构建肿瘤坏死因子α刺激基因6慢病毒表达及干扰载体及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
瘢痕疙瘩：又称为结缔组织增生症，在中医上称为蟹足肿或巨痕症，是皮肤创面愈合后所形成的过度生长的异常瘢痕组织，具有以下特点：病变超过原始皮肤损伤范围；呈持续性生长；高起皮肤表面、质硬韧、颜色发红的结节状、条索状或片状肿块。
肿瘤坏死因子α刺激基因6：是在筛选肿瘤坏死因子α干预的人成纤维细胞cDNA 表达文库时首次发现的，其编码蛋白含277个氨基酸，属透明质酸结合蛋白家族。随着对肿瘤坏死因子α刺激基因6基因功能研究的深入，已证实该基因在正常皮肤成纤维细胞中不表达，而接受肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等致炎因子刺激后，肿瘤坏死因子α刺激基因6在成纤维细胞中的表达可显著增加。

摘要
背景：研究表明，肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6)具有抗炎作用，早期创面局部注射TSG-6蛋白可抑制瘢痕形成，但其参与瘢痕形成的机制尚不明确。
目的：构建人TSG-6重组慢病毒表达载体与干扰载体，建立稳定转染的过表达及干扰细胞株，观察TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞株增殖与凋亡的影响。
方法：采用酶消化法分离纯化得到人瘢痕疙瘩成纤维细胞，再以免疫组织化学法鉴定。构建pLVX-puro-TSG-6及pLVX-shRNA1-TSG-6重组慢病毒载体，感染人瘢痕疙瘩成纤维细胞，并行RT-PCR和Western blot检验各组细胞中TSG-6的表达。用MTT法和流式细胞术检测转染后不同时间段内各组细胞增殖和凋亡情况。用Western blot检测各组细胞中Bcl-2、P53及Active-caspase-3的表达。
结果与结论：①成功分离原代人瘢痕疙瘩成纤维细胞，光学显微镜下细胞多呈梭形，传至5代后行波形蛋白的免疫组织化学染色，阳性率为100%，细胞角蛋白染色阴性；②重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功，细胞中TSG-6的表达发生明显变化。与对照组相比，TSG-6过表达组细胞增殖减缓，凋亡率显著升高，TSG-6干扰组细胞增殖加快，细胞凋亡率降低(P < 0.05)；③Western blot结果显示，TSG-6过表达组Bcl-2表达显著降低，P53及Active-caspase-3明显上升(P < 0.05)；④结果表明，TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，且其机制可能与下调Bcl-2 蛋白表达、上调P53 蛋白表达、升高Caspase-3活性有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9651-699X(陈钊)

关键词: 组织构建, 组织工程, 瘢痕, 成纤维细胞, RNA干扰, 过表达, 慢病毒, TSG-6基因, 增殖, 凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Current research has shown that tumor necrosis factor α stimulated gene 6 (TSG-6) has anti-inflammatory effect, and the scar formation can be inhibited by local injection of TSG-6 protein at the early stage of trauma. However, the mechanism of this effect is still unclear.
OBJECTIVE: To construct the lentiviral expression vector and shRNA vector for human TSG-6, with stable overexpression, transfection and interference, and to explore the effect of TSG-6 on proliferation and apoptosis of keloid fibroblast cell lines.
METHODS: Human keloid fibroblast cells were isolated from the keloid’s tissue by enzyme digestion and identified by immunocytochemistry assay. Lentiviral vectors pLVX-puro-TSG-6 and pLVX-shRNA1-TSG-6 were constructed and transfected into human keloid fibroblast, exclusively. Expression levels of TSG-6 mRNA and protein were detected by RT-PCR and western blot assay. MTT assay and flow cytometry were used to estimate the cell proliferation and apoptosis in each group after transfection. In addition, expression of Bcl-2, p53 and active-caspase-3 were detected by western blot assay in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human keloid fibroblasts were separated successfully. Under the light microscope, cells were spindle. Immunohistochemical staining for vimentin was performed in the fifth passage of cells, with the positive rate of 100%. Cells were negative for cytokeratin. (2) Recombinant lentiviral vectors and stably transfected cell lines were successfully established. TSG-6 gene expression was altered apparently. Compared with the control group, cell proliferation was delayed and apoptotic rate was noticeably increased in TSG-6 gene overexpression group. Cell proliferation increased and apoptotic rate decreased in the TSG-6 gene intervention group (P < 0.05). (3) Western blot assay results demonstrated that Bcl-2 expression reduced, P53 and Active-caspase-3 expression significantly increased in the TSG-6 gene overexpression group (P < 0.05). (4) These finding showed that TSG-6 could inhibit proliferation and induce apoptosis in keloid fibroblasts. Its mechanism may be associated with the down-regulation of Bcl-2 protein expression, up-regulation of P53 protein expression and increased Caspase-3 activity.

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Key words: RNA Interference, Cicatrix, Fibroblasts, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈钊，李小静，王晖. 构建肿瘤坏死因子α刺激基因6慢病毒表达及干扰载体及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4319-4327.

Chen Zhao, Li Xiao-jing, Wang Hui. Construction of recombinant lentiviral vector and interfering carrier for tumor necrosis factor alpha stimulated gene 6 and its effect on proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4319-4327.

图/表（结果） 2

2.1 人瘢痕疙瘩成纤维细胞的鉴定结果倒置相差显微镜下观察可见：刚接种的成纤维细胞尚未贴壁时呈球形，贴壁后逐渐伸展，呈梭形、长条形或三角形，约3 d后呈排列紧密的汇合状态。细胞密度低时细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。细胞密度高时，细胞相互平行排列或呈放射状和漩涡状排列^[13]，为典型成纤维细胞形态^[14](图1)。波形蛋白抗体的免疫化学染色阳性，角蛋白19抗体的免疫化学染色阴性，可判断为成纤维细胞^[15]。

2.2 PCR获得TSG-6全长基因结果利用人瘢痕疙瘩成纤维细胞cDNA，通过PCR方法扩增出TSG-6的全长基因，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后得到大小约800 bp特异性单一条带(图2)。

2.3 RT-PCR及Western blot鉴定过表达及干扰效果RT-PCR的检测结果显示：转染TSG-6表达载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其TSG-6基因在mRNA水平的表达明显增高(图3A)；转染TSG-6干扰载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其TSG-6基因在mRNA水平的表达明显降低(图3B)；与此同时，Westernblot检测也得到了相同结果，证实TSG-6基因在蛋白水平表达量的变化与其在mRNA水平表达变化一致(图3C，D)。

2.4 MTT法检测细胞增殖结果对各组细胞培养24，48，72，96 h后观察，可见TSG-6基因表达上调对细胞增殖有明显的抑制作用。转染TSG-6表达载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其增殖效应较人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组明显减缓(P < 0.05)，而转染TSG-6干扰载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其增殖较人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组有所加快(P < 0.05)，人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组、过表达对照组、干扰对照组细胞的增殖趋势差异无统计学意义(图4)。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡结果对各组细胞传代贴壁培养72 h后，进行流式细胞术分析，结果显示TSG-6基因表达上调对细胞凋亡有明显的促进作用。与人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组相比，转染TSG-6表达载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其细胞凋亡率明显增高(P < 0.05)；转染TSG-6干扰载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)；人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组、过表达对照组、干扰对照组间差异无统计学意义(图5)。

2.6 Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白P53及Active-caspase-3的表达 Western blot的检测结果显示：转染TSG-6表达载体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低，凋亡蛋白P53及Active-caspase-3的表达显著升高；转染TSG-6干扰载

体的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，其抗凋亡蛋白Bcl-2的升高，凋亡蛋白P53及Active-caspase-3的表达降低；人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组、过表达对照组、干扰对照组间差异无统计学意义(图6)。

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引言

皮肤创伤愈合是十分精细而复杂的过程，过度愈合会导致病理性瘢痕(包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩)的形成^[1]。瘢痕疙瘩是一种表现为成纤维细胞过度增殖和以胶原为主的细胞外基质过度沉积的皮肤纤维增生性疾病^[2]。有研究表明，组织损伤后的瘢痕形成等纤维化病理过程可归因于炎症反应，其病变程度也与炎症反应密切相关^[3-4]。瘢痕对患者外观及功能影响较大，但由于发病机制尚不明确，其治疗成为整形外科临床工作中的一个难题，而抑制成纤维细胞增殖或促使其凋亡则成为瘢痕治疗的一个很有意义的研究领域^[5]。

肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6)是在筛选肿瘤坏死因子α干预的人成纤维细胞cDNA 表达文库时首次发现的，其编码蛋白含277个氨基酸，属透明质酸结合蛋白家族^{[6- 7]}。随着对TSG-6基因功能研究的深入，已证实该基因在正常皮肤成纤维细胞中不表达，而接受肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等致炎因子刺激后，TSG-6在成纤维细胞中的表达可显著增加^[8]。生成的TSG-6可通过抑制炎症因子白细胞介素6、白细胞介素1α、白细胞介素1β等的表达及抑制中性粒细胞的浸润等途径，发挥抗炎及促进细胞外基质重塑的作用^[9]。故而TSG-6基因被视为是一个受肿瘤坏死因子α等炎症因子调节的、参与多种炎性反应的、具有保护性作用的炎性反应基因^[10]。Tan等^[11]的实验表明，相对于瘢痕疙瘩皮肤样本，无瘢痕愈合皮肤样本中TSG-6的表达量明显增高，无瘢痕愈合或可与TSG-6蛋白的高表达相关。课题组前期实验结果证明，在创伤早期的瘢痕组织中局部注射重组人TSG-6蛋白，对瘢痕形成及增生具有抑制作用^[12]。

因此，实验设想分离培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞(human keloid fibroblast，HKF)，借助慢病毒稳定转染的方式实现TSG-6基因的过表达与干扰，观察过表达载体与干扰载体转染后人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的变化，分析TSG-6表达对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响。同时，拟通过检测各组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白P53及活化的caspase-3的表达情况，初步探讨形成这一影响的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验性研究。

1.2 时间及地点实验于2014年11月至2015年9月在安徽医科大学基础医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 标本新鲜切取的瘢痕疙瘩组织样本10例，取材自安徽医科大学第一附属医院整形外科临床诊断的瘢痕疙瘩患者中自愿行切除者。所有标本取材均已获得患者本人或其监护人的知情同意。实验对所有样本的处理方法符合国家卫生和计划生育委员会印发的《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》。

1.3.2 载体及细胞 pLVX-Puro和pLVX-shRNA1质粒载体购自美国Clontech公司，大肠杆菌DH5a和293T细胞由安徽医科大学微生物教研室提供。

试剂：Ⅳ型胶原酶(Sigma)；胰蛋白酶、MTT细胞增殖检测试剂盒(碧云天)；Lipofectamine 2000、TRIzol^® Reagent (Lifetechnologies)；Transcriptor First Strand cDNA Syn-thesis Kit、LC 480 SYBR Green I Master(Roche)；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T₄ DNA连接酶、DNA回收试剂盒(TaKaRa)；无内毒素质粒提取试剂盒(QINGEN)；Annexin V凋亡检测试剂盒(凯基)；鼠抗人Vimentin抗体，鼠抗人CK19抗体、鼠抗人TSG-6抗体，鼠抗人Bcl-2抗体、鼠抗人P53抗体，鼠抗人Active-caspase-3抗体(Abcam)。

1.4 实验方法

1.4.1 人瘢痕疙瘩成纤维细胞培养于超净工作台无菌条件下切削手术取得的瘢痕疙瘩标本，去除血管和表层皮肤等结缔组织。切小块置于离心管，加入5倍体积质量浓度1 g/L的DMEM为溶剂的IV型胶原酶溶液，170 r/min 37 ℃体积分数5%CO₂恒温振荡器振荡8-12 h，弃去残余未溶解消化的标本。1 200 r/min 5 min离心后弃上清，加入DMEM吹打混匀后，再次以1 200 r/min 5 min离心弃上清，重复漂洗2次。加入适量含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基吹打混匀，调整适宜细胞浓度接种至培养瓶，置37 ℃体积分数5% CO₂培养箱中培育，次日更换培养液，弃去未能贴壁及生长状况不佳的细胞。倒置显微镜下观察细胞生长状况，及时更换与补充培养液，3-5 d可贴壁生长达80%以上，此时即可以胰酶消化按1∶2-1∶3比例传代。

1.4.2 细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定倒置显微镜下观察细胞的生长状况，记录细胞形态。对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的鉴定采用免疫化学染色法：培养细胞至适当代龄后，制作细胞爬片，待细胞生长达到50%以上时，置于40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，后进行免疫化学染色。应用SABC法，以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆抗体为阴性对照，PBS为空白对照，依试剂盒说明步骤进行成纤维细胞波形蛋白抗体染色，DAB显色，显微镜下观察。

1.4.3 引物设计合成根据GenBank中TSG-6的参考序列设计TSG-6的全基因扩增引物，上游引物：5’GGA ATT CAT GAT CAT CTT AAT TTA CT3’，下游引物：5’CGG GAT CCT AAG TGG CTA AAT CTT CC3’，扩增产物为828 bp，加限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切位点及保护碱基。设计TSG-6基因的干扰序列：根据GenBank中TSG-6的参考序列设计3条siRNA序列和对照序列：

TSG-6 siRNA1：5’GGT TTC CAA ATC AAA TAT GTT GCA A3’，

TSG-6 siRNA2：5’GGA TCA AAT AGA GAG CGT TAT CAC G3’，

TSG-6 siRNA3：5’GCA AAT ACA AGC TCA CCT ACG3’，

Scrambled siRNA：5’GTT GCA TTC GTC GAT TAA TTA CAC G3’。

根据设计的序列合成5’端标记绿色荧光基团FAM的双链互补片段，Scrambled siRNA未标记FAM。以各组siRNA转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞，行RT-PCR检测干扰效率，选取干扰效率高的siRNA。所有引物序列均交送上海生工公司合成完成。

1.4.4 重组慢病毒表达载体pLVX-pour-TSG-6的构建从人瘢痕疙瘩成纤维细胞中提取总RNA，反转录获取cDNA，进行PCR扩增，1%琼脂凝胶进行电泳观察PCR是否成功。将PCR产物和慢病毒表达载体pLVX-Puro进行双酶切，通过凝胶回收试剂盒回收酶切后的PCR产物和载体，测定浓度后，通过T4 DNA连接酶进行连接，以连接产物转化感受态细菌。挑取阳性克隆于含Amp的液体LB培养基中扩增培养，用无内毒素质粒提取试剂盒从100 mL菌液中提取质粒，检测浓度后备用。

1.4.5 重组慢病毒干扰载体pLVX-shRNA1-TSG-6的构建根据筛选取得的siRNA序列，设计互补shRNA序列如下：

GAT CCG CAA ATA CAA GCT CAC CTA CGA ACG CGT AGG TGA GCT TGT ATT TGC G

GCG TTT ATG TTC GAG TGG ATG CTT GCG CAT CCA CTC GAA CAT AAA CGG CTT AA

同时分别在两端增加EcoR I和BamH I酶切位点的黏性末端，合成2条互补寡核苷酸片段后，形成双链的DNA片段。将慢病毒shRNA表达质粒pLVX-shRNA1用EcoR I和BamH I进行双酶切，通过DNA凝胶回收试剂盒回收纯化酶切后的质粒。通过T₄ DNA连接酶进行连接，以连接产物转化感受态细菌。挑取阳性克隆于含Amp的液体LB培养基中扩增培养，用无内毒素质粒提取试剂盒从100 mL菌液中提取质粒，检测浓度后备用。

1.4.6 慢病毒包装及滴度测定转染前1 d将293FT细胞接种到100 mm平皿中，确保第2天细胞可以铺满80%。更换无血清无抗生素DMEM培养基，用1 mL DMEM稀释5 μg pLVX-Puro-TSG-6质粒+4.5 μg psPAX2+4.5 μg pMD2.G；再用1 mL DMEM稀释45 μL lipofectamine 2000，反复吹打数次，室温静置5 min；同时用5 μg pLVX-Puro-TSG-6空质粒包装慢病毒。将质粒和lipofectamine 2000混合，室温静置20 min。从平皿中吸出2 mL培养基，加入2 mL质粒和lipofectamine 2000混合物，6 h后弃去培养基，改用DMEM+体积分数10%FBS继续培养。48 h后取20 μL培养上清检测慢病毒滴度，滴度大于10⁶PFU/mL即可收获培养上清，4 ℃，12 000×g，离心30 min去除细胞碎片后-80 ℃冻存备用。同样将pLVX-Puro空质粒包装慢病毒-80 ℃冻存备用。同样方法包装TSG-6干扰慢病毒。

1.4.7 慢病毒感染和筛选将人瘢痕疙瘩成纤维细胞消化后调整细胞浓度至5×10⁷ L^-1，向6孔板中每孔接种 2 mL细胞悬液。次日，分别按MOI(病毒含量/细胞数)=20，向6孔板中加入各组病毒液，并向其中加入终浓度为8 mg/L polyberne继续培养。感染后第5天，按上述方法再次感染细胞1次，48 h后用含2.5 mg/L Puromycin的培养基筛选细胞，持续筛选1周后，改用正常培养基继续培养细胞，获取TSG-6过表达的人瘢痕疙瘩成纤维细胞组、TSG-6干扰的人瘢痕疙瘩成纤维细胞组及与之对应的过表达对照组、干扰对照组。提取RNA并用荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平，同时通过Western Blot检测TSG-6的表达水平。

1.4.8 RT-PCR检测人瘢痕疙瘩成纤维细胞TSG-6 mRNA的表达分别收集人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组细胞、TSG-6过表达的人瘢痕疙瘩成纤维细胞组细胞、TSG-6干扰的人瘢痕疙瘩成纤维细胞组细胞、过表达对照组细胞、干扰对照组细胞，提取其总RNA，逆转得到cDNA，采用SYBR Green法进行荧光定量PCR。引物根据GenBank中TSG-6基因序列设计：上游引物：5’AGG AGT GAA AGA TGG GAT GC3’，下游引物：5’ATT TGG GAA GCC TGG AGA TT3’，由上海生工公司合成。反应参数设置为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共35个循环。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，以Gel pro(V4.0)凝胶光密度分析软件分析，测其吸光度值，计算TSG-6基因相对表达量。将数据导入SPSS软件(V19.0)采用单因素方差分析获得柱状图。

1.4.9 Western-blot检测人瘢痕疙瘩成纤维细胞TSG-6蛋白的表达分别收集人瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组细胞、TSG-6过表达的人瘢痕疙瘩成纤维细胞组细胞、TSG-6干扰的人瘢痕疙瘩成纤维细胞组细胞、过表达对照组细胞、干扰对照组细胞，裂解提取细胞总蛋白，以BCA法蛋白定量。制备好的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉 37 ℃封闭1.5 h后，加入1∶2 000稀释的鼠抗人TSG-6抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入1∶3 000稀释的羊抗鼠二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后与化学发光底物孵育5 min，曝光、显影、定影。用GAPDH作内参验证蛋白含量。

1.4.10 MTT法检测细胞增殖取对数生长期的各组细胞，以1×10⁴/孔接种于96孔板培养，分别于24，48，72，96 h每组细胞取5个孔，加入20 μLMTT溶液，37 ℃体积分数5%CO₂培养箱孵育4 h后弃上清。加入150 μL二甲基亚砜振荡10 min，酶标仪检测490 nm波长各孔吸光度值，以空白对照调零。每组5个复孔，重复3次。

1.4.11 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组细胞，胰酶消化收集细胞后用预冷PBS重悬洗涤细胞，离心沉淀，加入体积分数70%乙醇4 ℃固定24 h，再次离心沉淀，调整细胞量至检测液中细胞浓度为1×10⁹L^-1，配制Binding Buffer和Annexin V标记液，室温避光孵育15 min后加入PI，每100 μL孵育液中加预冷的400 μL Binding Buffer稀释，15 min内进行流式检测。细胞凋亡率=(凋亡细胞数量/正常细胞数量)×100%。

1.4.12 Western-blot检测人瘢痕疙瘩成纤维细胞Bcl-2、P53、活化caspase-3蛋白的表达方法同前，分别选择1∶2 000稀释的鼠抗人Bcl-2抗体、1∶2 000稀释的鼠抗人P53抗体、1∶2 000稀释的鼠抗人Active- caspase-3抗体作为一抗检测各组细胞中Bcl-2、P53、活化caspase-3蛋白的表达。

1.5 主要观察指标人瘢痕成纤维细胞的细胞形态，表达载体及干扰载体转染后TSG-6的表达，细胞增殖能力，细胞凋亡率，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，凋亡蛋白P53和活化的caspase-3的表达。

1.6 统计学分析计量数据以x(_)±s表示，采用统计软件SPSS 19.0分析，组间差异的比较采用两样本t 检验进行分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

病理性的瘢痕增生是皮肤组织创伤后过度修复的结果，表现为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过量沉积^[2]。瘢痕疙瘩具有持续性向周围正常组织侵袭生长、破坏正常皮肤附属器、无自限倾向等病理学特征，所以多数学者认可瘢痕疙瘩是一种因增殖与凋亡调节的不适当表达而引起的良性真皮纤维组织肿瘤^[16]。当瘢痕疙瘩进行性侵袭周围正常皮肤组织时，其成纤维细胞可浸润扩散至未受损真皮，使得正常皮肤组织与瘢痕组织间不能形成明确分界。引起这一结果的可能原因是真皮中缺乏一种在正常情况下可抵抗瘢痕成纤维细胞侵入的物质，或者瘢痕疙瘩成纤维细胞本身的性状发生了改变，形成了一类不受正常生理调控的细胞，即瘢痕疙瘩成纤维细胞^[17]。一方面，瘢痕疙瘩中成纤维细胞异常增殖且不能正常凋亡使其数量增多，另一方面，成纤维细胞是产生胶原等细胞外基质成分的主要功能细胞，因此，成纤维细胞生长的正常调节机制的失控是人瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖、异常合成与分泌胶原并最终导致瘢痕形成的一个重要环节，而抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖或促使其凋亡则成为瘢痕治疗的关键。

皮肤创伤愈合过程一般经历炎症反应、组织增殖和成熟与重塑等阶段。炎症反应既可以作为免疫屏障起到抗感染作用，同时又能刺激局部组织细胞生成纤维蛋白以闭合创面。因而，适度的炎症反应利于愈合，但过度的炎症反应则会导致瘢痕形成^[18]。Burrington等^[19]对胎儿创面愈合的研究表明，胎儿的创面可达到外观与正常组织难以区别的无瘢痕愈合状态。在后续实验中发现，通常无瘢痕愈合者的炎症反应较弱，且处于暴露环境中的免疫发育不完全个体亦可无瘢痕愈合，提示缺乏免疫反应是胎儿达成无瘢痕愈合的最关键因素，而非无菌环境的作用^[20]，并且，通过限制创伤愈合过程中的炎症反应，可以减少创面愈合后的瘢痕生成^[21]。在Peranteau等^[22]的研究中，通过上调抗炎因子白细胞介素10的表达，可以将白细胞介素6和白细胞介素8的表达控制在较低水平，减少炎症反应，在成体瘢痕模型中有效减少瘢痕组织的增生。

TSG-6已被证实受肿瘤坏死因子α调节启动表达，早期学者认可TSG-6蛋白参与多种炎性反应的基因，具有明显的抗炎作用^[9^，^23]。Oh等^[24]在兔角膜损伤模型中观察到，将重组人TSG-6蛋白(recombinant human TSG-6，rhTSG-6) 早期应用于角膜损伤，可以抑制炎症因子白细胞介素6和白细胞介素1β的表达及抑制中性粒细胞浸润，保护角膜免受自体免疫损害。Bardos等^[25]在关节炎鼠模型中发现，TSG-6可使炎症局限，减轻关节水肿和软骨与骨质破坏。有研究表明，TSG-6主要通过与间α胰蛋白酶抑制物、CD44和HA等氨基葡聚糖类物质相结合来发挥抗炎作用^[10]。而Choi等^[26]的实验表明，TSG-6也可借由NF-κB途径减轻炎症反应，并提出TSG-6可以对炎症起到负反馈调节作用。炎症反应中生成的肿瘤坏死因子α等免疫因子释放，可以激活正常组织中无明显表达的TSG-6基因，而伴随TSG-6蛋白在胞内积累，通过干扰白细胞介素6、白细胞介素8等炎症因子的分泌，减少单核细胞募集与巨噬细胞活化^[27]，从而起到调低并局限炎症反应的作用。

随着炎症在瘢痕形成过程中作用机制的研究，许多学者将抗炎因子作为瘢痕治疗研究的方向，以期减少瘢痕形成，提高创面愈合质量^[28]。Tan等^[11]的实验表明，无瘢痕修复皮肤组织中的TSG-6表达水平明显高于瘢痕疙瘩组织，而在TSG-6研究的早期就已证实，TSG-6蛋白在正常皮肤组织中无明显表达，仅在接受多种炎症因子刺激后，其表达量才会有显著升高^[23]，据此推断，TSG-6表达的不足可能是导致病理性瘢痕形成的因素之一。因此，课题组在前期试验中，将重组人TSG-6蛋白局部注射于兔耳瘢痕模型创面后，白细胞介素1β、白细胞介素6 及肿瘤坏死因子α的表达有所减少，减轻了创面的炎症反应的同时，对瘢痕形成起到了明显的抑制作用^[29]。

此次实验中，作者通过构建TSG-6的慢病毒表达及干扰载体并转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞，获得稳定的TSG-6过表达及干扰的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，分别通过MTT法及流式细胞术检测TSG-6对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响，结果显示TSG-6基因的高表达可以明显调低人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖效应，增加人瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率。这一结果从现象上证实了TSG-6在瘢痕形成过程中可以起到抑制作用，且在创面愈合过程中，炎症反应增强的同时TSG-6表达的不足，将会引起瘢痕的形成。

Bcl-2蛋白是一种广泛存在于人体组织细胞的内膜蛋白，研究表明Bcl-2基因在多种肿瘤中有异常高表达，提示其具有抑制凋亡的作用^[30]。而对正常皮肤与瘢痕组织行免疫组织化学方法检测，发现Bcl-2蛋白在瘢痕组织中的表达阳性率明显高于正常皮肤，提示瘢痕组织中成纤维细胞富集可能与上调表达的Bcl-2的抗凋亡效应存在关联^[31-32]。

作者前期通过实验证明，将重组人TSG-6蛋白作用于体外培养的人瘢痕成纤维细胞，可以引起Bcl-2蛋白表达明显降低^[33]。P53可通过调节caspase蛋白家族中多种凋亡蛋白的表达，参与细胞正常生命活动的调节，其失活对肿瘤形成起重要作用^[34]。相关实验表明，瘢痕组织中P53表达较正常皮肤组织明显偏低，而在体外培养细胞试验中，通过RNA干扰抑制P53蛋白的表达能够延迟成纤维细胞的衰老并促进细胞增殖，因此，病理性瘢痕形成可能与P53表达受到抑制有关^{[35- 36]}。相关实验表明，凋亡蛋白P53的表达可通过其诱导产物抑制抗凋亡蛋白Bcl-2水平^[37]。本实验表明，TSG-6过表达组中凋亡蛋白P53表达水平明显升高而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低，统计学分析表明两者间有线性相关的关系，提示在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中TSG-6可能是通过促进凋亡蛋白P53表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、活化凋亡因子caspase-3来实现对人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程