体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨治疗良性骨肿瘤和瘤样病变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨肿瘤：是发生于骨骼或其附属组织的肿瘤。有良性，恶性之分，良性骨肿瘤易根治，预后良好，恶性骨肿瘤发展迅速，预后不佳，死亡率高。恶性骨肿瘤分为原发性和继发性。从体内其他组织或器官的恶性肿瘤经血液循环、淋巴系统转移至骨骼为继发性恶性骨肿瘤。还有一类病损称瘤样病变，肿瘤样病变的组织不具有肿瘤细胞形态的特点，但其生态和行为都具有肿瘤的破坏性，一般较局限，易根治。
骨髓基质细胞：成体骨髓中的一类多能干细胞。具有分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他几种结缔组织细胞(如腱细胞)的潜能，亦可转分化成心肌细胞、骨骼肌细胞。

摘要
背景：骨髓基质干细胞具有较强的成骨潜能，属于当前组织工程中最为理想的种子细胞。但是，临床上未见将骨髓基质干细胞植入良性骨肿瘤和瘤样病变的研究。
目的：探讨体内灌注诱导骨髓基质干细胞方法，研究骨髓基质干细胞在良性骨肿瘤和瘤样病变患者中的临床治疗效果。
方法：将65例良性骨肿瘤和瘤样病变患者根据治疗措施不同分为单纯植骨组(n=30)和骨髓基质干细胞组(n=35)。单纯植骨组采用生理盐水混合同种异体骨进行30 min浸泡，并植入骨缺损部位。骨髓基质干细胞组根据植骨量从每一位患者身上抽取20-40 mL骨髓，分化、纯化，培养获得骨髓基质干细胞，经过体内灌注方法诱导工程骨，并植入骨缺损部位。
结果与结论：①在倒置相差显微镜下，灌注的骨髓细胞悬液中细胞为圆球形，但是细胞大小不一。细胞灌注最初培养皿造血细胞较多。随着培养时间的延长，可见分布在贴壁梭形细胞及悬浮红细胞，细胞多为圆形、三角形；②两组患者治疗后均进行1-12个月随访，患者术后均为甲级愈合。骨髓基质干细胞组患者感染率、愈合时间显著低于单纯植骨组；③结果提示体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨效果理想，能促进血供的重建，将骨髓基质干细胞构建组织工程骨运用于良性骨肿瘤和瘤样病变中能够促进骨融合和骨缺损愈合，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7424-0785(王顺利)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 体内灌注诱导, 骨髓基质干细胞, 单纯植骨, 骨缺损, 愈合时间, 瘤样病变

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stromal stem cells have a strong osteogenic potential, which are currently the most ideal seed cells for tissue engineering. However, there is no clinical report on the treatment of benign bone tumors and tumor-like lesions using bone marrow stromal stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the in vivo perfusion method of inducing bone marrow stromal stem cells, and the clinical effects of bone marrow stromal stem cells on benign bone tumors and tumor-like lesions.
METHODS: Sixty-five cases of benign bone tumors and tumor-like lesions were divided into three groups according to the different treatments: bone graft group (n=30) and bone marrow stromal stem cells group (n=35). In the bone graft group, allogeneic bone was soaked in normal saline for 30 minutes, and then implanted into the bone defect site. In the bone marrow stromal stem cells group, 20-40 mL of bone marrow from each patient was extracted to isolate, purify and culture bone marrow stromal stem cells that were then perfused into the bone defect site.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the inverted phase contrast microscope, the perfused cells appeared as a spherical shape, with different sizes. Initially, there were more hematopoietic cells in the perfusion cell culture. With the extension of the culture time, adherent spindle cells and suspended red blood cells appeared, which were mostly round and triangular. All the patients were followed up for 1-12 months and healed well after surgery. Compared with the bone graft group, infection rate and healing time were both lower in the bone marrow stromal cell group. To conclude, in vivo perfusion of bone marrow stromal stem cells used for construction of tissue-engineered bone promotes blood supply reconstruction and bone healing in patients with benign bone tumors and tumor-like lesions, which is of high clinical values.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Neoplasms, Prostheses and Implants, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王顺利，史迎宾，张林峰. 体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨治疗良性骨肿瘤和瘤样病变[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4725-4730.

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 回顾性病例对比分析。

1.2 时间及地点 试验于2014年1月至2015年10月在河南大学附属郑州市骨科医院完成。

1.3 对象 选取2014年1月至2015年10月河南大学附属郑州市骨科医院收治的良性骨肿瘤和瘤样病变患者。

纳入标准：①符合骨科良性骨肿瘤以及瘤样病变临床诊断标准；②行植入治疗或骨髓基质干细胞移植治疗；③治疗前均经过穿刺活检，经过组织病理学得到确诊；④术后均经过病理检查得到确诊；⑤试验经河南大学附属郑州市骨科医院伦理委员会同意批准。

排除标准：①合并严重内科基础疾病，如：慢性阻塞性肺气肿、肺心病、恶性心率失常等疾病者；②不能顺利完成试验者或拒绝参加试验者。

共收集65例良性骨肿瘤和瘤样病变患者，其中骨囊肿30例，骨巨细胞瘤24例，骨母细胞瘤11例；股骨远端肿瘤31例，胫骨近端肿瘤22例，桡骨远端肿瘤5例，肱骨近端肿瘤7例。患者及家属对治疗方法及护理措施等完全知晓，且自愿签署知情同意书。根据治疗措施不同分为单纯植骨组(n=30)和骨髓基质干细胞组(n=35)。患者性别、年龄等差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

1.4 材料 同种异体骨冻干骨松质骨颗粒，购自南京屹特博医学科技发展有限公司，国食药监械(准)字2014第3461562号，室温下保存。

钢板购自浙江科惠医疗器械有限公司，医疗器械批准文号：浙金食药监械(准)字2013第1100007号。

1.5 方法

1.5.1 骨髓基质干细胞分离和培养 骨髓基质干细胞来源患者手术前进行局部麻醉，在无菌操作下从患者两侧的髂前上棘或髂后上棘进行穿刺，根据骨量移植情况抽取20-40 mL骨髓，并将其放置在无菌离心管中，放入装有DMEM培养液的离心管中。采用全骨髓培养法分离骨髓基质干细胞^[13]。将获得的标本中放入无血清培养基，1 000 r/min离心10 min，去上清液，PBS洗2或3次，去除上层脂肪及组织液，将下层细胞层放入培养皿中进行两三周培养，待出现致密的细胞层后进行消化、传代接种。取第4代细胞采用胰酶消化接种，并放入1×10^-⁸ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠以及50 mg/L维生素C进行连续培养，采有Gomori钙钻法进行细胞内碱性磷酸酶染色进行鉴定。

1.5.2 体内灌注骨髓基质干细胞诱导工程骨 采用便携式微量注射泵灌注。皮下植入式给药装置主要由注射座、硅橡胶导管2部分组成，管的一头插入圆筒状未贯通的复合有骨髓基质干细胞的天然珊瑚材料中央，插入天然珊瑚材料长度为20 mm，管道的插入部分有多个侧孔。管道的另一端为埋植在患者皮下的注射座。灌注时先找准穿刺窗口，消毒皮面，将针头垂直刺入注射座，然后开始注射2×10⁴骨髓基质干细胞进行工程骨诱导，注射流量为0.1-20 mL/h，并且缓慢注射DMEM培养等细胞因子^[14-15]。

1.5.3 骨髓基质干细胞形态的观察 在倒置相差显微镜下观察原代及传代骨髓基质干细胞的生长及形态变化。原代细胞18-20 d可长满培养皿，细胞接近长满后0.25%胰酶消化进行传代，以1×10⁴/cm²密度接种在培养皿中，倒置显微镜下观察。

1.5.4 肿瘤切除及植骨 根据患者临床症状、病史等选择合适的麻醉方式，待麻醉生效后，在肿瘤部位做纵行切口，充分暴露肿瘤位置，彻底切除肿瘤，电刀烧灼骨缺损腔。

患者手术后15 d后进行后续治疗。骨髓基质干细胞组根据骨缺损部位的大小将体内灌注诱导形成的骨髓基质干细胞诱导的工程骨植入骨缺损部位内，从胫骨外侧、胫前肌下面进行微创移植。而单纯植骨组将生理盐水混合2.0 g同种异体骨冻干骨松质骨颗粒混合30 min后注射至骨缺损部位。根据患者情况确定是否需要采用钢板固定或石膏外固定^[16-17]。

1.5.5 治疗效果观察 观察2组患者治疗12月后不良反应、切口愈合以及植骨融合情况。

1.6 主要观察指标 ①骨髓基质干细胞的形态；②患者骨融合情况；③患者不良反应发生率。

1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，差异存在显著性意义予以LSD法两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

良性骨肿瘤(包括瘤样病变)患者采用外科方法进行治疗。患者治疗时更多的参考肿瘤的分期、部位以及年龄等因素进行综合分析。外科手术治疗方法应该在完全切除肿瘤基础上，尽可能保存正常的骨结构及关节功能^[18]。患者手术后对于骨残腔更多的利用乙醇、石碳酸等进行浸泡，杀死残存的肿瘤细胞，降低患者术后复发率。但是，患者行肿瘤刮除及切除后需要对缺损部位选择合适的植骨材料进行填充^[19-20]。研究显示骨移植材料应该具备以下特性：材料植入机体内能够向机体缺损部位提供骨生成、骨传导并促进其骨愈合^[21]。从骨移植材料的来源来说主要分为自体骨、同种骨、人工骨以及复合材料等几种^[22-23]。自体骨是最为理想的天然材料，但是该材料在临床实际使用时受到的影响因素相对较多，患者治疗后并发症发生率也比较高^[24-25]。

近年来，体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨在良性骨肿瘤(包括瘤样病变)患者中得到应用，且效果理想^[26]。试验中骨髓基质干细胞组股骨、胫骨、肱骨、桡骨愈合时间以及平均愈合时间，显著短于单纯植入骨(P < 0.05)。骨髓基质干细胞来源比较充足，取材也相对比较方便安全，更加利于培养和基因修饰，且成骨能力确定，再加上自体细胞移植并不会产生免疫排斥反应，是目前最为理想的骨组织工程种子细胞。骨髓中主要含有造血系细胞以及骨髓基质细胞，骨髓基质细胞是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能的结缔组织，该细胞具有自我更新和多向分化潜能，能够在体内灌注条件下诱导分化成骨细胞^[27-28]。试验中灌注的骨髓细胞悬液中细胞为圆球形，但是细胞大小不一。细胞灌注最初培养皿造血细胞较多。随着培养时间的延长，可见分布在贴壁梭形细胞及悬浮红细胞，细胞多为圆形、三角形。临床上，体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨植入良性骨肿瘤和瘤样病变患者中效果理想，骨髓基质干细胞与生物材料混合后植入机体内对骨缺损部位进行修复效果理想，能够有效的促进骨愈合能力，能够促进骨质愈合，提高临床治疗效果，促进患者早期恢复，且患者治疗后并发症发生率较低，创伤也比较小^[29-30]。试验中2组患者感染率差异有显著性意义(P > 0.05)。患者治疗后均为甲级愈合。此外，患者治疗后根据患者情况选择钢板或进行外固定，能为植入骨与宿主骨融合创造良好的条件^[31]。

综上所述，体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨效果理想，不仅能够促进血供的重建，还能够为骨细胞的生长提供早期影响，将骨髓基质干细胞构建组织工程骨运用于良性骨肿瘤和瘤样病变中能够促进骨融合和骨缺损愈合，具有较高的临床应用价值。