血小板反应蛋白1在纤维化模型大鼠肾组织中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.021

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (27): 4098-4104.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.021

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血小板反应蛋白1在纤维化模型大鼠肾组织中的表达

杜俊文，吴韬，张坤，苏白玉，卢彩萍，王伟超，雷琳，郭静霞

石家庄市第一医院，河北省石家庄市 050000

修回日期:2016-04-24 出版日期:2016-06-30 发布日期:2016-06-30
通讯作者: 王伟超，石家庄市第一医院，河北省石家庄市 050000
作者简介:杜俊文，女，1976年生，河北省人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事内分泌及代谢疾病研究。
基金资助:
2013年石家庄市科学技术研究与发展指导计划(131462423)

Thrombospondin-1 expression in the kidney of a rat model of fibrosis

Du Jun-wen, Wu Tao, Zhang Kun, Su Bai-yu, Lu Cai-ping, Wang Wei-chao, Lei Lin, Guo Jing-xia

Shijiazhuang First Hospital, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Revised:2016-04-24 Online:2016-06-30 Published:2016-06-30
Contact: Wang Wei-chao, Shijiazhuang First Hospital, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Du Jun-wen, Master, Associate chief physician, Shijiazhuang First Hospital, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
Supported by:
the Shijiazhuang Science and Technology Research and Development Guide Project in 2013, No. 131462423

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肾脏纤维化：是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，导致肾脏完全丧失脏器功能。
血小板反应蛋白1：是分泌到细胞表面的一种相对分子质量450 000的标准化三聚体糖蛋白，能够进入到各种组织中，参与激活潜在的转化生长因子β1，不仅是转化生长因子β1的内源激活因子，还是重要的抗血管生成因子，在纤维化肾脏中阻碍肾脏的自身修复。

摘要
背景：在实验性炎症性肾脏疾病模型中血小板反应蛋白1是转化生长因子β1重要的内源活化剂。转化生长因子β1是在许多不同的炎性疾病过程中，导致组织纤维化的主要细胞因子，特别是在肾脏疾病。
目的：探讨血小板反应蛋白1在纤维化肾组织中的表达。
方法：将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组与模型组，模型组大鼠右侧输尿管进行结扎，制备大鼠肾纤维化模型。术后3周，每周取血、取尿，用ELISA与Bradford法检测血清肌酐、血尿素氮水平及尿蛋白含量；处死大鼠后，取结扎侧肾脏固定，用Western blot方法检测血管内皮生长因子、转化生长因子β1和血小板反应蛋白1蛋白的表达，苏木精-伊红检测术后肾组织病理结构改变情况。
结果与结论：①造模后1周，模型组大鼠尿蛋白、血清肌酐与尿素氮水平显著高于假手术组(P < 0.05)，3周后，各指标差异更显著(P < 0.01)，表明肾功能损伤加重；②模型组转化生长因子β1蛋白与血小板反应蛋白1蛋白表达量明显高于假手术组，而血管内皮生长因子蛋白表达量显著低于假手术组；③苏木精-伊红染色结果显示，结扎肾小管后大鼠肾组织严重病变。④结果提示：血小板反应蛋白1蛋白在大鼠纤维化肾组织中表达水平显著升高，且其表达水平与血管内皮生长因子蛋白和转化生长因子β1蛋白密切相关，可能在肾纤维化中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-4513-7380(王伟超)

关键词: 实验动物, 肝肾损伤与修复动物模型, 血小板反应蛋白1, 血管内皮生长因子, 转化生长因子β1, 肾纤维化

Abstract:

BACKGROUND: Thrombospondin-1 is an important endogenous activator of transforming growth factor beta 1 in this experimental inflammatory kidney disease model. Transforming growth factor beta 1 is considered the major cytokine that causes tissue fibrosis in many different inflammatory disease processes, in particular in renal disease.
OBJECTIVE: To investigate the expression of thrombospondin-1 on renal fibrosis in rats.
METHODS: Healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham surgery group and model group. In the model group, right ureters of rats were ligated to construct models of renal fibrosis. 3 weeks after surgery, blood and urine were obtained weekly. Enzyme linked immunosorbent assay and Bradford method were used to detect the contents of serum creatinine, blood urea nitrogen and urinary protein. After rats were sacrificed, kidneys were fixed. Western blot assay was utilized to identify the expression of vascular endothelial growth factor, transforming growth factor beta 1 and thrombospondin-1 protein. Hematoxylin-eosin staining was applied to detect the changes in pathological structure of the kidney after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) One week after model induction, urinary protein, serum creatinine and urea nitrogen levels were significantly higher in the model group than in the sham surgery group (P < 0.05). Three weeks later, the difference in each index was significant (P < 0.01), which showed that the injury of the kidney was aggravated. (2) Transforming growth factor beta 1 protein and thrombospondin-1 expression was significantly higher in the model group than in the sham surgery group, but vascular endothelial growth factor protein expression was significantly lower in the model group than in the sham surgery group. (3) Hematoxylin-eosin staining results demonstrated that severe pathological changes of renal tissue in rats were detected after ligation of renal tubule. (4) These results confirmed that thrombospondin-1 expression increased in renal tissue, and its expression was strongly associated with vascular endothelial growth factor protein and transforming growth factor beta 1, which may play an important role in the renal fibrosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Fibrosis, Nephrosis, Vascular Endothelial Growth Factors, Transforming Growth Factor beta 1;Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杜俊文，吴韬，张坤，苏白玉，卢彩萍，王伟超，雷琳，郭静霞. 血小板反应蛋白1在纤维化模型大鼠肾组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4098-4104.

Du Jun-wen, Wu Tao, Zhang Kun, Su Bai-yu, Lu Cai-ping, Wang Wei-chao, Lei Lin, Guo Jing-xia. Thrombospondin-1 expression in the kidney of a rat model of fibrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 4098-4104.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程 30只大鼠均完成实验进入结果分析，实验造模过程中无死亡。造模流程图见图1。

2.2 模型更接近人类或临床实践/模型稳定性 该模型各项生化指标变化显著，间质纤维化病变突出，与临床肾纤维化的发生发展过程及其相似。使用该模型的一些研究结果与临床患者的观察结果相似。

同时，此方法成模率高，重复性好，啮齿类动物模型可反映人类肾脏纤维化的疾病过程。所以该模型是一种研究肾纤维化发生机制、肾脏细胞转化和评价肾纤维化治疗方法的理想模型。
2.3 肾功能检测

2.3.1 尿蛋白 大鼠造模后1，2，3周，利用Bradford方法检测尿蛋白含量。造模后1周，与假手术组相比，模型组大鼠的尿蛋白水平显著升高(P < 0.05)；造模后2周起，模型组大鼠尿蛋白升高更明显，与假手术组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，且呈上升趋势。见表1。

2.3.2 血清肌酐与尿素氮 大鼠造模后1，2，3周，利用ELISA方法检测大鼠血清中肌酐与尿素氮水平。造模后1周，模型组大鼠血清中肌酐与尿素氮较假手术组显著升高(P < 0.05)；造模后3周，模型组大鼠血清中肌酐与尿素氮升高更明显，与假手术组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2。尿蛋白、血清肌酐与尿素氮表达量的增加表明肾功能损伤加重。

2.4 大鼠肾脏组织中血小板反应蛋白1、血管内皮生长因子和转化生长因子β1蛋白的表达 Western blot方法检测大鼠手术后，结扎侧肾脏组织中血小板反应蛋白1、血管内皮生长因子和转化生长因子β1蛋白的表达水平。结果显示，造模1周后，模型组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1与血小板反应蛋白1的蛋白表达量开始升高，且模型组中血管内皮生长因子蛋白的表达量与假手术组相比也开始降低，显著低于假手术组；造模后3周，模型组转化生长因子β1与血小板反应蛋白1的蛋白表达量升高更明显，血管内皮生长因子蛋白的表达量与假手术组相比亦显著降低。见图2、表3。

2.5 大鼠肾组织纤维化的病理变化 苏木精-伊红染色观察大鼠术后肾组织病理结构变化。假手术组大鼠肾组织结构完整，没有变性和坏死，细胞核周围没有炎性细胞浸润，在间质中没有纤维细胞增殖、腺嘌呤结晶沉积及肾小管上皮细胞空泡化(图3A-C)；模型组大鼠肾组织中，肾小管沉积很多结晶且上皮细胞空泡化严重，肾小球内皮细胞、上皮细胞、系膜细胞完全消失萎缩，肾包膜与肾小管部分细胞全部消失，间质中纤维细胞显著增殖，并伴有大量的炎性细胞浸润，并随时间的推移越加严重(图3D-F)。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料 健康雄性SD大鼠30只，体质量180-220 g，6-8周龄，由江苏省医学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(苏)2015-0001。普通喂养饲料由江苏省医学实验动物中心提供。实验动物的饲养、操作、处置、处死均符合动物伦理学标准。

1.2 造模方法 将健康雄性SD大鼠30只随机分为假手术组与模型组，假手术组15只，模型组15只。

动物模型的制备^[11]：腹腔注射水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠，待大鼠无翻身反射后，去腹腔部毛，并用碘伏消毒，沿腹部中线切开，膀胱附近的脂肪与肠用湿棉签轻轻拨开，从血管和脂肪组织中小心剥离并暴露出右侧的输尿管，模型组大鼠用尼龙单丝缝合线将暴露出的左侧输尿管进行结扎，肌肉、筋膜和皮肤逐层缝合，并用青霉素在伤口处消毒，术后每日腹腔注射青霉素以防感染。假手术组大鼠亦解剖，但不结扎输尿管。手术后每周每组处死5只大鼠，共3周。

1.3 造模成功的检测标准 造模后大鼠尿蛋白增高，血清中肌酐、尿素氮增高；同时，肾组织病理结构发生较为明显的空泡化，间质中纤维细胞大量增殖，并伴有大量的炎性细胞浸润等变化，即为造模成功。

1.4 尿蛋白检测 每周一清晨收集SD大鼠空腹尿液。挤压大鼠膀胱，用移液枪吸取大鼠尿液500 μL，置于离心管中，-20 ℃保存。测定尿蛋白前，先配制1 g/L的牛血清蛋白(BSA)母液，再向母液中加入PBS，配制成质量浓度分别为1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/L的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到质量浓度分别为0.10，0.08，0.06，0.04，0.02 mg/L的BSA溶液，另取1 mL的PBS(BSA溶液质量浓度为0 g/L)作对照试验。用移液枪分别移取50 μL配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200 μL的考马斯亮蓝(CBB)。静置10 min后，用酶标仪测BSA溶液在595 nm波长下的吸光度值，用吸光度值与浓度做出标准曲线，根据标准曲线计算出样品的质量浓度。

1.5 ELISA测定血清肌酐与尿素氮水平 大鼠每周一清晨眶静脉取血1.5 mL于含有肝素钠的抗凝管中， 1 000 r/min离心15 min，取血清，按照血清肌酐与尿素氮 ELISA试剂盒说明书进行操作，孵育、洗涤后，用酶标仪检测吸光度值，根据标准品的吸光度值与浓度制作标准曲线，根据标准曲线计算出样品的浓度。

1.6 Western blot测定血小板反应蛋白1、血管内皮生长因子和转化生长因子β1蛋白的表达 大鼠分别于术后1，2，3周，腹腔注射水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠，取其结扎侧部分肾脏组织，置于干冰上快速剪碎，加入800 μL的RIPA蛋白裂解液，放入匀浆机中进行匀浆，匀浆后4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。每个样品取50 μg蛋白置于配制好的12%分离胶与6%浓缩胶中进行垂直电泳(60 V 40 min，90 V 90 min)和电转膜)10 V恒压半干转50 min)；取出PVDF素膜于5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBS溶液5 min×3次洗膜后，根据Marker剪下所需条带，血小板反应蛋白1(1∶1 000)、血管内皮生长因子(1∶800)和转化生长因子β1、血管内皮生长因子(1∶800)抗体4 ℃孵育过夜，第二日取出PVDF膜，TBS溶液5 min×3次溶液洗涤后，室温孵育二抗(1∶1 500)1 h，TBS溶液洗 5 min×3次后进行显影。

1.7 病理检测 大鼠麻醉后，取其结扎侧部分肾脏组织，置于40 g/L多聚甲醛中室温避光固定72 h，组织在流水中冲洗数分钟，梯度乙醇与二甲苯脱水后，石蜡包埋，切成5 µm厚的切片，经脱蜡、抗原修复等步骤后，进行苏木精-伊红染色，封固、拍照，显微观察肾组织病理学变化。

1.8 主要观察指标 ①Bradford方法检测大鼠尿蛋白含量。②ELISA法检测大鼠血清中肌酐与尿素氮水平。③Western blot法检测大鼠肾脏组织中血小板反应蛋白1、血管内皮生长因子和转化生长因子β1蛋白表达。④苏木精-伊红染色观察大鼠肾组织病理结构变化。

1.9 统计学分析 应用SPSS 15.0软件进行数据统计分析。数据运用x(_)±s表示，t-test分析组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义，所有实验重复3次。

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讨论

肾脏纤维化是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程^[12-13]。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，导致肾脏完全丧失脏器功能^[14-17]。肾纤维化是一个动态的融合过程，涉及炎性细胞浸润，多来源成纤维细胞的激活和扩散、细胞外基质累积、肾小管萎缩、血管稀疏和缺氧等情况^[18-19]。

间质性肾炎动物模型的造模方法有很多，如给予动物外源性抗原物质或抗生素、重金属、低钾食物及机械等方法^[20-22]，但是单侧输尿管结扎造模方法简便，成模率高，重复性好，该模型的各项生化指标变化也较为明显^[23]。由单侧肾缺血造成的大鼠急性肾损伤所引起的一些列情况导的致间质炎症、纤维化与病变，高度模仿了人慢性肾病病变情况^[24]。因为在急性肾损伤急性阶段中，这种单边模式维护了系统的内稳态，所以这种造模方式是有利的^[25]。另外，右侧肾脏为每个大鼠提供重要的控制，减少或排除手术后对动物的影响作用，但右侧肾脏可能会受左侧肾脏缺血的影响，尤其是发生代偿性肥大，而发生一定程度的后遗症，但类似的过程也可保存以前缺血性肾组织^[26-27]。与大鼠接受双边肾缺血不同，大鼠接受单边缺血没有出现尿毒症或凝血障碍等症状^[28]。因此，左侧肾脏结扎方法提供了一个有效的可控的模型。

同时，啮齿类动物模型也可反映人类纤维化肾脏疾病的过程，与临床肾脏病的发生过程相似度高，在临床患者中，急性肾损伤和慢性肾病是相通的，存在诱发其他症状的可能性^[29]。此次研究所使用的造模方法，而这种双向关系的机制还不清楚^[30]。急性肾小管坏死及炎症是慢性间质炎症和纤维化后的主要症状^[31]，作者此次的实验结果也证明了这一点。所以此模型是分析和评价肾纤维化治疗的理想模型。

此次研究结果表明，通过结扎大鼠左侧肾小管造成肾纤维化模型^[14]，造模后1-3周，模型组尿蛋白、尿素氮与血清肌酐的表达水平与假手术组相比明显升高(P < 0.05)，与病理切片结果一致，表明肾功能严重受损；模型组大鼠转化生长因子β1与血小板反应蛋白1的表达水平与假手术组相比显著升高，而血管内皮生长因子的表达显著降低，致使肾脏纤维化进一步加重。结果提示，血小板反应蛋白1可能是通过调节转化生长因子β1和血管内皮生长因子的表达，在肾脏纤维化中发挥重要的作用，与慢性肾疾病的发展密切相关。

因此，对血小板反应蛋白1表达的干预可抑制肾脏纤维化的恶化，可能是针对纤维化靶向性更强、效果更好的治疗手段，具有广阔的应用前景，同时对临床治疗肾纤维化具有促进作用和积极意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

血小板反应蛋白1在纤维化模型大鼠肾组织中的表达

Thrombospondin-1 expression in the kidney of a rat model of fibrosis

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