骨髓基质干细胞对熏烟暴露老年大鼠髋部骨折后急性肺损伤的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.013

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (28): 4189-4195.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.013

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骨髓基质干细胞对熏烟暴露老年大鼠髋部骨折后急性肺损伤的保护作用

张桂通^1，2，冯杰扬²，刘佳²，张艳金²，相子民²，孟繁星²，孙天胜^1，2

1解放军医学院，北京市 100853
2解放军北京军区总医院，北京市 100700

修回日期:2016-05-19 出版日期:2016-07-01 发布日期:2016-07-01
通讯作者: 孙天胜，博士，主任医师，教授，解放军医学院，北京市 100853；解放军北京军区总医院，北京市 100700
作者简介:张桂通，男，1989年生，河北省沧州市人，汉族，解放军医学院在读硕士，医师，主要从事脊柱脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国际科技合作项目(2010DFA31250)；创伤后炎性反应与全身病发症的关系及预防策略研究

Protective effect of bone marrow stromal stem cells against acute lung injury after hip fracture in aged rats with chronic obstructive pulmonary disease

Zhang Gui-tong^{1, 2}, Feng Jie-yang², Liu Jia², Zhang Yan-jin², Xiang Zi-min², Meng Fan-xing²,Sun Tian-sheng^{1, 2}

1Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
2Beijing Army General Hospital, Beijing 100700, China

Revised:2016-05-19 Online:2016-07-01 Published:2016-07-01
Contact: Sun Tian-sheng, M.D., Chief physician, Professor, Beijing Army General Hospital, Beijing 100700, China
About author:Zhang Gui-tong, Studying for master’s degree, Physician, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
the International Science and Technology Cooperation Project, No. 2010DFA31250

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
急性肺损伤：是各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。
骨髓基质干细胞：通过众多实验研究发现其具有来源广泛、易分离、扩增迅速、多向分化、适合自体移植等特点，临床中将是被广泛运用于骨修复的种子细胞。骨髓基质干细胞具有自身免疫、肿瘤监控等免疫调节特性，可运用于全身炎症反应综合征、脓毒血症的治疗。

摘要
背景：老年慢性阻塞性肺疾病患者髋部骨折术后死亡率明显高于单纯髋部骨折患者。近年来，这一问题受到越来越多的关注，但是由于机制不明，目前临床对于此类患者尚无有效的干预手段。
目的：观察骨髓基质干细胞对老年慢性阻塞性肺疾病大鼠髋部骨折后急性期肺部炎症水平的影响。
方法：12月龄雄性SD大鼠30只，暴露香烟箱4个月后，按随机数字表随机分为3组：熏烟组，熏烟+ 髋部骨折+生理盐水组，熏烟+髋部骨折+骨髓基质干细胞组，后2组制备髋部骨折模型。骨折后24 h，3组大鼠取相同肺下叶组织和外周血，进行病理切片与炎症指标分析。
结果与结论：①老年慢性阻塞性肺疾病大鼠闭合性髋部骨折后，肺组织炎细胞浸润、黏液分泌、气管腔狭窄或闭塞；②骨折后肺组织与血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素10水平均有所增高；③静脉注射骨髓基质干细胞后，肺组织病理改变较生理盐水组减轻，促炎因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平低于生理盐水组，抗炎因子白细胞介素10水平高于生理盐水组，差异有显著性意义(P < 0.05)，血浆中炎症因子水平变化与肺组织相似；④结果表明，长期暴露香烟箱中的老年大鼠肺组织病理学有所改变，骨髓基质干细胞能缓解老年慢性阻塞性肺疾病大鼠髋部骨折后的急性肺损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4053-7297(孙天胜)

关键词: 干细胞, 移植, 慢性阻塞性肺疾病, 骨髓间充质干细胞, 髋部骨折, 炎症反应, 急性肺损伤, 白细胞介素 6, 肿瘤坏死因子 α, 白细胞介素10

Abstract:

BACKGROUND: The elderly hip fracture patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) have a higher postoperative mortality than those only with hip fractures. In recent years, it has become an issue of concerns. Because the mechanism is unknown, however, there are no effective clinical interventions for these patients.
OBJECTIVE: To observe the effect of bone marrow stromal stem cells (BMSCs) on the level of pulmonary inflammation in aged rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) after hip fractures.
METHODS: Thirty male Sprague-Dawley rats, 12 months old, were exposed to smoking for 4 months and randomized into three groups, smoking, smoking+hip fracture+normal saline, smoking+hip fracture+ BMSCs groups. Animal models of hip fracture were made in the latter two groups. Twenty-four hours after hip fracture, the lower lobe and peripheral blood samples were taken from all rats in the three groups, to evaluate the pathological changes of lung tissue and detect levels of inflammatory factors in the lung tissue and peripheral blood.
RESULTS AND CONCLUSION: After closed hip fracture, aged COPD rats exhibited inflammatory cell infiltration, mucus secretion, airway stenosis or occlusion; the levels of interleukin-6, tumor necrosis factor-α and interleukin-10 in the lung tissue and peripheral blood were increased. After intravenous injection of BMSCs, the pathological changes of the lung tissue were reduced, and the levels of pro-inflammatory factors, tumor necrosis factor-α and interleukin-6, decreased, but the level of anti-inflammatory factor interleukin-10 further increased, which were significantly different from those in the normal saline group (P < 0.05). These findings indicate that BMSCs can relieve acute lung injury in aged COPD rats with hip fractures．

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Pulmonary Disease, Chronic Obstructive, Hip Fractures, Acute Lung Injury, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张桂通，冯杰扬，刘佳，张艳金，相子民，孟繁星，孙天胜. 骨髓基质干细胞对熏烟暴露老年大鼠髋部骨折后急性肺损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4189-4195.

Zhang Gui-tong, Feng Jie-yang, Liu Jia, Zhang Yan-jin, Xiang Zi-min, Meng Fan-xing,Sun Tian-sheng. Protective effect of bone marrow stromal stem cells against acute lung injury after hip fracture in aged rats with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4189-4195.

图/表（结果） 1

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引言

随着全球人口的老龄化，髋部骨折患者的数量在逐年增加^[1-3]，且髋部骨折后的死亡率很高，既往有报道骨折后6-12个月的死亡率可高达20%-25%^[4]。研究表明，髋部骨折合并症会显著提高患者围手术期及术后1年的死亡率，其中以慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)最为常见^[5-6]。肺脏是体内重要的炎性因子产生器官，肺外器官损伤通过肺循环使炎性细胞激活释放炎性因子，进而使肺内的炎症细胞被激活，引起炎性因子的级联放大效应和瀑布式释放，此外炎性因子可以刺激免疫细胞增殖、活化，调节免疫细胞功能和免疫应答，进而造成免疫损伤。肺损伤和免疫损伤最终导致了患者的高死亡率^[7]。伴有慢性阻塞性肺疾病的髋部骨折患者基础肺功能减退，极易发生急性期肺部感染等并发症^[8]。资料显示，老年慢性阻塞性肺疾病患者髋部骨折术后死亡率是单纯髋部骨折患者的1.5倍^[9]。近年来，这一问题受到越来越多的关注，但是由于机制不明，目前临床上对于此类患者尚无有效的干预手段。

髋部骨折容易发生在老年群体当中，并且是最为严重的后果，髋部骨折患者中≥ 65岁的患者占87%- 96%，增加了髋部骨折患者的死亡率^[10-11]。老年髋部骨折患者的总体死亡率接近5%^[12]，其中急性肺损伤是老年髋部骨折患者最严重、最致命的并发症^[13]，课题组既往的动物实验和临床研究发现，炎症反应在老年慢性阻塞性肺疾病患者髋部骨折后的急性肺损伤中扮演了重要角色^[14]。骨髓基质干细胞作为一种安全有效的炎症调节与免疫调节手段已经广受关注，并在部分炎症性疾病中取得了较好的疗效^[15-16]。已有资料表明骨髓基质干细胞具有调节移植耐受、自身免疫、肿瘤监控等免疫调节特性^[17-22]，并且骨髓基质干细胞可以归巢于受损伤的组织，在不同损伤模型中促进组织再生^[23-26]。骨髓基质干细胞能否改善老年慢性阻塞性肺疾病患者髋部骨折后的急性肺损伤，尚未有文献报道。实验通过相应的动物模型对其疗效进行了初步探索。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3至11月在陆军总医院(原解放军北京军区总医院)创伤骨科研究中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 12月龄健康雌性SD大鼠30只，平均体质量600-750 g，2月龄Wistar大鼠6只，平均体质量80-100 g，均由北京海旺动物实验动物养殖有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2009-017，自由取水、进食，适应性饲养1周。

据实验室以往研究，拟建立老年慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。按随机数字表将30只SD大鼠随机分为3组(n=10)：熏烟组，熏烟+髋部骨折+生理盐水组，熏烟+髋部骨折+骨髓基质干细胞组。

1.3.2 试剂和仪器 DMEM-F12(Gibco，美国)，Percoll液(Amershma，瑞典)，CO₂孵箱、离心机(Sheldon Manufacturting Inc.，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓基质干细胞的体外分离培养与鉴定 2月龄Wistar大鼠6只，按照Sekiya等^[27]的贴壁培养筛选法获得骨髓基质干细胞。按3 mL/kg给予10%水合氯醛麻醉，备皮，取股骨、胫骨，清除残留的肌肉，浸入含有0.01 mol/L PBS的培养皿15 min，剪开长骨，保留干骺端，抽取无血清的DMEM-F12冲洗髓腔，至透亮，筛网过滤掉凝血块，于15 mL离心管中加入密度为1 073 g/mL的大鼠淋巴细胞分离液5 mL，将骨髓悬液滴加到Percoll液面上(1︰1配比)，3 000 r/min离心15 min，离心管内液体分为3层，取第2层浑浊层，用含胎牛血清的DMEM-F12培养基洗涤，1 500 r/min离心5 min，重复2次，用含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM-F12培养基重悬细胞，计数后，以2×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于25 cm²透气培养瓶中，置入37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内培养，2 d后换液，弃去上清和无效细胞，1周后观察到细胞铺满培养瓶底，吸去上清，加0.25%胰蛋白酶液1 mL，消化5-10 min，观察到大多数细胞团缩或漂浮后，加体积分数为100%胎牛血清数滴，混匀，抑制胰蛋白酶活性，使细胞完全脱落，形成细胞悬液，吸入离心管，用不含胎牛血清的DMEM-F12洗涤培养瓶，1 500 r/min离心5 min，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12重悬细胞，细胞每隔4 d换液1次，将近长满时，按照1︰3的比例传代扩增。

通过多次传代对细胞进行纯化。在倒置显微镜下每日观察骨髓基质干细胞的形态学特征。采用细胞免疫荧光对骨髓基质干细胞进行鉴定，流式细胞仪检测细胞表面标志。

1.4.2 模型制备及干预 ①将大鼠暴露在80 cm× 50 cm×60 cm的容积为240 L的自制三层熏箱，熏箱底层箱壁上垂直插入北京卷烟厂产大前门香烟，烟雾由密布 1 cm×1 cm孔道从下向上至顶部2 cm×2 cm通风口排除，将大鼠置于熏箱上层，每层10只。熏箱浓度控制在7%左右，观察1支烟大概能产生500 mL烟雾，每次需插入香烟10支，每次持续0.5 h，上下午各1次，共持续4个月诱导模拟建立老年慢性阻塞性肺疾病大鼠模型；②参照改良Einhorn动物髋部骨折造模法^[28]：除熏烟组外，其余20只大鼠行右腹腔内注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，取俯卧位，置于打击器上，在C型臂透视监护下，用克氏针标记出大鼠右侧股骨大转子的位点，将大鼠的右后肢拉直并与身体平行，大腿紧压贴在打击器支架的木板上，取打击器钝骨刀45°斜行紧贴转子间放置，C臂透视位置佳，砝码提高到25 cm后使其自由下落，砸伤后行体格检查，触及到骨擦感和骨擦音，后期观察可有异常活动；③熏烟+髋部骨折+生理盐水组大鼠骨折后立即经尾静脉注射 2 mL生理盐水，熏烟+髋部骨折+骨髓基质干细胞组大鼠骨折后立即经尾静脉注射骨髓基质干细胞(2.5×10⁶/只)。

1.4.3 酶联免疫吸附实验(ELISA) 骨折后24 h，3组分别随机抽取5只大鼠，取右肺下叶组织，称质量100 mg，置于干燥玻璃匀浆器内，加入0.5 mL生理盐水，匀浆后，置于4 ℃(12 000 r/min)离心10 min，留取上清液。另采集相同大鼠的血样品，4 ℃(3 000 r/min)离心15 min，留取血清。采用ELISA法检测肺组织和血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6及白细胞介素10水平，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.4.4 组织学检测 骨折后24 h，3组分别取5只大鼠，使用生理盐水和40 g/L多聚甲醛经心脏灌流后，取右下肺叶，浸泡入多聚甲醛液固定48 h，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5 μm，常规苏木精-伊红染色后在光镜下观察组织形态学变化，并进行肺组织损伤评分，其标准为：①肺间质水肿；②肺泡水肿；③炎症细胞的浸润；④肺泡出血；⑤透明膜的形成；⑥肺不张。上述6项，按无、轻、中、重、特重5个等级，分别记为0，1，2，3，4分，每张切片于高倍镜下取10个视野，进行肺病理损伤评分。

1.5 主要观察指标 ①肺组织及血浆中炎症因子水平变化；②肺组织病理切片形态学改变及评分。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行处理，计量资料以x(_)±s表示，炎症因子水平及肺组织损伤评分的组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着中国人口的老龄化，髋部骨折的发生率在逐年提高^[1^，^29]。有队列研究发现髋部骨折合并有慢性阻塞性肺疾病患者的死亡率比单纯髋部骨折患者高60%- 70%^[9]，但是造成高死亡率的原因尚不明确，也缺乏有效的治疗方法^[30]。鉴于上述原因，课题组通过建立香烟暴露合并髋部骨折的老年大鼠模型，模拟临床观察，对其高死亡率的机制进行探讨，并探索有效的干预手段，为临床此类患者的治疗提供有效的数据支持^[14]。

课题组前期实验证实，髋部骨折后慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部发生剧烈的炎症反应，主要表现为大量炎症细胞浸润及各种炎症因子水平大幅升高，而导致肺部的病理损害在原有的基础上进一步加重^[13-14^，^31]。

目前，大部分学者认为造成创伤后急性肺损伤一个主要原因是伴发全身剧烈的炎症反应，进而导致外周循环中炎症细胞流向肺部浸润，与此同时肺组织内部的巨噬细胞也剧烈激活^[32-34]。老年慢性阻塞性肺疾病大鼠髋部骨折后，在原有病变的基础上，出现大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润与聚集，管腔分泌物明显增多。经尾静脉注射骨髓基质干细胞，肺部炎症细胞浸润少，分泌物减少，提示骨髓基质干细胞可有效缓解髋部骨折诱发的全身炎症反应对肺部组织的进一步损害。

此外，在骨折后24 h对各组动物肺组织及外周血清中促炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和抑炎因子白细胞介素10的水平进行了检测，发现3种因子水平均有所升高，与实验室之前的研究结果相一致。浸润的中性粒细胞及局部激活的巨噬细胞共同释放各种类型炎症递质，导致肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10水平在肺组织内显著升高^[31^，^35-39]。研究中发现采用尾静脉注射骨髓基质干细胞可以显著降低上述2种促炎因子水平，而进一步提高白细胞介素10水平，提示骨髓基质干细胞在炎症水平较高时可以发挥明显的抑制作用，这与以往学者在其他炎症类疾病中发现的骨髓基质干细胞炎症调节特性相一致^[40-48]。

综上所述，实验证实了髋部骨折可以加重老年慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的损害，通过静脉途径给予骨髓基质干细胞可以在骨折后的急性期有效减轻模型大鼠肺部的炎症水平及由此导致的急性肺损伤，从而为其在临床应用提供了有效的实验数据支持。

骨髓基质干细胞对熏烟暴露老年大鼠髋部骨折后急性肺损伤的保护作用

Protective effect of bone marrow stromal stem cells against acute lung injury after hip fracture in aged rats with chronic obstructive pulmonary disease

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