碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植修复急性肾损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
碱性成纤维细胞生长因子：在人体各个组织中广泛存在。目前，已公认碱性成纤维细胞生长因子是人体内重要的创伤愈合因子之一，可调节多种组织的创伤修复过程，促进细胞增殖和分化。
结缔组织生长因子：是即刻早期基因CCN家族成员，在人类多种组织器官中广泛表达。在机体内几乎全部类型的成纤维细胞中诱导结缔组织生长因子表达的主要因子为转化生长因子β。转化生长因子β可通过多种信号途径诱导结缔组织生长因子表达，主要有4种途径，其中最重要的是Smad介导的转化生长因子β1途径。

摘要
背景：研究表明，碱性成纤维细胞生长因子对源于中胚层和神经外胚层的大部分细胞均有促进生长、增殖、分化及功能表达的作用。
目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植对急性肾损伤大鼠肾功能的影响。
方法：依据腺病毒载体将碱性成纤维细胞生长因子基因导入骨髓间充质干细胞，采用RT-PCR法鉴定转染细胞中碱性成纤维细胞生长因子的表达。采用动脉夹夹闭双侧肾蒂法制作急性肾损伤大鼠模型，建模后随机分成3组(n=20)：阴性转染组经尾静脉注射未经转染的骨髓间充质干细胞悬液，碱性成纤维细胞生长因子基因转染组经尾静脉注射转染成功的骨髓间充质干细胞悬液，模型组经尾静脉注射DMEM培养液。移植后4周，检测血清肌酐及尿素氮水平，Western blot法检测肾组织中结缔组织生长因子、转化生长因子β1的表达，苏木精-伊红染色观察肾组织病理形态。
结果与结论：①碱性成纤维细胞生长因子基因成功表达于骨髓间充质干细胞中；②与模型组比较，阴性转染组大鼠血清肌酐及尿素氮水平明显降低，碱性成纤维细胞生长因子基因转染组血清肌酐及尿素氮水平进一步降低，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③与模型组比较，阴性转染组及碱性成纤维细胞生长因子基因转染组肾组织结缔组织生长因子及转化生长因子β1表达明显减弱(P < 0.05)，阴性转染组及碱性成纤维细胞生长因子基因转染组间差异无显著性意义(P > 0.05)；④阴性转染组肾组织坏死、炎性反应减轻，碱性成纤维细胞生长因子转染组肾小管轮廓恢复正常，未出现明显坏死细胞；⑤结果表明，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对急性肾损伤大鼠肾脏的修复作用更明显。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-003-2070-4497(崔利德)

关键词: 干细胞, 移植, 碱性成纤维细胞生长因子, 骨髓间充质干细胞, 基因修饰, 大鼠, 急性肾损伤, 肾功能

Abstract:

BACKGROUND: It has been confirmed that basic fibroblast growth factor (bFGF) can promote the growth, proliferation, differentiation and functional expression of most cells derived from neuroderm and mesoderm.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bFGF-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rats with acute kidney injury.
METHODS: bFGF genes were transfected into bone marrow mesenchymal stem cells via an adenovirus vector, and then expression of bFGF in transfected cells was identified using RT-PCR technology. Rat models of acute kidney injury were prepared by clipping bilateral renal pedicles, and then randomized into three groups (n=20): rats were given injection of bone marrow mesenchymal stem cell suspensions via tail vein as negative transfected group, those given injection of bFGF-transfected bone marrow mesenchymal stem cell suspensions via tail vein as bFGF-transfected group, and the others given injection of DMEM via tail vein as model group. Four weeks later, levels of serum creatinine and urea nitrogen were detected, expressions of connective tissue growth factor and growth factor in renal tissues were detected by Western blot assay, and morphology of renal tissues was observed using hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: bFGF genes were successfully transfected into bone marrow mesenchymal stem cells. Compared with the model group, the levels of serum creatinine and urea nitrogen were significantly reduced in bFGF-transfected and negative transfected groups, especially in the bFGF-transfected group (P < 0.05), while expressions of connective tissue growth factor and transforming growth factor in renal tissues in bFGF-transfected and negative transfected groups were significantly weakened in these two groups (P < 0.05), but there were no significant differences between the bFGF-transfected group and negative transfected group (P > 0.05). Besides, renal tissues necrosis and inflammatory reactions were mitigated in the negative transfected group; renal tubules with normal outlines and no overt necrotic cells could be found in the bFGF-transfected group. These findings show that bFGF-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation plays a better role in acute kidney injury repair in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Fibroblast Growth Factor 2, Kidney Diseases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

崔利德，李铁民. 碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植修复急性肾损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4169-4175.

Cui Li-de, Li Tie-min. Basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for acute kidney injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4169-4175.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞形态 传代后细胞生长迅速， 4 d后基本长满瓶底，形态似长梭形，随着集落数目的不断增多，第1，2，3代细胞增殖活跃，绝大多数细胞单层贴壁生长，达85%以上融合时，显微镜下可见细胞分布均匀，胞核及核仁清晰可见，细胞形态基本一致，呈漩涡状分布，第3代骨髓间充质干细胞增殖速度明显加快，细胞生长旺盛，见图1。

2.2 RT-PCR检测碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达 腺病毒载体介导的碱性成纤维细胞生长因子基因转染48 h后，对照组和阴性转染组未出现相应大小的目的条带表达，而碱性成纤维细胞生长因子转染组出现相应大小的目的条带，提示碱性成纤维细胞生长因子基因已稳定整合入骨髓间充质干细胞，见图2。

2.3 各组大鼠血清肌酐及尿素氮水平 移植后4周，与模型组比较，阴性转染组大鼠血清肌酐及尿素氮水平明显降低，碱性成纤维细胞生长因子基因转染组血清肌酐及尿素氮水平进一步降低，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图3。

2.4 Western blot检测肾组织中结缔组织生长因子及转化生长因子β1的表达 移植后4周，与模型组比较，阴性转染组及碱性成纤维细胞生长因子基因转染组肾组织结缔组织生长因子及转化生长因子β1表达明显减弱(P < 0.05)，阴性转染组及碱性成纤维细胞生长因子基因转染组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5 苏木精-伊红染色观察各组大鼠肾组织病理损伤情况 移植后4周，模型组肾小管上皮细胞出现核溶解、碎裂，肾小球增生、肥大，毛细血管部分塌陷，球囊粘连，间质炎性浸润，可见萎缩、塌陷的肾小管(图5A)；阴性转染组核溶解、碎裂等细胞坏死现象得到缓解，肾小球增生、间质炎性反应明显减轻(图5B)；碱性成纤维细胞生长因子转染组可看到轮廓清晰的肾小管及较为完整的基底膜，肾组织未见明显的细胞坏死(图5C)。

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引言

急性肾损伤多为急性肾小管损伤，由于其会导致多种并发症，且高死亡率，已公认为临床上的重大疾病之一。所谓急性肾小管损伤，是由于体内病变产生的毒素侵蚀肾小管细胞，致其细胞凋亡、坏死^[1-2]，因此肾小管细胞的修复和再生对急性肾损伤的治疗尤为重要。骨髓间充质干细胞具有低免疫原性、易于取材、体外可定向分化为功能性肾细胞等优势^[3-4]，是治疗急性肾损伤的理想种子细胞之一。骨髓间充质干细胞分泌的多种因子，如血管内皮细胞生长因子等对体内组织、血管的再生有重大意义，这些因子可以调控受损部位的细胞环境，进而修复受损细胞。然而，骨髓间充质干细胞移植的低迁移率和低生存率等因素限制其功能的进一步发挥。为克服上述缺点，采用多种方法对骨髓间充质干细胞进行体外修饰或处理以期提高移植疗效。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可修复体内受损细胞和组织，刺激血管、成肌细胞、神经细胞等生成，促进成纤维细胞和骨髓间充质干细胞的增殖及刺激骨髓间充质干细胞分化^[5]。因此，碱性成纤维细胞生长因子修饰骨髓间充质干细胞治疗急性肾衰竭将可能成为有效的治疗手段。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)都是参与肾间质纤维化的重要因子，两者相互影响相互调节，结缔组织生长因子可诱导转化生长因子β1促纤维生成^[6]，转化生长因子β1又增加结缔组织生长因子的表达^[7]。实验应用碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞移植治疗急性肾损伤大鼠，检测碱性成纤维细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及移植后对急性肾损伤大鼠肾功能的影响。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年10月在山东医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性成年SD大鼠60只，体质量约为300 g，由山东医科大学动物实验室提供，随机分为3组：模型组、阴性转染组(移植未转染的骨髓间充质干细胞)、碱性成纤维细胞生长因子基因转染组(移植碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞)，每组20只。饲养环境：23-27 ℃，湿度为50%-70%，给予颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，让其自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。

1.3.2 主要试剂、仪器 冻存骨髓间充质干细胞购于赛默飞公司；L-DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素(GIBCO公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗人CTGF抗体，兔抗人TGF-β1抗体和辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体(CYTOLAB公司)；细胞培养皿、细胞培养瓶(上海百研生物科技有限公司)；二氧化碳培养箱(上海人和科技有限公司)；荧光显微镜、倒置显微镜及普通显微镜(上海仪器厂)；低温高速离心机(上海艾测生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养 将100 mL胎牛血清和10 mL混合抗生素(青霉素、链霉素)加入1 000 mL L-DMEM培养基中，常温下混合均匀，放置于无菌操作台，并1︰10倍稀释，备用。小心取出已冻存的骨髓间充质干细胞(防止冷冻管爆裂)，放入37 ℃水浴，不间歇、轻轻摇动冷冻管1 min，迫使其充分融化，融解后放置于无菌操作台。在无菌操作台中，吸取解冻完成的细胞悬浮液，加至新配置的无菌培养基中，轻轻混匀，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养箱中^[8]，每 2 d更换培养液，除去未贴壁细胞，细胞融合85%时，去除培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，用预先配置3 g/L胰蛋白酶消化3 min，用等体积的含体积分数为10%胎牛血清的低糖培养基终止消化，吹打，制成细胞悬液，离心(1 500 r/min，3 min)，移去上清液，新鲜培养基重悬细胞并调节浓度，接种至培养瓶，37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养，传代至第3代用于以下实验^[9]。

1.4.2 Ad-bFGF转染及RT-PCR检测 将50 μL第3代骨髓间充质干细胞悬液加入细胞培养孔中，然后加入DMEM培养基和Ad-bFGF液使其终质量浓度达10 mg/L，常温下混合均匀，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养24 h，换新鲜培养基，继续培养48 h^[10]。按Gbeo公司Trizol Total Isolation Reagent 说明书提取转染完成的骨髓间充质干细胞的总RNA，加入正向引物、反向引物、DEPC水，紫外分光光度仪测定RNA浓度。依据TaKaRa反转录试剂盒说明书RT-PCR的方法，以总RNA中的mRNA为模板，利用反转录酶反转录成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。碱性成纤维细胞生长因子基因的上游引物为：5’-GCG ACC CTC ACA TCA AGC TA-3’，下游引物为：5’-CTT TCT GCC CAG GTC CTG TT-3’，预期片段为198 bp。β-actin的上游引物为：5’-TGA CTG-3’，下游引物为：5’-AGG GGC CGG ACT CGT CAT AC-3’，产物大小305 bp。反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸1 min，进行40个循环^[11]。将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶自动成像及分析系统进行电泳条带吸光度分析。

1.4.3 急性肾损伤模型建立及骨髓间充质干细胞移植 实验大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿大鼠腹正中位做2.0 cm切口，逐层分离皮肤、腹膜，用微型无损伤动脉夹快速准确地阻断大鼠双侧肾蒂，观察到肾脏变黑紫色后，分层缝合腹腔^[12]，手术过程中用肾上腺素及庆大霉素盐水清洗伤口，术后4周内每日人工挤尿3次，清洁饲养动物^[13-14]。手术后24 h，阴性转染组大鼠经尾静脉注射未经转染的骨髓间充质干细胞悬液10 μL，碱性成纤维细胞生长因子基因转染组大鼠经尾静脉注射转染成功的骨髓间充质干细胞悬液10 μL，模型组大鼠经尾静脉注射10 μL DMEM培养液^[15]。

1.4.4 SD大鼠血清肌酐及尿素氮水平测定 移植后4周，随机选取SD大鼠，经10%水合氯醛麻醉后，处死，快速从腹腔主动脉抽血5 mL，2 000 r/min离心20 min，取血清置于离心管中，-80 ℃冷冻保存，备用。按照肌酐试剂盒(苦味酸不除蛋白法)和尿素氮试剂盒(OPA法)说明书操作检测血清肌酐和尿素氮水平^[16-17]。

1.4.5 Western blot法检测肾组织中结缔组织生长因子及转化生长因子β1的表达 移植后4周，取大鼠肾脏10 mg，加入100 μL RIPA细胞裂解液(预先冰浴 10 min)，碎冰上研磨1 min，10 000 r/min离心5 min，用移液枪吸取上清液，BCA法测定细胞中的蛋白含量，拟合蛋白标准曲线，计算其上样量^[18]，进行10% SDS-PAGE电泳，15 mA电泳3 h后，蛋白条带电转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉(pH7.6的TBS配置)封闭 3 h，加入一抗(兔抗人CTGF抗体和兔抗人TGF-β1抗体，用5%脱脂奶粉稀释2 500倍)，4 ℃恒温孵育过夜，取PVDF膜，用TBS液冲洗多次，每次5 min，加入二抗(辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体，用5%脱脂奶粉稀释2 500倍)常温振荡孵育2 h，取出PVDF膜，用TBS液冲洗多次，每次5 min，滤纸吸干PVDF膜上的液体，按照ECL说明书的操作步骤，对PVDF膜进行荧光染色，置于暗室10 min，曝光、显影、定影，通过Alpha2200图像分析仪对各组条带扫描拍照，并对其吸光度值进行半定量分析^[19]。

1.4.6 苏木精-伊红染色观察大鼠肾组织结构 移植后4周，取大鼠左肾脏组织，冷冻切片机横向切片，厚度为8 μm，将切片贴于明胶预包被的盖玻片，低温-20 ℃保存^[20]，进行细胞苏木精-伊红染色，具体方法：将无水乙醇浸入盖破片30 min，用PBS漂洗3次，浸入苏木精染液15 min，蒸馏水浸洗多次，此时标本为深蓝色，浸入1%HCl 1 s，分色，脱去多余蓝浮色，标本此时为淡紫红色，细胞质为无色或灰蓝色，蒸馏水浸洗15 min，浸入淡氨水(2滴氨水加入到400 mL蒸馏水中)，10 min后出现淡蓝色，蒸馏水浸洗15 min，浸入伊红染液染色 15 min，蒸馏水冲洗，用体积分数为95%乙醇脱水2次，无水乙醇脱水3次，滴入二甲苯2次，每次1 min，最终用中性树胶封固^[21]，显微镜400倍镜下观察肾组织病理形态。

1.5 主要观察指标 ①血清肌酐及尿素氮水平；②肾组织中结缔组织生长因子及转化生长因子β1的表达；③肾组织病理形态。

1.6 统计学分析 所有计量数据以x(_)±s表示，成组设计的均数比较采用t 检验方法，多组间的数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，应用SPSS 11.0软件进行数据分析。

讨论

碱性成纤维细胞生长因子是多聚肽的成纤维细胞生长因子家族的成员^[21]，活性较高，可以广泛地刺激细胞有丝分裂和毛细血管增殖^[22]，同时也是机体重要的创伤愈合因子，对机体创伤修复起到重要作用^[23]。在低氧、缺血或各种组织损伤的情况下，碱性成纤维细胞生长因子基因被迅速刺激表达^[24]，促进细胞分裂^[25]、抑制终末期的细胞分化^[26]，恢复凋亡细胞活力等^[27]。骨髓间充质干细胞为基因和组织工程治疗提供了新的前景。体外骨髓间充质干细胞培养，脱离了机体内多组织的协同作用，变为单一的细胞环境，且细胞生存的pH值、温湿度等也与体内环境不同，这些都可能对细胞分化、增殖产生深远影响^[28-29]。

碱性成纤维细胞生长因子基因可调控骨髓间充质干细胞的增殖，减少骨髓间充质干细胞传代扩增的时间^[30]。实验采用RT-PCR法检测碱性成纤维细胞生长因子基因在体外培养的骨髓间充质干细胞中得到了很好的表达，这为骨髓间充质干细胞的基因治疗提供新的思路。已有研究表明，体外培养的骨髓间充质干细胞对急性肾损伤起到一定的修复功能^[31-35]，改善肾小球、肾小管、肾间质的结构。Togel等^[31]研究证实，同源或异源的骨髓间充质干细胞都对急性肾损伤有修复功能，Morigin等^[33]发现骨髓间充质干细胞可以在治疗急性肾损伤上起到重要作用。大量实验数据显示，骨髓间充质干细胞是通过旁分泌及内分泌来作用于受损肾单位。Tsuda等^[35]研究发现同种异体胎膜间质干细胞通过旁分泌作用修复肾脏，其机制可能为间充质干细胞调节肾小球系膜基质的积聚，肾小球炎性递质的表达等^[36-37]。也有研究者证实了间充质干细胞虽然在肾单位中存在非常少，但是可以通过对炎性递质和趋化递质进行调节^[38]，降低血清中肌酐水平、减弱肾小球病理损伤，对肾损伤起到一定的治疗作用^[39-40]。

实验结果显示碱性成纤维细胞生长因子转染组血清肌酐及尿素氮水平最低，阴性转染组次之；碱性成纤维细胞生长因子转染组结缔组织生长因子及转化生长因子β1表达较模型组明显减弱；碱性成纤维细胞生长因子转染组肾小管轮廓恢复正常，未出现明显坏死细胞，结果表明与单纯骨髓间充质干细胞移植比较，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对急性肾损伤大鼠肾脏的修复作用更明显。