体外构建复合软质再生颅骨修复材料填充修复颅骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨形态发生蛋白7：成熟的骨形态发生蛋白7由前体的多肽产物经酶水解后，2条含139个氨基酸组成的多肽链经二硫键结合后形成的同源二聚体糖蛋白组成，相对分子质量约为35 000，其空间结构形似“手掌”。天然骨形态发生蛋白7存在同源和异源二聚体形式，二聚体形式的骨形态发生蛋白7是其生物学活性主要形式。内源性骨形态发生蛋白7可以通过抑制性Smads途径来抑制信号传递蛋白Smads的转移，阻断转化生长因子β的信号转导，从而抵消转化生长因子β的活性，调节细胞外基质的合成与降解，发挥抗纤维化作用。骨形态发生蛋白7也是 P53家族的靶基因，能够调节与P53生理水平相关的细胞存活能力。
壳聚糖的生理活性：①控制胆固醇：壳聚糖具有强大的阴离子吸附力，既能阻止脂肪的吸收，又可以将人体血液内的胆固醇排泄掉。②抑制细菌活性：壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，其溶液中含有氨基(NH2+)，这些氨基通过结合负电子来抑制细菌。③预防和控制高血压：壳聚糖通过自身的氯离子和氨根离子之间的吸附作用，排泄氯离子，还能降低血管紧缩素Ⅱ表达，有助于防止高血压的发生。④吸附和排泄重金属：壳聚糖是高效的螯合物介质。壳聚糖的吸附能力的大小取决于其脱乙酰度。脱乙酰度越大，吸附能力越强。⑤免疫效果：壳聚糖表现出有选择性的高度抑制口腔链球菌生长的作用，同时并不影响其他有益细菌的生长。

摘要
背景：临床进行骨缺损修复的过程中，自体骨和异体骨移植等均存在一定的不足和问题，无法获得理想的治疗效果。
目的：观察体外环境下构建的复合软质再生颅骨修复材料修复颅骨缺损的效果。
方法：①体外环境下以骨形态发生蛋白7衍生多肽、壳聚糖、纳米羟基磷灰石及胶原制备复合软质再生颅骨修复材料。②取24只SD大鼠，随机等分为对照组和实验组，均制备颅骨缺损模型。对照组和实验组分别予以单纯壳聚糖/纳米轻基磷灰石/胶原复合材料和复合软质再生颅骨修复材料修复缺损部位。
结果与结论：①构建的复合软质再生颅骨修复材料呈疏松多孔结构，体外环境下骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放量呈现出不断上升的趋势。②与对照组相比，实验组大鼠颅骨缺损区骨密度较高，且与正常骨组织十分接近，植入材料发生降解明显，新骨形成面积较大。表明复合软质再生颅骨修复材料修复颅骨缺损效果良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-0954-9361(张同星)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 骨缺损, 颅骨缺损, 再生颅骨, 骨形态发生蛋白, 壳聚糖, 羟基磷灰石, 胶原

Abstract:

BACKGROUND: In the process of bone defect repair, as their respective shortcomings, both autograft and allograft cannot obtain satisfactory outcomes.div> OBJECTIVE: To observe the effect of soft composite materials for bone regeneration established in vitro in skull defect repair.

METHODS: Soft composite materials for bone regeneration (bone morphogenetic protein 7-derived polypeptide, chitosan, nano hydroxyapatite and collagen) were established in vitro. Twenty-four Sprague-Dwley rats were enrolled to prepare skull defect models, and were randomly equivalently divided into two groups. The rats were repaired with chitosan/nano hydroxyapatite/collagen composite materials as control group, and those repaired with soft composite materials of bone regeneration as experimental group.

RESULTS AND CONCLUSION: The soft composite material of bone regeneration exhibited a loose and porous structure and bone morphogenetic protein 7-derived polypeptide was released in a gradually rising trend. Compared with the control group, bone mineral density of the defect region in the experimental group was higher, which was similar with that of the normal bone tissue, and additionally numerous newborn bones could be found. These results show that the soft bone regeneration composite material exerts a better repair effect in skull defect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Skull, Bone Morphogenetic Protein 7, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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Zhang Tong-xing, Gao Hua. Soft composite materials for bone regeneration in vitro in skull repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(25): 3706-3712.

图/表（结果） 6

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引言

由于车祸和疾病等不断增加的影响，颅骨缺损的发生率呈现出上升趋势^[1]。颅骨缺损严重影响到患者的身体健康和正常生活等，需要进行修复治疗。传统的颅骨缺损修复需要按照不同患者露骨缺损的大小和形状等，使用不同的材料进行修复。例如在使用钛合金进行修复的时候，需要在术前手工敲制钛合金网板，手术中还要反复修形，以更好的符合不同患者缺损部位的生理弯曲度。但是，这些材料与人体正常的骨组织是截然不同的，有可能发生排异反应，导致手术失败，无法获得理想的修复效果^[2]。为此，临床需要寻找更加有效的修复材料，以达到更好的填充效果。

理想的支架材料的要求为有良好的生物相容性，细胞毒性小、具有可降解性等。壳聚糖具有特殊的理化性质和生理功能，化学稳定性良好，遇水易分解，无毒、无害、具有优良的生物相容性。纳米羟基磷灰石属于可降解的生物材料，具有良好的孔隙结构和生物相容性等，是十分理想的支架材料，可应用于骨修复治疗之中^[3]。胶原具有很强的伸张能力，可以改善羟基磷灰石的强度和韧性，使人工骨更加贴近人体天然骨成分。骨形态发生蛋白能够诱导细胞分化为骨、软骨等，可以在骨修复之中发挥出重要的作用^[4]。骨形态发生蛋白7衍生多肽属于新型的多肽活性分子，具有与骨形态发生蛋白7类似的生物活性。呈螺旋状空间结构，可以很好的与支架材料进行复合，改善该复合材料其骨诱导性。

作者拟制备与自体骨组织相似的、具有良好生物相容性和骨诱导性以及骨传导的复合软质再生颅骨修复材料，并以其颅骨缺损动物模型，为临床颅骨缺损治疗提供参考。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6至7月在冀州市医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康清洁级SD大鼠24只，鼠龄4周，雌雄各半，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号SCXK(湘)2015-0011。实验符合动物伦理学要求，实验方案经河北省冀州市医院动物实验伦理委员会批准。

植入物：纳米羟基磷灰石由四川大学生物材料工程研究中心提供，为白色粉末，难溶于水，易溶于酸，无细胞毒性和热原反应等，具有良好的生物相容性。

1.4 方法

1.4.1 制备复合软质再生颅骨缺损修复材料利用共沉淀法制备复合软质再生颅骨缺损修复材料，配制 0.5 mol/L醋酸，将10 g胶原溶于其中。待溶解充分之后，向上述胶原溶液中缓慢添加H₃PO₄溶液(0.5 mol/L)和CaCl₂溶液(0.5 mol/L)以及NaOH溶液(0.5 mol/L)，保持溶液pH为7.4。对获得的溶液进行充分搅拌，12 h之后对沉淀产物进行冻干，之后磨粉保存备用。将10 g壳聚糖溶解在六氟异丙醇溶剂中，获得黏稠溶液，并添加 10 g纳米羟基磷灰石/胶原。利用超声波进行30 min的分散并置于模具会中进行冷却、成型，之后蒸发有机溶剂，保存备用。将复合材料制成圆柱体(高度为2 mm，直径为5 mm)，浸泡在多肽溶液中，并进行真空吸附，最终的材料多肽负载量为每个棒材1 mg^[5]。

1.4.2 骨形态发生蛋白7衍生多肽的体外释放规律将5个复合软质再生颅骨缺损修复材料(圆柱体)2 mL PBS，并置入恒温箱(37 ℃)中，连续观察14 d，每天定时提取释放液，利用高效液相色谱仪对骨形态发生蛋白7衍生多肽的含量进行检测，记录每天的释放量，并绘制释放曲线。

1.4.3 颅骨缺损模型的制备大鼠以水合氯醛麻醉，切开颅骨正中线皮肤和骨膜，利用磨钻对左右顶骨制成直径为5 mm的类圆型颅骨全层骨缺损，获得颅骨缺损模型。将24只大鼠随机等分为对照组和实验组，分别在骨缺损区植入壳聚糖/纳米轻基磷灰石/胶原复合材料和复合软质再生颅骨修复材料，材料良好覆盖缺损区域之后常规分层缝合切口，予以抗感染治疗，并常规喂养。

1.4.4 取材及CT检测修复后6和12周，每组取6只大鼠，处死取脑。对颅脑标本进行CT三维重建，由资深影像学医生进行读片。

1.4.5 苏木精-伊红染色修复后6和12周，取大鼠颅脑标本进行多聚甲醛固定，EDTA 脱钙，常规石蜡包埋切片，予以苏木精-伊红染色，利用Image-Proplus 5 图像分析软件对新骨形成面积进行计算。

1.5 主要观察指标 ①利用扫描电子显微镜对复合软质再生颅骨修复材料进行扫描，观察其超微结构。②骨形态发生蛋白7衍生多肽体外释放情况。③术后不同时间颅骨缺损动物实验CT三维重建和组织学观察结果。④术后不同时间颅骨缺损动物实验新骨形成面积。

1.6 统计学分析数据利用SPSS 18.0软件进行处理，计量资料予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

临床对不同原因导致的颅骨缺损患者进行治疗的过程中，需要使用一定的修复材料^[6]。以往大多使用各种人工材料如钛合金等进行修补，但这些材料与人体正常的骨组织之间存在一定的差异，有可能导致排异反应的出现，造成手术失败^[7-9]。

随着骨组织工程技术的不断发展，临床开始积极尝试利用各种软质再生骨修复材料进行临床治疗^[10-11]。骨形态发生蛋白具有促进成骨细胞分化、诱导骨组织再生的能力，目前已广泛应用于骨组织工程研究之中。杨为中等^[12]利用重组人的骨形态发生蛋白2与羟基磷灰石/丝素蛋白支架进行复合，制备新型的骨修复材料，并构建大鼠的颅骨缺陷模型，将复合支架移植于缺损处。通过研究发现，该材料具有良好的生物相容性，并可以促进新骨的形成，是一种潜在的骨修复材料。天然骨组织的主要成分是羟基磷灰石以及胶原，其中，羟基磷灰石具有安全、无毒的优点，且具有多孔性网状结构，孔隙及孔隙率为新生骨样组织的长入提供了场所，保证了各种营养物质的输入，还可以为诱导新骨生成的物质提供所需空间^[13-16]。但羟基磷灰石在力学性能方面相较差，无法达到理想的强度^[17-18]。因此，在临床应用过程中，需要积极的将其与其他材料进行复合应用。胶原是细胞外基质的重要构成骨架，是一种不溶性纤维蛋白。且胶原的来源十分广泛，因为可以将其与羟基磷灰石进行复合应用^[19-21]。然而，这一复合材料在生物活性方面依然存在一定的缺陷，无法获得理想的修复效果。为此，需要对其予以进一步完善。壳聚糖是一种甲壳素衍生物，具有与纤维素相似的高分子线性特征，可以经过一定的方式生物合成，且具备良好的可降解特性^[22-24]。壳聚糖是属于天然多糖中惟一的碱性多糖，为甲壳素脱乙酰基产物，又名甲壳胺或可溶性甲壳质，无毒，具有体内生物降解性和生物相容性。壳聚糖是一种环境友好型的可再生天然高分子材料，有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性将其与其他材料复合起来予以应用，可以很好的改善其力学强度不足^[25-26]。唐晓军^[27]选取2种颗粒大小的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料粉体、纯化壳聚糖粉体、市售纯化学合成羟基磷灰石粉体以及直径1.0 cm、厚0.2 cm块状材料材料对健康成年新西兰大耳白兔进行背部皮下植入后，天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料显示出良好的生物活性、生物相容性、生物安全性和骨传导特性，取得理想的骨缺损修复效果。另外，对于骨移植修复材料而言，为了保证良好的骨修复效果，还需要具备良好的骨诱导性。但是，在使用上述材料联合应用获得复合修复材料之后，在骨诱导性方面尚存在一定的不足之处。为此，需要积极的利用一定的生物活性因子等来进行复合处理。骨形态发生蛋白是一种常用的生物活性因子。骨形态发生蛋白可以在骨形成以及骨折愈合中发挥出十分重要的作用，并可以在骨缺损修复之中发挥出重要的作用^[28-31]。但是，单纯予以骨形态发生蛋白植入容易出现扩散和降解，无法对新骨形成予以持续性的影响，导致对最终的效果产生一定的影响^[32-34]。需要利用一定的载体来维持骨形态发生蛋白的作用浓度和维持时间，以保证其良好的成骨能力^[35]。骨形态发生蛋白7衍生多肽是一种多肽活性分子，具有螺旋状空间结构，且具有活性位点易暴露的特点，可以更好的与支架材料进行复合^[35-42]。因此，将其与上述材料予以复合使用，可以达到很好的效果，有效弥补各自的不足之处^[43]。胡鹏^[44]构建犬甲状软骨缺损模型，利用骨形态发生蛋白-纤维蛋白复合物、骨基质明胶、羟基磷灰石复合物对动物进行甲状软骨缺损移植修复治疗，效果良好，相应的复合物是一种良好的软骨修复材料。

实验在体外环境下利用骨形态发生蛋白7衍生多肽和壳聚糖以及纳米羟基磷灰石和胶原来制备软质再生颅骨修复材料，对实验过程中制备的复合软质再生颅骨修复材料进行扫描电镜观察，可见材料具备多孔结构，呈疏松状态。表明所获得的材料具有良好与天然骨组织疏松多孔结构相似的结构，可以为骨修复提供良好的条件。经体外释放规律观察还发现，体外环境下，骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放量呈现出不断上升的情况，且在第1天出现显著释放，之后保持平稳上升状态。结果表明，在体外环境下，骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放情况基本满足缓释要的需要。实验对24只颅骨缺损模型大鼠，并分别予以单纯壳聚糖/纳米轻基磷灰石/胶原复合材料治疗和复合软质再生颅骨修复材料治疗，6周后经CT三维重建，对照组可观察到缺损区存在轻微片状致密影，与正常骨密度相比相对偏低；而实验组缺损区可观察到存在片状高密度影，且密度与正常骨组织十分接近。12周后，对照组可观察到在骨缺损区域的高密度影出现一定的增强情况，面积也出现增大，大约为骨缺损面积的50%；实验组大则可观察到骨缺损区骨缺损完全愈合的情况。结果表明实验组均达到了较好的骨修复效果。治疗后6周对照组可观察到材料内部仅有少量成骨细胞长入现象。实验组经组织学观察，可见材料内部出现大量成骨细胞长入的情况，且部分材料开始发生降解。治疗后12周，对照组可观察到部分材料发生了降解，并存在未成熟编织骨分散分布的情况。实验可观察到不部分材料均发生降解，并被成熟板层骨替代，仅存少量编织骨。治疗后6周和12周，实验组新骨形成面积大于对照组，表明实验组所使用的材料具有良好的骨诱导性和可降解性，其优良的结构和特性有助于新骨的形成，可以达到理想的骨再生效果。

综上所述，体外环境下制备复合软质再生颅骨修复材料对存在颅骨缺损的大鼠进行修复治疗，可以获得良好的修复效果。但受到动物样本容量等因素的限制，实验结果和相关结论可能存在一定的不足之处，进一步结果，还有待在今后予以分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程