骨髓间充质干细胞联合依达拉奉移植脑梗死大鼠血清炎性因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
依达拉奉：是一种自由基清除剂。大鼠在缺血/缺血再灌注后静脉给予依达拉奉，可阻止脑水肿和脑梗死的进展，并缓解所伴随的神经症状，抑制迟发性神经元死亡。机制研究提示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。
脑梗死：又称缺血性卒中，系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。

摘要
背景：抑制血清炎性因子凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物表达是治疗脑梗死的潜在靶点之一。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠血清炎性因子的表达变化。
方法：60只SD大鼠采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑梗死模型后，随机等分为模型组、骨髓间充质干细胞移植组和联合组。模型组连续 5 d尾静脉注射PBS，骨髓间充质干细胞移植组经尾静脉注射 2.0×10⁹ L^-1骨髓间充质干细胞悬液1 mL，2次/d，连续 5 d。联合组静脉滴注依达拉奉30 mg+尾静脉注射 2.0×10⁹ L^-1骨髓间充质干细胞悬液1 mL(2次/d)，连续 5 d。
结果与结论：①与模型组相比，骨髓间充质干细胞移植组与联合组大鼠mNSS评分较低，血清凝血酶元激活因子的抑制因子1表达水平减少，脑梗死面积减少，脑组织中肿瘤坏死因子αmRNA的表达水平减少；②联合组大鼠上述指标变化差异比骨髓间充质干细胞移植组大；③结果提示骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉有助于促进脑梗死损伤神经功能的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4105-602X(孙晶晶)

关键词: 干细胞, 移植, 脑梗死, 骨髓间充质干细胞, 依达拉奉, 血清炎性因子, 凝血酶元激活因子的抑制因子1, 组织纤维溶酶原激活物

Abstract:

BACKGROUND: To inhibit the expressions of prothrombin activator inhibitor 1 and tissue plasminogen activator is one potential target for the treatment of cerebral infarction.
OBJECTIVE: To investigate the expressions of serum inflammatory cytokines in rats with cerebral infarction undergoing bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were enrolled to prepare models of focal cerebral infarction by middle cerebral artery occlusion, and were randomly divided into four groups. Rats were given intravenous injection of PBS via tail veins for 5 consecutive days as model group, rats were subjected to intravenous injection of 2.0×10⁹ /L bone marrow mesenchymal stem cell suspension (1 mL) via tail veins, twice daily for 5 days as stem cell transplantation group, and those were given intravenous injection of 30 mg edaravone combined with intravenous injection of 2.0×10⁹/L bone marrow mesenchymal stem cell suspension (1 mL) via tail veins for 5 days, twice daily, as combined group.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, modified neurologic severity scores were lower, expressions of serum prothrombin activator inhibitor 1 and tumor necrosis factor-α mRNA in the brain decreased, and the infarct area reduced in the stem cell transplantation and combined groups. And the changed levels of above indicators in the combined group were significantly larger than those of the stem cell transplantation group. In conclusion, combination of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation with edaravone can promote neural function recovery after cerebral infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Infarction, Middle Cerebral Artery, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2015年8月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料 63只SPF级健康的SD大鼠，雌雄不限，鼠龄4.0-5.0周，体质量300-350 g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)20090028。大鼠实验期间自由饮水，饲养室温度18-28 ℃，相对湿度62%-80%。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养 取3只大鼠，采用颈椎脱臼处死，取大鼠四肢骨，充分暴露冲洗骨髓腔，收集冲洗液，吹打均匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入培养液，吹打至重新悬浮，取少量悬浮液接种到培养瓶中，培养1 d后更换新的培养液，每隔3或4 d换液一次。细胞融合至80%-90%时，可按1∶2比例进行传代。移植使用的细胞是第3或4代。

1.4.2 实验分组 将剩余60只SD大鼠采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑梗死模型，以腹腔注射5%水合氯醛将大鼠进行麻醉固定，首先依次分离并暴露大鼠右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，然后结扎并游离颈外动脉主干，用微血管夹夹闭颈总动脉及颈内动脉，用眼科剪在颈外动脉残端剪一小口，将直径0.23 mm、头端圆钝的日本鱼线经颈外动脉插入颈内动脉血管腔中，有阻力感时停止，即到大脑中动脉起始处；将线栓及颈外动脉残端一起结扎，缝合颈部切口。将大鼠放回笼中饲养观察。造模成功后随机分为3组：模型组、骨髓间充质干细胞移植组和联合组，每组20只。

1.4.3 干预 造模后当天进行干预。模型组尾静脉注射 2 mL PBS(武汉博士德生物工程有限公司)。骨髓间充质干细胞移植组经尾静脉注射2.0×10⁹ L^-¹骨髓间充质干细胞悬液1 mL，2次/d，连续5 d。联合组静脉滴注依达拉奉(武汉江民华泰医药化工有限公司)30 mg+尾静脉注射2.0×10⁹ L^-¹骨髓间充质干细胞悬液1 mL(2次/d)，连续5 d。

1.4.4 mNSS评分 移植后第1，3，7，14天进行mNSS评分。mNSS评分主要通过对大鼠运动、感觉、平衡、反射的评价来判断大鼠神经功能的缺损及恢复情况。神经功能共分为0-18分，分值不同代表神经功能的受损的严重程度不同，0分表示神经功能正常，没有受损，18分则表示神经功能严重缺失^[22]。

1.4.5 ELISA检测 采用ELISA法来检测血清炎性因子凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物的表达量。移植后第2周，大鼠尾静脉采血3.0-4.0 mL，静止放置30-35 min后，3 200 r/min离心5 min，取上清液，-80 ℃储存，ELISA法(上海酶联生物技术有限公司)检测凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物的表达水平。

1.4.6 TTC染色 移植后2周，大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，断头处死，取脑，生理盐水冲洗后置于-20 ℃冷冻10 min后，沿冠状面切片，切片厚度为2 mm，2%TTC溶液(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)染色约 10 min，红色为正常脑组织，苍白色为梗死脑组织，采用病理图像分析仪(徐州市技易软件科技有限公司)计算梗死面积。

1.4.7 半定量反转录PCR检测肿瘤坏死因子α mRNA的表达水平 移植后2周，采用改良的异硫氰酸胍一步法抽提大鼠脑组织中总RNA(华舜公司)，采用一步法RT-PCR检测脑组织中肿瘤坏死因子α mRNA表达(大连宝生物公司试剂盒)。肿瘤坏死因子α及β-actin序列由上海生工公司合成。肿瘤坏死因子α：正义链5’-GCCAAT GGC ATG GAT CTC AAA G-3’，反义链5’-CAG AGC AAT GAC TCC AAA GT-3’，扩增产物为357 bp。β-actin：正义链5’-GTG GGC CGC TCTAGG CAC CAA-3’，反义链5’-CTC TTT GAT GTCACG CAC GAT TTC-3’，扩增产物为540 bp。50 ℃ 30 min反转录反应，94 ℃ 2 min灭活反转录酶。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，72 ℃终末延伸10 min。将少量扩增产物置于1.8%琼脂糖凝胶中电泳。然后以目的基因与β-actin的灰度比值代表肿瘤坏死因子α的表达水平。

1.5 主要观察指标 大鼠mNSS评分、血清炎性因子表达水平、脑梗死体积以及脑组织中肿瘤坏死因子α mRNA的表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件包进行处理。所有实验数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

缺血性脑卒中是指脑组织缺血缺氧导致的变性坏死。炎症是脑梗死的重要病理表现，脑缺血可以激活强烈的炎症反应，释放大量的细胞因子、趋化因子、黏附分子及蛋白水解酶，从而加剧脑组织的损伤。这些细胞因子包括白细胞介素类及肿瘤坏死因子α等^[23-24]，因此抑制细胞因子的释放可以起到保护缺血性脑卒中后受损脑组织的作用^[25-26]。

骨髓间充质干细胞是一类具有高分化潜能及高度增殖能力的细胞^[27-31]。还可以促进缺血/再灌注损伤后大鼠脑组织生成，使大鼠神经功能得到明显改善，这为临床脑梗死的治疗开辟了新途径^[32-34]。Peng等^[35]指出骨髓间充质干细胞对脑梗死大鼠具有神经保护作用。骨髓间充质干细胞还可以通过分泌神经营养因子^[36-37]、生长因子、细胞因子等，减少神经元损伤，从而增强了脑细胞的神经修护作用，对脑梗死神经功能的恢复有促进的作用。Lee等^[6]对52例患者进行了5 年随访研究，结果显示自体干细胞移植对于卒中患者是安全的，该治疗可能会改善卒中患者的预后。依达拉奉近年来临床广发使用的一种新型的自由基清除剂，对缺血性脑卒中的治疗效果显著^[18-20^，^38-47]，尤其是缺血性脑卒中的急性期^[38^，^48-50]。依达拉奉治疗脑梗死的主要机制为：①延迟神经功能的损害与其可以清除自由基有关。②减轻脑细胞因缺血缺氧而导致的水肿，损伤，对脑组织起到很好的保护作用^[51]。③抑制因自由基导致的脑血管痉挛^[52]。

实验结果表明骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉干预能够恢复凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物表达，减小脑梗死面积，改善脑梗死后大鼠神经功能的恢复。