重组人类骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶与血管内皮生长因子进行的脊柱融合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (25): 3699-3705.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.008

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重组人类骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶与血管内皮生长因子进行的脊柱融合

田野¹，朱悦²，仲涛³

¹沈阳市红十字会医院骨外科，辽宁省沈阳市 110013；²中国医科大学附属第一医院骨外科，辽宁省沈阳市 110013；³大连市第三人民医院骨外科，辽宁省大连市 116033

收稿日期:2016-03-25 出版日期:2016-06-17 发布日期:2016-06-17
通讯作者: 朱悦，中国医科大学附属第一医院骨外科，辽宁省沈阳市 110013
作者简介:田野，男，1977年生，辽宁省辽阳市人，满族，硕士，副主任医师，主要从事脊柱脊髓损伤研究。

Fibrin glue combined with vascular endothelial growth factor and recombinant human bone morphogenetic protein 2 applied in spinal fusion

Tian Ye¹, Zhu Yue², Zhong Tao³

¹Department of Orthopaedics, Red Cross Hospital of Shenyang, Shenyang 110013, Liaoning Province, China; ²Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110013, Liaoning Province, China; ³Department of Orthopaedics, the Third Hospital of Dalian, Dalian 116003, Liaoning Province, China

Received:2016-03-25 Online:2016-06-17 Published:2016-06-17
Contact: Zhu Yue, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110013, Liaoning Province, China
About author:Tian Ye, Master, Associate chief physician, Department of Orthopaedics, Red Cross Hospital of Shenyang, Shenyang 110013, Liaoning Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
纤维蛋白凝胶：是由纤维蛋白原与凝血酶反应后形成的立体网状结构、低抗原生物大分子材料，可塑性好，其在体内逐渐降解过程为药物缓慢均匀释放提供了良好条件，立体网状结构也允许新生毛细血管长入。以往的实验表明，纤维蛋白凝胶是骨形态发生蛋白2的良好载体，可以满足骨形态发生蛋白缓慢均匀释放的需要，避免其被血流很快冲走，并且骨形态发生蛋白与纤维蛋白凝胶复合后，骨诱导活性有所提高。
脊柱融合材料：主要包括自体骨、异体骨、人工骨材料，其中自体骨移植被公认为植骨融合的金标准。在脊柱融合内固定手术中，植骨融合是脊柱的长期稳定是根本方法，内固定无论如何发展，都只是一种短期内维持脊柱稳定的方法，所以植骨融合有非常重要的意义，而决定植骨融合效率的主要因素之一是脊柱融合材料。

摘要
背景：骨形态发生蛋白2具有骨诱导作用，血管内皮生长因子对骨形成及修复起正性调节作用，那么二者用于骨融合的效果如何呢？
目的：观察重组人类血管内皮生长因子165和重组人类骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶进行脊柱横突间融合的效果。
方法：将30只日本大耳白兔随机分3组，每组10只，实验组于L5-6横突间置入重组人类血管内皮生长因子165/重组人类骨形态发生蛋白2/纤维蛋白凝胶复合材料，对照组于L5-6横突间置入重组人类骨形态发生蛋白2/纤维蛋白凝胶复合材料，空白对照组于L5-6横突间置入纤维蛋白凝胶材料。置入后6周，进行影像学、生物力学与组织学检查。
结果与结论：实验组、对照组横突间成骨融合，且实验组成骨效果优于对照组，空白对照组无成骨。实验组成骨融合强度高于对照组(P < 0.01)。实验组成骨融合标本可见大量软骨细胞、骨细胞、成熟骨组织与胶原组织，对照组成骨融合标本可见大量软骨细胞、骨细胞及骨组织。结果表明，重组人类血管内皮生长因子165和重组人类骨形态发生蛋白2联合应用有助于促进成骨融合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-1429-2641(朱悦)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 脊柱融合, 血管内皮生长因子, 人重组骨形态发生蛋白2, 纤维蛋白组织黏着剂

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 possesses osteoinduction, and vascular endothelial growth factor plays a positive regulatory role in osteogenesis and bone repair. So what will happen if both of them are used for spinal fusion?

OBJECTIVE: To investigate the effects of fibrin glue combined with vascular endothelial growth factor 165 and recombinant human bone morphogenetic protein 2 on intertransverse process fusion.

METHODS: Thirty Japanese white rabbits were randomized into three groups (n=10 per group): rabbits underwent intertransverse process fusion at the level of L_5-6 with vascular endothelial growth factor 165/recombinant human bone morphogenetic protein 2/fibrin glue in experimental group, recombinant human bone morphogenetic protein 2/fibrin glue in control group, and fibrin glue in blank control group, respectively. At 6 weeks after implantation, observations of biomechanics, X-ray imaging and histology were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: Osteogenic fusion between transverse processes could be found in experimental and control groups except for the blank control group, which was better in the experimental group. The strength of osteogenic fusion in the experimental group was significantly stronger than that in the control group (P < 0.01). Besides, abundant chondrocytes, osteocytes, mature bone tissues and collagens could be found in the osteogenic fusion specimen of the experimental group, and numerous chondrocytes, osteocytes and mature bone tissues observed in the osteogenic fusion specimen of the control group. In conclusion, fibrin glue combined with vascular endothelial growth factor 165 and recombinant human bone morphogenetic protein 2 can promote osteogenic fusion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Spinal Fusion, Vascular Endothelial Growth Factors, Bone Morphogenetic Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

田野，朱悦，仲涛. 重组人类骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶与血管内皮生长因子进行的脊柱融合[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(25): 3699-3705.

Tian Ye, Zhu Yue, Zhong Tao. Fibrin glue combined with vascular endothelial growth factor and recombinant human bone morphogenetic protein 2 applied in spinal fusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(25): 3699-3705.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 30只兔均进入结果分析。

2.2 各组大体标本观察结果实验组有7个判断为融合的标本，其余3个标本虽然在L_5-6间触及大小不等坚硬块状物，但检查腰椎仍有活动度；对照组4个标本达到融合，但融合块与实验组比较薄且小，其余标本虽未达到融合，也观察到在腰椎横突间有硬块形成；空白对照组均未观察到有坚硬块状物形成，更无融合发生，见表1。

2.3 各组影像学检查结果实验组有7个标本左侧L_5-6横突间呈现高密度影，有连续骨小梁通过两横突间，判定为成骨融合；对照组有4个标本判定为融合，有6个而未达到完全融合；空白对照组所有标本均融合，无骨小梁通过，见图1。

成骨图像灰度和面积测定显示，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)，实验组成骨效果优于对照组，空白对照组无成骨，见表2。

2.4 各组骨融合标本生物力学检测结果对7个融合的实验组标本、4个融合的对照组脊柱标本进行6个受力方向的生物力学检测，结果显示两组标本的6组数据比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，见表3。因此要想有同样的位移，实验组脊柱标本比对照组脊柱标本需要更多的力量，可见，实验组融合强度大于对照组。

2.5 各组标本组织学观察结果苏木精-伊红染色后，实验组所有标本均可见大量的软骨细胞、骨细胞、成熟骨组织、胶原组织，移植处未见多核巨细胞、吞噬细胞及淋巴细胞出现，组织相容性良好，未出现明显抗原性；对照组中有9个标本可以观察到大量的软骨细胞和骨细胞及骨组织，而空白对照组所有标本均未见骨细胞成分，见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至8月在中国医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：12月龄健康日本大耳白兔30只，雌雄不拘，体质量3 790-4 120 g，由中国医科大学实验动物中心饲养提供。所有动物在戊巴比妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。将30只兔随机分为实验组、对照组、空白对照组，每组10只。

1.4 实验方法

横突间植骨替代材料的制备：在37 ℃水浴中加入10 mL无菌三蒸水及纤维蛋白原(500 mg)，预热1 h，制备溶液Ⅰ。以2 mL无菌CaCl₂溶液(40 mmol/L)溶解凝血酶(500 U)用，即得溶液Ⅱ，浓度为250 U/mL。将溶液Ⅰ与溶液Ⅱ pH值调整至7.0-7.2，置于4 ℃冰箱中备用。术前1 h，依次加入500 μL溶液Ⅰ、500 ng VEGF165、300 ng rhBMP-2、500 μL溶液Ⅱ，即得到含有rhBMP-2和VEGF165的块状纤维蛋白凝胶，其规格为长2 cm×宽1.5 cm×高0.5 cm，作为横突间融合植骨的替代材料。同样方法制备含有rhBMP-2的纤维蛋白凝胶。

分组干预：2%戊巴比妥钠耳缘静脉注入实验动物，麻醉后充分暴露兔左侧L_5-6横突。磨去两横突背侧骨皮质至松质骨，实验组、对照组、空白对照组分别将VEGF165/rhBMP-2/纤维蛋白凝胶、rhBMP-2/纤维蛋白凝胶、纤维蛋白凝胶置于两横突背侧的植骨床，庆大霉素溶液反复冲洗预防感染，逐层缝合。术后给予注射用青霉素20×10⁴ U，1次/d，连续7 d。分笼饲养6周后取材。

1.5 主要观察指标

大体观察：置入后6周取标本，2名骨科医生盲取触摸植入物区域，检查L_5-6腰椎活动度。观察L_5-6横突间情况，判断是否有成骨、成骨量及是否融合。脊柱融合标准为2人均认为有成骨形成(植入物区域可触摸到连续骨痂)及腰椎无活动。

影像学检测：置入后6周取标本，采集标本X射线正位片，观察标本左侧L_5-6横突间融合情况。由2位骨科医生盲法观察，判定为脊柱融合：有连续骨小梁通过横突间为融合。

生物力学检测：生物力学检测标本均为影像学判定为融合的标本。切断标本椎间盘，咬掉关节突。保留L₅及L₆椎体及左侧横突间膜与融合物。混合搅拌均匀牙托粉和牙托水，注入自制模具中(规格为1.5 cm×1.5 cm× 5 cm)，包埋L₅椎体上端和L₆椎体下端，待混合物凝固后，从模具中取出。

将标本两端的凝固块固定在自制夹具中，在生物力学机上将夹具固定，进行非破坏性生物力学检测(前屈、后伸、左侧弯曲、右侧弯曲、左侧扭转、右侧扭转)，在矢状面和冠状面以3 mm/min恒定的速度移动3 mm；以10 (°)/min的角速度恒定在水平面移动10°(左右旋转)。运动后的第６秒记录抗弯曲力(N)和抗旋转力(N•mm)，每间隔6 s记1次，共10次。

组织学检查：生物力学检测后，立即将标本(包括未融合标本)的横突及横突间组织块切下，进行脱钙后苏木精-伊红染色，观察组织块内成骨情况。

1.6 统计学分析应用SPSS 11.5软件处理数据。用Fisher’s精确概率检验进行率的比较，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在研究自体骨移植替代材料的过程中，组织工程化骨成为目前骨科领域研究的热点，它包括3个基本要素^[5-6]：诱导成骨因子；合适的生物材料载体；间充质类种子细胞。

骨形成过程受到体内多种因子的影响^[7]。其中骨形态发生蛋白是研究最为广泛的诱导成骨因子，其成骨作用主要是通过促进细胞的趋化、有丝分裂和细胞的分化^[8]，诱导具有成骨潜能的未分化间充质细胞分化成软骨细胞或骨细胞，进而在原位或异位产生新生骨^[9-10]。诱导成骨的方式以软骨内化骨为主，也以膜化骨方式进行。2002年，美国的食品与药品管理局(FDA)批准rhBMP-2成为第1个可以用于脊柱融合的移植骨完全替代物。Schimandle等^[11]首次将rhBMP-2用于后外侧横突间脊柱融合动物模型中，所有rhBMP-2组达到100%坚强脊柱融合，生物力学检测显示rhBMP-2组融合强度和硬度均超过自体骨组，组织学观察骨生成数量多而迅速。Boden等^[12]研究认为，在使用骨形态发生蛋白进行脊柱融合时，多能间叶干细胞的迁移主要有两个来源：去皮质的横突骨髓中；周围软组织中。关于rhBMP-2的作用机制，Morone等^[13]从分子水平探讨了兔腰椎横突间脊柱融合过程，认为rhBMP-2增加整个融合块中骨相关基因的表达水平，刺激横突间融合块骨形态发生蛋白2的mRNA表达，避免了中央部位的延迟愈合，降低了脊柱不融合的发生率。愈合的机制与自体骨移植愈合机制不同，rhBMP-2能够从周围肌肉中吸引骨祖细胞，提供早期的稳定壳并逐渐向中心产生骨组织，自体骨移植愈合则完全依靠宿主骨去皮质来提供成骨细胞。目前，Park等^[14-15]在灵长类动物实验的基础上，已成功地将rhBMP2应用于人体后外侧脊柱融合，用以替代髂骨移植的临床实验，报道了极佳的临床疗效。

血管化作用在成骨过程中扮演着重要角色，骨组织内或周围血运不良会导致骨形成和骨量的减少^[16]。VEGF165是体内促进血管生长最重要的生长因子，是由血小板、巨核细胞、内皮细胞和成骨细胞等分泌的多功能细胞素，其表达水平直接影响到以后成骨的血供，影响成骨形成速度和质量^[17]。阻抑VEGF的表达会抑制成骨部位血管的爬行，减少小梁骨的形成，以及软骨的重吸收^[18]。Street等^[19]研究了骨折愈合过程，认为VEGF能够增加组织中的碱性磷酸酶，并存在剂量依赖性。VEGF165在骨形成与代谢中的作用主要体现在3个方面：①通过促进内皮细胞增殖、血管生成参与骨发育形成。VEGF165可通过受体VEGFR1-3、硫酸乙酰肝素黏多糖及神经菌膜蛋白选择性地作用于血管内皮细胞，具有促进微静、小静脉通透性增加，血管内皮细胞分裂、增殖及诱导血管生成的作用。骨组织和其他组织再生一样，依赖于血管再生。首先由毛细血管长入骨痂或骨周组织，形成型的微循环网，同时带入成骨细胞，形成新骨^[20]。②作为旁分泌因子参与骨形成与代谢。Wang等^[21]发现VEGF165可促进血管内皮细胞分泌胰岛素样生长因子1及内皮素1，而这些细胞因子刺激成骨细胞生长。③通过作用于成骨细胞强表达的flt-1受体，增加成骨细胞移动和分化功能^[22-23]。④在血肿形成、局部缺氧等情况下也可以加速VEGF165 的分泌，加强局部血管增生、渗入，增加局部血流量，从而加速骨形成及修复过程^[24]。

近年来，国内外大量研究发现，VEGF165与骨形态发生蛋白2在骨形成过程中具有协同促成骨的作用^[25-27]。骨形态发生蛋白2能够促进成骨细胞的凋亡^[28]，而外源性VEGF可拮抗其诱导的成骨细胞凋亡，维持细胞存活，同时增加干细胞的募集，加速软骨重吸收和形成，促进新骨形成和骨折愈合。VEGF165可刺激内皮细胞分泌骨形态发生蛋白2，促使内皮细胞合成骨形态发生蛋白2 mRNA增高两三倍^[29]。另一方面，骨形态发生蛋白2可对VEGF165的表达起正相调节作用。用骨形态发生蛋白2作用于大鼠成骨细胞细胞前体样细胞系KS483，可以增高其骨钙素mRNA的合成，同时也增加VEGF165的分泌量，而且血管发生作用明显增加，如果给予VEGF165抗体，则无论是否由骨形态发生蛋白2调控的血管生成都会受到抑制，说明骨形态发生蛋白2可通过刺激VEGF165的合成增加而促进血管发生^[30-31]。

实验选用纤维蛋白凝胶作为rhBMP-2和VEGF165的载体。纤维蛋白凝胶是由纤维蛋白原与凝血酶反应后形成的立体网状结构、低抗原生物大分子材料，可塑性好，其在体内逐渐降解过程为药物缓慢均匀释放提供了良好条件，立体网状结构也允许新生毛细血管长入。以往的实验表明，纤维蛋白凝胶是骨形态发生蛋白2的良好载体，可以满足骨形态发生蛋白缓慢均匀释放的需要，避免其被血流很快冲走，并且骨形态发生蛋白与纤维蛋白凝胶复合后，骨诱导活性有所提高^[6^，^32-37]。在预实验中选择了3，4，5，6周作为观察点，发现3周后无成骨形成，6周时实验组与对照组的成骨形成出现显著差异，因此实验选择了6周作为观察点。作者此次实验结果显示，该条件下制备的纤维蛋白凝胶是rhBMP-2单独应用及rhBMP-2和VEGF165联合应用的良好载体，6周后无残留；并且组织学检查移植处未见多核巨细胞、吞噬细胞及淋巴细胞出现，组织相容性良好，未出现明显抗原性。

实验中放射学、组织学观察及生物力学检测结果显示，各组成骨和融合效果为：实验组>对照组>空白对照组。因此认为VEGF165、rhBMP2联合纤维蛋白凝胶构建的横突间脊柱融合体，其成骨及融合效果要优于单用rhBMP-2/纤维蛋白凝胶，可成为有效的自体骨移植替代物。实验中，两种外源性生长因子的联合应用不但增强了诱导、促进成骨作用，同时降低了各自的剂量，也就降低了不良反应，使组织工程化骨疗法最大限度地适用于不同患者，尽管在6周的实验过程中，所有动物均未观察到有不良反应出现，但实验中所选因子及细胞对动物的远期作用仍不得而知。相信通过广大医学生物工作者及相关行业研究人员的共同努力，将会对不同生长因子的成骨作用，以及在成骨过程中各因子的协同作用，特别是远期作用，有更加深入的了解。骨组织工程技术必将在脊柱融合方面有更为广阔的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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