干细胞移植组进行双侧卵巢切除手术，建立骨质疏松动物模型。将大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下，腋中线和距脊柱外侧约1 cm交叉处，剪除长毛，用体积分数为75%乙醇及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和肌膜，以眼科镊将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到黄红色的卵巢。将卵巢下端输卵管用丝线结扎，摘除卵巢，将子宫角送回腹腔，同法摘除对侧卵巢，切口缝合，消炎。假手术组仅摘除卵巢附近的脂肪组织，但不摘除卵巢。

1.4.4 脂肪干细胞移植 待骨质疏松模型建立后，脂肪干细胞移植组经尾静脉注射第4代脂肪干细胞(2×10⁶个脂肪干细胞)，模型组注射等量生理盐水，每周注射1次，连续注射6周后处死大鼠，对其进行相关指标检测。

1.5 主要观察指标

1.5.1 血清生化指标 连续6周后，采集大鼠尾静脉外周血，利用ELISA试剂盒检测血清钙、磷、碱性磷酸酶水平。

1.5.2 骨密度 采血完毕后，麻醉大鼠处死，取股骨，利用X射线骨密度仪测定大鼠股骨密度。

1.5.3 骨组织形态计量学指标^[15] 取大鼠右侧胫骨，去除黏附上面的结缔组织，用甲基丙烯酸甲酯进行包埋，制作大鼠胫骨切片，进行Masson-Goldner Trichrone染色，采用全自动图像数字化学分析仪检测骨组织形态计量学指标^[43]：①骨小梁体积百分比(TBV%)：指骨小梁体积占骨髓腔总体积的百分比，是衡量骨量水平的主要标志；②骨小梁吸收表面百分比(TRS%)：指不规则骨小梁表面占全部骨小梁表面的百分比，可判断破骨细胞的活性；③骨小梁形成表面百分比(TFS%)：指有成骨细胞被覆盖的骨质表面占全部骨小梁表面的百分比，可判断成骨细胞的活性。

1.6 统计学分析 所有数据用SPSS 20.0软件进行分析，采用单因素方差分析One-Way ANOVA进行检验，多组均数比较满足方差齐性时采用LSD法和SNK法比较，不满足方差齐性时采用Dunnett'sT3法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松已经成为老年人的“隐形流行病”^[16-17]。据统计，50岁以上人群患骨质疏松症已达到6 000多万。预计到2020年，中国骨质疏松患者人数将增加到3亿左右^[18]。伴随骨质疏松患者的增多，中国的医疗服务花费也到达上亿元，给医院以及政府带来了沉重的经济负担^[19]。

现代医学认为骨质疏松是一种骨形成和骨吸收动态平衡的过程，而传统医学文献中记载骨质疏松为“骨枯”、“骨痹”、骨蚀“等^[20-22]。研究表明骨质疏松动物模型有很多种被广泛使用，其中包括大剂量注射糖皮质激素法(强的松、地塞米松、醋酸泼尼松龙)、维甲酸致骨质疏松方法^[23-26]。前者造模机制是大量的糖皮质激素注入大鼠体内，可抑制成骨细胞的增殖与分化，使成骨细胞数目减少；后者则是可以激活破骨细胞，对成骨细胞无影响，从而导致骨质疏松^[26]。除此之外，大鼠卵巢切除法建立骨质疏松模型也是目前使用最为普遍且研究最为广泛的实验方法^[27]。女性绝经后雌激素水平迅速下降，易发生骨质疏松，成为目前骨质疏松症的高发人群^[28-30]。

目前脂肪干细胞的研究已取得重大进展^[31-32]。脂肪干细胞是指从脂肪组织中获取的具有干细胞特性的细胞群，具备自我增殖能力，可分化成多种功能细胞，也具有低免疫原性和免疫调节功能^[33]。近年来出现的“筋膜学假说”表明，未分化非特异性结缔组织(筋膜)支架构成的支持与储备系统中的主要细胞储备成分——脂肪源干细胞可以改善骨质疏松^[34-35]。陶晖等^[36]通过建立糖皮质激素性骨质疏松大鼠模型，探索脂肪源干细胞移植对骨质疏松大鼠骨密度及骨生物力学的影响，细胞治疗4周后，治疗组血清钙和碱性磷酸酶、骨密度、最大载荷和刚度均明显升高，而血清磷水平下降。李良等^[37]研究骨髓间充质干细胞对去卵巢骨质疏松大鼠的影响，结果发现去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力明显下降，向成骨细胞分化能力下降，向脂肪细胞分化能力增强，提示可能与绝经后骨质疏松症的发生相关。Coelho等^[38]发现间充质干细胞向成骨细胞分化的必需条件是在培养基中加入β-甘油磷酸钠、地塞米松和抗坏血酸，也是成骨细胞体外成骨的重要条件。骨质疏松症当中骨形成减少的根本核心是成骨细胞数量和功能下降^[39]，因此，通过诱导干细胞向成骨细胞分化，可达到治疗的目的。干细胞分化可受到某些生长因子、激素影响^[40]。

实验结果发现，脂肪源干细胞移植6周后，与假手术组相比，模型组大鼠胫骨骨小梁体积百分比明显降低(P < 0.01)；与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠胫骨骨小梁体积百分比显著增加(P < 0.05)。与假手术组相比，模型组大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组相比，脂肪干细胞移植组大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。与假手术组相比，模型组血清钙、碱性磷酸酶水平和骨密度显著降低，而血清磷水平显著升高。与模型组相比，脂肪干细胞移植组血清钙、碱性磷酸酶水平和骨密度显著升高，而血清磷水平显著降低。结果表明，脂肪干细胞移植后能够改善卵巢切除骨质疏松大鼠的骨量流失，对骨质疏松具有预防作用。

目前对脂肪干细胞定向诱导成骨、成脂、成软骨的研究已取得了很大进展，已经证实脂肪干细胞可达到治疗骨质疏松的目的。随着研究的越来越深入，还存在许多问题需要解决，包括脂肪干细胞的纯化及诱导分化的内在机制探索。去卵巢模型是最常用的模拟妇女绝经后骨质疏松的动物模型，被广泛用于药物防治骨质疏松效果等领域的研究^[41]，这种模型稳定，可引起大鼠骨量的丢失。从实验结果来看，用此模型研究骨质疏松药物最好是选取去卵巢1 个月后的大鼠，此时的大鼠各骨形态计量学参数变化趋于稳定，以便于更好地观察药物的药效。