调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的miR-106a及其靶基因骨形态发生受体蛋白2

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.001

摘要/Abstract

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文题释义：
成骨细胞：是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。
人骨髓间充质干细胞：是一种成体干细胞，不但能向中胚层的各种细胞如骨、软骨等分化，还能向外胚层的神经细胞、内胚层的消化和内分泌细胞如肝细胞和胰岛样细胞分化。1999年，Pittenger等首先用单细胞培养的方法获取了人骨髓基质细胞集落，进一步将此来自一个克隆的细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

摘要
背景：正常生理条件下，人骨髓间充质干细胞的骨生成和脂肪生成维持平衡，成骨分化是骨骼发展的重要过程，骨骼形成需要成骨细胞的分化和成熟。
目的：探索miR-106及其靶基因骨形态发生受体蛋白2在成骨分化中的作用，为后续研究奠定基础。
方法：使用成骨诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，通过Western blot和碱性磷酸酶染色检测成骨分化标志物表达情况判断成骨分化进程。通过转染模拟剂过表达miR-106a，转染siRNA敲降骨形态发生受体蛋白2的表达，分别使用Real-time PCR和Western blot检测miR-106a和骨形态发生受体蛋白2表达情况。TargetScan软件预测和双荧光素酶报告实验验证miR-106a和骨形态发生受体蛋白2的相互作用。
结果与结论：在成骨分化过程中miR-106a表达下调，骨形态发生受体蛋白2表达上调。过表达miR-106a，结果发现碱性磷酸酶活性下降，成骨分化标志蛋白Runx2和OCN表达量下降，同时骨形态发生受体蛋白2表达下调。使用TargetScan预测骨形态发生受体蛋白2可能是miR-106a的靶基因，双荧光素酶报告实验验证了预测结果。敲降骨形态发生受体蛋白2的表达，成骨分化受到抑制。结果表明miR-106a通过靶向骨形态发生受体蛋白2从而调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7175-2213(顾夙)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨形态发生受体蛋白2, miR-106a, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 分子机制, 荧光素酶报告, 转染, 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Under normal physiological conditions, there is a homeostasis between the osteogenic and adipogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Osteogenic differentiation is an important process in the formation of skeleton in which differentiated and mature osteoblasts are indispensable.
OBJECTIVE: To explore the role of miR-106a and its target gene, bone morphogenetic protein receptor 2 (BMPR2) in the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells were induced to differentiate into osteoblasts by osteoblast-specific induction medium, and this process was detected by western blot and alkaline phosphatase staining. Overexpression of miR-106a was elicited by transfecting miR-106a mimics and the BMPR2 knockdown achieved by RNA interference. The expression levels of miR-106a and BMPR2 were detected by real-time PCR and western blot, respectively. The interaction of miR-106a and BMPR2 was verified by TargetScan software and dual luciferase report experiment assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of miR-106a was decreased whereas the expression of BMPR2 increased with the progress of osteogenesis differentiation. When miR-106a was overexpressed, alkaline phosphatase activity was declined and the expressions of runt-related transcription factor 2 and osteocalcin, markers of osteogenesis differentiation, both decreased. The expression of BMPR2 was decreased as well. BMPR2 was predicted to be the target gene of miR-106a by TargetScan software and this prediction proved by dual luciferase report experiments assay. Additionally, osteogenesis differentiation was inhibited by knocking down the expression of BMPR2. These results indicate that miR-106a regulates the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts by targeting BMPR2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: MicroRNAs, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

顾夙. 调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的miR-106a及其靶基因骨形态发生受体蛋白2[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4109-4116.

Gu Su. miR-106a regulates the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells by targeting bone morphogenetic protein receptor 2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4109-4116.

图/表（结果） 2

2.1 人骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞 Runx2和OCN是成骨分化的标志蛋白，在成骨分化过程中，碱性磷酸酶活性上升，Runx2和OCN表达上升^[27]。通过检测细胞Runx2和OCN蛋白的表达水平和碱性磷酸酶活性可以判断间充质干细胞成骨分化的进程。作者将人骨髓间充质干细胞使用成骨诱导培养基诱导分化，试剂盒检测碱性磷酸酶活性，western blot检测Runx2，OCN及骨形态发生受体蛋白2表达，real-time PCR检测分化前后miR-106a表达。结果表明，随着分化诱导时间的增加，碱性磷酸酶活性逐渐上升，成骨分化标志蛋白Runx2和OCN的表达也不断上升，说明在实验过程中人骨髓间充质干细胞被成功诱导为成骨细胞。随着成骨分化的进行，miR-106a表达逐渐下降，暗示miR-106a在成骨分化过程中有负调控作用。骨形态发生受体蛋白2表达逐渐升高，在第8天达到高峰，和miR-106a的变化趋势相反(图1)。这些结果暗示在骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中，miR-106a和骨形态发生受体蛋白2的表达可能存在负相关性。

2.2 miR-106a抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 为了探索miR-106a在成骨分化过程中的作用，作者将miR-106a模拟剂转染至骨髓间充质干细胞，检测转染miR-106a模拟剂对分化指标的影响。结果表明转染miR-106a模拟剂后，miR-106a表达量上升，碱性磷酸酶活性下降，成骨分化标志蛋白Runx2和OCN表达量下降(图2)，表明miR-106a模拟剂抑制了骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。

2.3 miR-106a靶向骨形态发生受体蛋白2抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 使用Target Scan软件在线查找miR-106a的靶基因，结果发现，骨形态发生受体蛋白2是miR-106a的潜在靶基因。图3A是Target Scan预测的骨形态发生受体蛋白2和miR-106a的绑定位点。为了检测miR-106a能否调控骨形态发生受体蛋白2表达，作者使用Western blot检测了转染miR-106a模拟剂后骨形态发生受体蛋白2蛋白表达情况。结果发现转染miR-106a模拟剂后，骨形态发生受体蛋白2蛋白表达下降(图3B)。使用荧光素酶报告系统，共转染miR-106a和骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR野生型或骨形态发生受体蛋白23’-UTR突变型，转染36 h后收集细胞测定荧光素酶活性。结果发现，和转染miR-106a阴性对照和骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR野生型的细胞相比，共转染miR-106a和骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR野生型的细胞荧光素酶活性显著下降，miR-106a模拟剂对骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR突变型荧光素酶活性没有抑制作用。这些结果表明miR-106a可以抑制骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR的转录活性，从而调控骨形态发生受体蛋白2的表达(图3)。
2.4 敲降骨形态发生受体蛋白2抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 为了研究骨形态发生受体蛋白2在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用，作者使用RNA干扰技术敲降骨形态发生受体蛋白2，诱导成骨分化并检测成骨分化相关指标。如图4A所示，转染骨形态发生受体蛋白2 siRNA的细胞骨形态发生受体蛋白2表达量下降了80%，干扰效果较好。敲降骨形态发生受体蛋白2表达和过表达miR-106a的结果类似，碱性磷酸酶活性下降(图4B)，成骨分化标志蛋白Runx2和OCN的表达下降(图4C)。这些结果表明敲降骨形态发生受体蛋白2表达，人骨髓间充质干细胞成骨分化受到抑制。

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引言

在正常生理状态下，脊椎动物的骨形成和骨吸收处于动态平衡，从而保持骨骼合适的质量和密度^[1]。成骨细胞和破骨细胞是负责骨形成和骨吸收的主要细胞。成骨细胞来源于未分化的间充质细胞，骨骼形成需要成骨细胞的分化和成熟^[2]。在成骨细胞发育的过程中需要多种分子的参与，如转化生长因子β、骨形态发生蛋白、Wnt和MAPK e(mitogen-activated protein kinase)等信号通路和转录因子的激活^[3]。Runx2(Runt-related transcription factor 2)和Osterix是参与骨骼形成的主要转录因子，可通过激活成骨分化标志基因从而促进成骨分化。

骨髓间充质干细胞存在于骨髓中，具有自我更新和分化的潜能^[4]，在临床治疗上有广泛的应用。在不同的转录因子调控下，间充质干细胞可以分化成多种细胞。如在过氧化物酶体增殖物激活受体γ调控下可分化为脂肪细胞；在肌细胞生成素调控下可分化为成肌细胞；在Runx2调控下可分化为成骨细胞^[5]。在正常生理条件下，人骨髓间充质干细胞的骨生成和脂肪生成维持平衡，通过一些必要的调控机制来维持骨骼稳态。在人的多种疾病中，骨髓间充质干细胞的成骨分化和成脂分化被打断。例如随着年龄的增长，更年期或者骨质疏松，骨髓中骨形成减少，脂肪生成增加^[6]。了解间充质干细胞分化调控机制可以更深入的了解骨骼发育和调控，为发展新的策略来预防和治疗骨骼疾病奠定基础，如治疗骨质疏松、骨硬化等。

成骨细胞的分化、增殖、代谢和凋亡受miRNA的调控^[7-8]。miRNA是长度为19-25 nt的内源性非编码小RNA分子，可以通过完全或不完全互补配对靶向目的基因mRNA的3’-非翻译区(untranslated regions，UTR)或开放阅读框，降解mRNA或抑制其翻译，从而调控mRNA的表达水平，抑制目的基因的功能^[9]。通过直接或者间接的方式，miRNA可以调控多种生理和病理过程^[10]，如细胞生长、凋亡、增殖、分化、癌症发展等^[11]。

在间充质干细胞分化为成骨细胞的过程中，有大量的差异表达miRNA被鉴定出来^[12-13]，这些miRNA可以靶向间充质干细胞成骨分化的重要转录因子和信号通路从而调控成骨分化过程^[14]。例如，miR-26a可以抑制成骨标志蛋白SMAD1，从而抑制人脂肪来源的间充质干细胞分化^[15]。过表达miR-196a可以调控同源盒基因8，从而加强成骨分化，抑制人脂肪来源的间充质干细胞增殖^[16]。miR-22可以保持人脂肪来源的间充质干细胞成骨分化和成脂分化的平衡，上调miR-22可以抑制组蛋白去乙酰化酶6蛋白表达从而促进成骨分化抑制成脂分化^[17]。因此，miRNA可能作为调控骨骼细胞功能和骨形成的重要药物作用靶标。

人miR-106a基因位于Xq26.2染色体，由23个核苷酸组成^[18]。miR-106a在肝癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤中上调表达^[19-22]，在滤泡性淋巴瘤和星形胶质瘤中下调表达^[23-24]。通过靶向不同的基因，miR-106a可以调控肿瘤细胞生长，增殖，迁移等^{[18, 20]}。目前关于miR-106a的研究主要集中在肿瘤领域，对于miR-106a在正常组织及干细胞中的功能研究较少。Gao等^[25]研究发现，在人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的过程中，miR-106a的表达下调。作者拟探索在成骨分化过程中miR-106a的作用，并使用软件预测其靶基因，通过双荧光素酶报告系统鉴定了它和靶基因的相互关系，并研究两者在成骨分化中的作用。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年6月在南阳市中心医院病理实验室完成。

1.3 对象 先天性脊柱侧弯男性患者，年龄17岁。试验获得患者及家属的知情同意，并经南阳市中心医院伦理委员会批准。

1.4 材料 293T细胞购自中科院上海细胞库。miR-106a模拟剂、骨形态发生受体蛋白2 siRNA以及含有骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR的目的片段由Gene Pharma公司合成。

1.5 方法

1.5.1 人骨髓间充质干细胞的分离和培养 从患者骨髓中穿刺多点抽取骨髓5 mL，置于枸橼酸锂抗凝管。加入等体积不含血清的α-MEM培养基(含1×10⁵ U/L青霉素和1×10⁵ U/L链霉素)，适当吹打使骨髓分散均匀。将骨髓悬液缓慢加到含等体积1.073×10⁵ g/L的Percoll淋巴细胞分离液，500×g离心30 min。吸取中间单个核细胞层，PBS洗2次，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬，反复吹打使细胞分散均匀，接种于培养瓶中。将细胞置于37 ℃，含体积分数5% CO₂的培养箱中培养，每3 d换一次培养基。当细胞长到80%-90%融合度时，用0.25%胰酶消化传代培养，用第4代细胞进行实验。

1.5.2 间充质干细胞成骨分化的诱导 骨髓间充质干细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板中，待细胞长至融合度为70%-80%时，加入成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μmol/L抗坏血酸的α-MEM培养基)，每3 d换一次成骨诱导培养基，成骨诱导培养16 d^[26]。分别在第0，4，8，12，16天收集细胞进行实验。

1.5.3 miRNA和siRNA转染 将合成的miR-106a模拟剂及阴性对照用lipofectamine 2000转染到未分化的骨髓间充质干细胞中，使其终浓度为200 nmol/L，整个转染过程使用无血清的Opti-MEM培养基。将细胞置于含体积分数5% CO₂的37 ℃培养箱中转染6 h，转染后换成成骨诱导培养基继续培养。骨形态发生受体蛋白2的siRNA转染过程和miRNA转染类似。

1.5.4 碱性磷酸酶活性测定 成骨诱导7 d后，细胞用PBS洗2次，收集细胞。使用哺乳动物蛋白抽提试剂盒裂解液(加入蛋白酶抑制剂cocktail)冰上裂解30 min，12 000×g离心5 min，收集上清，使用BCA法测定总蛋白浓度，使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性。通过蛋白浓度校正细胞碱性磷酸酶活性。

1.5.5 Real-time PCR检测miR-106a表达 使用miRNA抽提试剂盒提取细胞的miRNA，Nanodrop 2000测定RNA浓度，按照miRNA反转录试剂盒的说明书进行反转录反应。以U6为内参，Real-time PCR检测miR-106a在成骨分化过程中的表达情况。

1.5.6 Western blot检测成骨分化标志蛋白Runx2、OCN及骨形态发生受体蛋白2表达 细胞用冷的PBS洗2次，使用RIPA裂解液(添加蛋白酶抑制剂cocktail)裂解细胞，4 ℃，13 000×g离心5 min，取上清即为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，加入等体积2×SDS上样缓冲液进行凝胶电泳。电泳完毕将蛋白从胶转移至PVDF膜上，37 ℃，5%脱脂奶粉封闭1 h，抗Runx2、OCN和骨形态发生受体蛋白2的抗体作为一抗，β-actin作为内参，HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠作为二抗，ECL发光，胶片曝光检测蛋白表达。

1.5.7 双荧光素酶报告实验 合成含有骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR的目的片段及其突变体，将得到的DNA片段连接到pMIR-REPORT载体荧光素酶报告基因下游，构建好的质粒分别称作骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR野生型和骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR突变型。将293T细胞接种在48孔板里，使用lipofectamine 2000转染miR-106a模拟剂以及骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR野生型或骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR突变型，转染36 h后，使用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.5.8 Target Scan预测miR-106a靶基因 miR-106a的靶基因预测采用在线软件Target Scan(http://www. targetscan. org/)进行分析。

1.6 主要观察指标 ①双荧光素酶报告实验验证人骨髓间充质干细胞中miR-106a与骨形态发生受体蛋白靶向结合；②Western blot实验检测人骨髓间充质干细胞中miR-106a负调控骨形态发生受体蛋白的表达；③Western blot实验检测了人骨髓间充质干细胞中miR-106a过表达或敲降骨形态发生受体蛋白后对成骨分化标志物RUNX2和OCN的影响。

1.7 统计学分析 实验中测量数据均以x(_)±s表示，使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析处理数据，组间差异使用t 检验或单因素方差分析进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

对干细胞成骨分化机制的研究可以更深入的了解骨骼疾病的病原，为骨骼的再生和治疗提供理论依据^[28]。为了研究miR-106a在成骨分化中的作用，作者使用miR-106a模拟剂过表达miR-106a，结果发现碱性磷酸酶活性下降，成骨分化标志蛋白Runx2和OCN蛋白表达量下降，成骨分化受到抑制。这些结果暗示miR-106a在成骨分化中有负向调控的作用，但是miR-106a在成骨分化中的具体作用还很少有人报道。为了深入研究miR-106a调控成骨分化的分子机制，作者使用TargetScan在线软件查找成骨分化相关蛋白，发现骨形态发生受体蛋白2可能是miR-106a的潜在靶基因，它的3’-UTR和miR-106a有一小段互补区域。通过进一步研究发现随着成骨分化的进行，骨形态发生受体蛋白2表达逐渐升高，与miR-106a的变化趋势相反。miR-106a过表达可导致骨形态发生受体蛋白2下调，表明在成骨分化过程中骨形态发生受体蛋白2受到miR-106a的调控。双荧光素酶报告实验表明miR-106a可以抑制骨形态发生受体蛋白2 3’-UTR的转录活性，进一步验证了骨形态发生受体蛋白2是miR-106a的靶基因。为了研究骨形态发生受体蛋白2在成骨分化中的作用，使用RNA干扰技术敲降骨形态发生受体蛋白2的表达，结果发现成骨分化受到抑制，表明骨形态发生受体蛋白2在成骨分化的过程中有重要的作用。

miR-106a属于miR-17家族，而miR-17家族又是从miR-17/92基因簇中分离出来。miR-17家族有6个miRNA：miR-17-5p，miR-20a，miR-106a，miR-20b，miR-106b和miR-93^[29]。miR-106a可以靶向不同的基因从而调控细胞的生理学过程。在星形胶质瘤发展过程中，miR-106a可以靶向FASTK从而抑制星形胶质瘤细胞的增殖和迁移^[24]。在胶质瘤干细胞中，miR-106a直接靶向TIMP-2从而加强胶质瘤干细胞的侵袭能力^[30]。在小鼠胚胎干细胞的发育过程中，miR-17家族成员miR-17-5p、miR-20a、miR-106a和miR-93可以靶向骨形态发生受体蛋白2，从而调控原肠胚的形成^[31]。

单个miRNA可以靶向调控多种mRNA^[32]，单个mRNA也可以受多种miRNA的调控^[33]。骨形态发生受体蛋白2可以受到不同miRNA的调控。例如，miR-342通过靶向骨形态发生受体蛋白2和Akt1加强巨噬细胞的炎症刺激进而促进动脉粥样硬化^[34]。miR-100通过靶向骨形态发生受体蛋白2从而调控脂肪来源的间充质干细胞成骨分化^[35]。在人脂肪干细胞向软骨分化的过程中，miR-490可以靶向骨形态发生受体蛋白2从而抑制软骨形成^[36]。在牛的腺垂体中，miR-375可以靶向骨形态发生受体蛋白2从而影响激素的合成和分泌^[37]。在肺动脉高血压疾病中，miR-17-5p和miR-20a可以靶向骨形态发生受体蛋白2，过表达miR-17/92导致骨形态发生受体蛋白2蛋白的减少^[38]。因此，在不同的生理学过程中，骨形态发生受体蛋白2有多种多样的功能，受到多个miRNA的调控。

骨形态发生受体蛋白2属于转化生长因子β超家族成员，是骨形态发生蛋白的受体^[39]。骨形态发生蛋白信号在间充质干细胞成骨分化过程中有重要的作用^[40]，骨形态发生蛋白可激活两条信号通路，一条是由细胞外的骨形态发生蛋白绑定到骨形态发生受体蛋白的异二聚体上，导致骨形态发生受体蛋白2介导的骨形态发生受体蛋白1激活，引起Smad信号分子的激活，从而激活成骨分化相关基因表达^[41]。另一条通路是骨形态发生蛋白与细胞表面的骨形态发生受体蛋白1连接形成复合体，通过骨形态发生受体蛋白1招募细胞中游离的骨形态发生受体蛋白2形成复合物，骨形态发生受体蛋白1通过桥蛋白XIAP，TABI与TAK1连接，从而激活p38 MAPK信号通路^[42]。这些研究表明骨形态发生受体蛋白2是成骨分化的关键因子。实验结果显示敲降骨形态发生受体蛋白2，成骨分化受到抑制，暗示骨形态发生受体蛋白2在成骨分化过程中有重要的角色。

实验结果表明，在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，miR-106a通过靶向骨形态发生受体蛋白2从而调控成骨分化。骨形态发生受体蛋白2和miR-106a可能作为治疗骨骼疾病的潜在药物作用靶点，对临床治疗骨骼疾病具有重要指导意义。