心肌干细胞调控ANG Ⅱ/AT1R/TGF-β1/SMAD/CX43通路改进心电生理学稳定性和室颤阈值

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.018

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (28): 4226-4233.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.018

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

心肌干细胞调控ANG Ⅱ/AT1R/TGF-β1/SMAD/CX43通路改进心电生理学稳定性和室颤阈值

晏平¹，侯婧瑛²，郑韶欣^3，龙会宝²，钟婷婷²，周长青²，郭天柱²，伍权华²，王彤²

¹广州医科大学附属第一医院急诊科，广东省广州市 510120；中山大学孙逸仙纪念医院，²急诊科，³心内科，广东省广州市 510120

修回日期:2016-04-19 出版日期:2016-07-01 发布日期:2016-07-01
通讯作者: 王彤，博士，博士生导师，教授，主任医师，研究员，中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120
作者简介:晏平，女，1978年生，贵州省凯里市人，汉族，2008年温州医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞与心血管疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81270213)“ANGⅡ/AT1/SMAD/CX43通路在心肌干细胞提高心梗大鼠心电生理学稳定性和室颤阈值的作用机制研究”；国家自然科学基金(81070125)“抗凋亡与促血管生成miRNA-378干预MSCs治疗心梗后心衰的机制研究”；广东省科技计划项目(2010B031600032)“抗凋亡与促血管生成miRNA-378干预MSCs治疗心梗后心衰的机制研究”；高校基本科研业务费中山大学青年教师重点培育项目(13ykzd16) “PPAR-γ/TGF-β1/Smad/CX43通路在PPAR-γ干预MSCs治疗心梗后心衰的疗效及机制研究”；广东省科技计划项目(2014A020211002)“LncRNA-Bvht/MESP1/ N-cadherin通路调控MSCs向心肌细胞定向分化的机制研究”

Cardiac stem cells improve the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold via ANGII/AT1R/TGF-beta1/SMAD/CX43 signaling pathway

Yan Ping¹, Hou Jing-ying², Zheng Shao-xin³, Long Hui-bao², Zhong Ting-ting², Zhou Chang-qing², Guo Tian-zhu², Wu Quan-hua², Wang Tong²

1Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
²Department of Emergency, ³Department of Cardiology, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2016-04-19 Online:2016-07-01 Published:2016-07-01
Contact: Wang Tong, M.D., Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Researcher, Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Yan Ping, Master, Attending physician, Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81270213, No. 81070125; the Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China, No. 2010B031600032, No. 2014A020211002; Fundamental Research Fund for Young Teacher Training in Sun Yat-sen University, China, No.13ykzd16

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
缝隙连接蛋白43：是心室肌细胞间相互连接的主要连接蛋白，其主要功能是完成心脏细胞之间的电化学交换，确保不同类型心肌细胞间“电偶连”与“生化偶联”得以正常进行。心脏中足够的缝隙连接蛋白43能保证正常的传导速度和较小的异向性，减少了动作电位在细胞间的离散度。一旦缝隙连接蛋白43减少，将导致传导速度减慢，异向性增加，动作电位离散度增大，心律失常发生的可能性显著增加。
心肌干细胞：可分泌多种因子，包括血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、血管细胞黏附分子1和其他营养因子等。这些旁分泌因子中，有一些与肾素-血管紧张素系统有重要的关系，如胰岛素样生长因子1能逆转血管紧张素Ⅱ从而促进心肌干细胞的增殖和分化，初步预实验结果表明，心肌干细胞移植后组织中胰岛素样生长因子1的表达明显增加。

摘要
背景：课题组前期研究证实心肌干细胞移植中期(6周)能有效改善心肌梗死大鼠的心电生理稳定性和室颤阈值，但具体的调控机制和通路不明。
目的：探讨心肌干细胞改善心肌梗死大鼠心电生理学稳定性和室颤阈值的相关分子调控机制。
方法：通过开胸结扎20只SD大鼠左前降支冠状动脉建立心肌梗死模型，并随机分为2组：心肌干细胞组和PBS组，每组10只。造模后2周心肌干细胞组在局部梗死心肌内注射PKH26标记的由PBS悬浮的心肌干细胞，PBS组在梗死心肌内注射等量PBS。细胞移植后6周取外周血及左心室心肌组织检测ANG Ⅱ/AT1R/TGF-β1/SMAD/Cx43通路相关因子的变化。
结果与结论：①与PBS组相比，Cx43在心肌干细胞组梗死区、梗死边缘区、非梗死区的表达明显增加(P < 0.01)；②与PBS组相比，ANG Ⅱ在心肌干细胞组血浆(P < 0.05)和左心室各区域(P < 0.01)的表达明显减少；③与PBS组相比，心肌干细胞组左心室心肌组织不同区域AT1R、TGF-β1、SMAD2、SMAD3表达下降(P < 0.01)，而SMAD7表达增加(P < 0.05)；④结果表明，心肌干细胞移植改善心肌梗死大鼠的心电生理学稳定性和室颤阈值的机制可能与调控ANG Ⅱ/AT1R/ TGF-β1/SMAD/CX43通路，导致CX43表达增加密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5238-4534(晏平)

关键词: 干细胞, 移植, 心肌干细胞, 缝隙连接蛋白43, 血管紧张素Ⅱ, 转化生长因子β1, 心电生理学特性, 室颤阈值, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold after myocardial infarction in rats are significantly improved in the mid-term of cardiac stem cell transplantation, but relative regulatory mechanism and pathway remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the relative molecular regulatory mechanism of cardiac stem cells improving the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold after myocardial infarction in rats.
METHODS: Myocardial infarction was induced in 20 Sprague-Dawley rats by ligation of the left anterior descending coronary, which were then randomized into two groups (n=10 per group) and were subjected to the injection of cardiac stem cells labeled with PKH26 in phosphate buffer solution (cardiac stem cell group) or the same amount of phosphate buffer solution (PBS) alone (PBS group) into the local infarct zone at 2 weeks after modeling, respectively. Six weeks later, relevant signaling molecules involved in the ANGII/AT1R/TGF-β1/SMAD/Cx43 pathway were all examined in myocardial tissues of the left ventricle and harvested blood samples.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the PBS group, expressions of connexin 43 in different zones of the left ventricle were significantly increased in the cardiac stem cell group (P < 0.01); there was a significant reduction of the angiotensin II level in plasma and different regions of the left ventricular (P < 0.05; P < 0.01). Furthermore, in the cardiac stem cell group, expressions of angiotensin II type I receptor, transforming growth factor-β1, SMAD2 and SMAD3 were significantly decreased (P < 0.01). Whereas SMAD7 was significantly elevated (P < 0.05) in different areas of the left ventricle compared with the phosphate buffer solution group. These findings suggest that the cardiac stem cell transplantation can improve the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold after myocardial infarction by enhancing the expression of connexin 43 via ANGII/AT1R/TGF-beta1/SMAD/CX43 signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Myocardium, Connexins, Angiotensin II, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

晏平，侯婧瑛，郑韶欣，龙会宝，钟婷婷，周长青，郭天柱，伍权华，王彤. 心肌干细胞调控ANG Ⅱ/AT1R/TGF-β1/SMAD/CX43通路改进心电生理学稳定性和室颤阈值[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4226-4233.

Yan Ping, Hou Jing-ying, Zheng Shao-xin, Long Hui-bao, Zhong Ting-ting, Zhou Chang-qing, Guo Tian-zhu, Wu Quan-hua, Wang Tong. Cardiac stem cells improve the electrophysiological stability and ventricular fibrillation threshold via ANGII/AT1R/TGF-beta1/SMAD/CX43 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4226-4233.

图/表（结果） 2

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引言

心肌梗死所导致的充血性心力衰竭和恶性心律失常是心血管病致死的主要原因，尤其是恶性心律失常所导致的心源性猝死^[1]。尽管新的有效药物不断涌现以及心血管介入治疗技术的不断成熟，使得心血管疾病的治疗取得了长足的进步，但是，心肌梗死后心力衰竭和恶性心律失常的发病率和致死率仍然很高^[1]。近年来，干细胞治疗心肌梗死作为一种新的治疗方法取得了一些重要的进展。动物实验和临床研究均证实干细胞治疗心肌梗死能缩小梗死面积、改善心功能和临床症状、改进心电生理学稳定性和室颤阈值^[2-5]。心肌干细胞来源于心脏组织，能程序化的分化为心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞，其作为理想的种子细胞被用于心肌梗死的治疗。与其他干细胞类型相比，心肌干细胞具有无可比拟的优势^[6]。课题组在前期的研究中发现心肌干细胞移植能明显改善心肌梗死大鼠的心电生理学稳定性和提高室颤阈值^[5]，且进一步的研究中发现，在改善大鼠心电生理学稳定性和提高室颤阈值方面，心肌干细胞明显比骨髓间充质干细胞优越^[7]。心肌干细胞移植大鼠梗死区和梗死边缘区的缝隙连接蛋白43表达明显增加，但机制不明。

心肌梗死后，肾素-血管紧张素系统(renin- angiotensin system, RAS)被激活，血浆中血管紧张素Ⅱ(Angiotensin II, ANG Ⅱ)水平升高，血管紧张素Ⅱ与心肌细胞肥大、心室重构、电生理异常、心力衰竭密切相关^[8]，血管紧张素Ⅱ主要与血管紧张素Ⅱ受体1型(angiotensin II type 1 receptor, AT1R)结合并起作用。有实验证明阻断血管紧张素Ⅱ受体1型能减轻室性心律失常的发生率^[9]。转化生长因子β1(Transforming growth factor beta-1，TGF-β1)是血管紧张素Ⅱ的关键下游分子。转化生长因子β1与心肌梗死后的病理重构、间质纤维化、细胞增殖、炎症及免疫密切相关^[10]，最近的研究显示转化生长因子β1与缝隙连接蛋白43(Connexin 43， Cx43)密切相关^[11]。缝隙连接蛋白43与心肌细胞的电生理学稳定性密切相关^[12]。缝隙连接蛋白43的向下调节和分布异常均会导致心脏电生理的异常^[12]。心肌梗死后缝隙连接蛋白43参与的电生理重构受许多因素的影响，到目前为止，其卷入的相关分子机制尚未明确，尤其是心肌干细胞治疗后心电生理学改善和室颤阈值提高是否与缝隙连接蛋白43及其通路相关，尚未见相关报道。为此，课题组探讨心肌干细胞改善心肌梗死大鼠心电生理学稳定性和提高室颤阈值的相关分子调控机制与ANG Ⅱ/AT1R/TGF-β1/SMAD/Cx43通路相关。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2013年1月至2014年12月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

1.3 材料 新生3 d SPF级SD雄性大鼠10只，体质量约25 g，用于心肌干细胞分离、培养传代及标记；6月龄清洁级健康雄性SD大鼠20只，体质量(250±25) g，用于制备心肌梗死模型。上述实验动物均由中山大学动物实验中心提供，动物许可证号：0067926，动物实验设施许可证号：0050040。模型制备成功后，按随机数字表法分为2组：心肌干细胞组、PBS组，每组10只。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠心肌梗死模型的制备 采用开胸直视下结扎左前降支冠状动脉方式制备心肌梗死模型，详见作者课题组参考文献[5，7]。左前降支冠状动脉缝扎成功的标记是肢体心电图ST段明显抬高，QRS波宽大畸形。如有室颤发生，立即胸外按压或使用2 J的电能量电击除颤，直到心电图转复为窦性心率为止。动物苏醒后拔除气管导管，放回笼内继续喂养。

1.4.2 心肌干细胞的分离、培养、传代和标记 取新生后第3天的SD雄性大鼠心脏，采用组织培养法分离培养心肌干细胞，详见课题组参考文献[5，7]。所有用于动物实验的细胞均为第3代细胞。实验细胞均经PKH26染色后再移植。

1.4.3 心肌干细胞移植^[5^，^7] 模型制备成功后2周，动物重新麻醉，行气管插管，随后心肌干细胞组、PBS组动物进行第2次开胸手术并分别接受0.1 mL PKH26标记的5×10⁶心肌干细胞、0.1 mL等量的PBS从梗死心肌局部注射。其余步骤与模型制备阶段相同。

1.5 主要观察指标

1.5.1 ELISA法检测血管紧张素Ⅱ水平 在心肌干细胞移植后6周，大鼠处死前收集外周血，4 ℃下1 500 r/min离心15 min后，血清放入-20 ℃冰箱中保存用于下一步检测；大鼠随后处死，摘取心脏，仔细分离梗死区、梗死边缘区、非梗死区组织并迅速放置于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA法检测血清和各组织区域中血管紧张素Ⅱ水平，取平均值。

1.5.2 免疫荧光染色观察心肌梗死区、边缘区、非梗死区Cx43的表达 心脏标本采用40 g/L多聚甲醛固定24-36 h，常规脱水，石蜡包埋连续切片，切片厚度3- 5 μm，固定到载玻片上；常规脱蜡水化；抗原修复以充分保露抗原，提高抗原的检测率；滴加体积分数为10%正常山羊血清室温下封闭30 min，用于吸附组织中的非特异性位点，以免造成后续结果的假阳性。滴加一抗 (1︰100)4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min；滴加荧光标记二抗(1︰200)室温湿盒避光孵育1 h；PBS洗涤3次，每次5 min；DAPI染色室温下湿盒避光孵育5 min；PBS洗1次，5 min；滴加抗荧光淬灭剂封固；荧光显微镜下观察心肌梗死区、边缘区、非梗死区Cx43的表达并拍照。

1.5.3 Western blot检测Cx43，AT1R，AT2R，TGF-β1，SMAD2，SMAD3和SMAD7蛋白表达 用500 μL RIPA裂解液(含PMSF和Cocktail)裂解100 mg心脏各区域组织30 min，4 ℃下14 000 r/min离心10 min，取上清组织中总蛋白于-20 ℃或-80 ℃保存备用。采用BCA法测定各样品蛋白浓度，常规SDS-PAGE电泳及蛋白电转，转膜后的PVDF膜用5%脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h或4 ℃过夜；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应的一抗稀释液4 ℃过夜或37 ℃孵育2 h；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应二抗稀释液37 ℃孵育1 h；TBST洗膜 5 min，3次；蒸馏水漂洗膜2 min，3次；将总体积= 0.125 mL/cm²膜面积的发光液均匀加到膜的表面，室温孵育5 min，小心吸去膜表面多余的发光液，放至暗盒后显影。

1.5.4 qRT-PCR检测Cx43，AT1R，AT2R，TGF-β1，SMAD2，SMAD3和SMAD7 mRNA表达 用液氮研磨组织至粉末，加入1 mL Trizol溶液提取总RNA，并使用核酸蛋白分析仪和1.6%琼脂糖电泳对所提取的总RNA 进行分析。取总RNA液8 μL，70 ℃水浴5 min后加入反转录反应液17 μL，42 ℃孵育60 min 后终止反应，留取产物待用。qRT-PCR扩增参数：95 ℃ 10 min(1个循环)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s(40个循环)；72 ℃延伸 10 min。反应结束后，由软件自动计算出定量结果，具体引物设计见表1。

1.6 统计学分析 所有数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0 for windows 软件处理，两独立配对样本的资料采用Student’s双尾t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞作为新的策略已广泛用于治疗心血管疾病，干细胞治疗心肌梗死主要聚焦于心肌的修复和心肌细胞的再生。尽管干细胞治疗心血管疾病被许多研究证明有效，但仍然阻止不了人们的担忧，那就是干细胞移植之后是否诱发或加重恶性心律失常的发生^[13-14]。干细胞在心脏中与宿主心肌细胞如果不能形成正常的收缩偶联，将会导致致命性的心律失常发生^[15]。移植的细胞与宿主心肌细胞整合必须通过产生缝隙连接来实现，这些缝隙连接介导电和化学偶联。Cx43是缝隙连接的主要成员，Cx43的缺乏能导致致命性心律失常的发生，移植转染了Cx43基因的祖细胞能改善心电生理学的异常重构和预防梗死后的心律失常^[16]。

在目前诸多可供心血管疾病治疗的干细胞种类中，心肌干细胞被认为是治疗心血管疾病的最佳种子细胞之一^[17]。课题组之前的研究提示，心肌干细胞移植治疗心肌干细胞能明显改善心电生理学稳定性和促进Cx43的表达，心肌干细胞移植后6周，能在梗死区和梗死边缘区发现存活的心肌干细胞并表达Cx43^[5^，^7]，这说明心肌干细胞不仅能修复损伤的心肌，并且还能促进Cx43表达，进而改善心电生理学稳定性和提高室颤阈值。心肌干细胞能促进Cx43的表达，其机制未明，需要进一步探索。

RAS系统在心肌梗死后的心电和结构性心室重构中扮演了重要的的角色^[8]。血管紧张素Ⅱ是RAS系统中关键的效应肽，在心肌梗死后心室重构尤其是在炎症、纤维化、细胞肥大和细胞外基质的异常减少中起重要作用^[18]。血管紧张素Ⅱ能调控Cx43的表达，血管紧张素Ⅱ能影响缝隙连接蛋白，促进折返激动、增加心肌梗死后心律失常的危险性^[19]。在此项研究中，随着血管紧张素Ⅱ水平的下降，左心室各区域的心肌组织中Cx43表达向上调节，说明血管紧张素Ⅱ可能参与了Cx43的表达调控。有研究表明，干细胞治疗能够影响血管紧张素Ⅱ水平，Hashizume等^[20]发现骨髓间充质干细胞移植能通过基质金属蛋白酶和炎症因子的过表达从而抑制血管紧张素Ⅱ介导的主动脉瘤的生长。该研究提示，心肌干细胞组心肌组织和血浆血管紧张素Ⅱ水平显著下调。血管紧张素Ⅱ是通过AT1R和AT2R来调控下游通路，其主要功能是通过AT1R完成。最近的研究显示AT2R在心肌损伤修复过程中亦扮演了重要的角色^[21]。血管紧张素受体拮抗剂联合骨髓间充质干细胞移植或者血管紧张素受体拮抗剂预处理的骨髓间充质干细胞能促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞系分化和改进心肌梗死大鼠的心功能^[22]。实验发现，在心肌干细胞治疗组中，AT1R表达明显向下调节，而AT2R明显向上调节，说明心肌干细胞干预通过ANGⅡ/AT1R信号通路调控了Cx43的表达。心肌梗死后持续的纤维化导致了传导的异质性、心电生理学异常和恶性室性心律失常的发生。心肌的纤维化与多种细胞因子有关，其中转化生长因子β1信号通路扮演了极其重要的角色^[23]。转化生长因子β1的抑制剂能明显减轻心肌梗死后的纤维化和室性心律失常的危险性。有大量的证据表明转化生长因子β1是血管紧张素Ⅱ的下游靶分子^[24]。局部心肌组织中产生的血管紧张素Ⅱ与转化生长因子β1的分泌紧密相关。心肌梗死后血管紧张素Ⅱ通过AT1R促进转化生长因子β1的表达，同时转化生长因子β1又与Cx43关系紧密。在心肌纤维化的过程中转化生长因子β1的高水平导致了Cx43的表达减少^[25]。研究结果显示：心肌干细胞治疗后转化生长因子β1在左心室各区域中的表达都明显下降，证明了转化生长因子β1作为ANG Ⅱ/AT1R的下游分子参与了Cx43表达的调控。SMAD是转化生长因子β1的下游分子通路中的成员^[26]。转化生长因子β1参与Cx43表达的调控有可能是通过SMAD来完成的。转化生长因子β1通过 SMAD2和SMAD3来实现其功能。SMAD7是转化生长因子β1通路中是一个SMAD2/3的负向调节分子。研究结果提示心肌干细胞治疗组左心室SMAD2/3明显向下调节而SMAD7明显向上调节，心肌干细胞可能通过ANGⅡ/AT1/TGFβ1/SMAD通路调控Cx43的表达。

心肌干细胞调控ANG Ⅱ/AT1R/TGF-β1/SMAD/CX43通路改进心电生理学稳定性和室颤阈值

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