胰岛素样生长因子1诱导骨髓间充质干细胞转化为少突胶质细胞移植修复急性脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胰岛素样生长因子：是一类多功能细胞增殖调控因子，由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链多肽，主要由人肝细胞合成和分泌，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。
少突胶质细胞：少突胶质细胞比星状胶质细胞小，其突起也较小而少，呈珠状，故被称之为少突胶质细胞或寡突胶质细胞。其主要功能是在中枢神经系统中包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助神经电信号的跳跃式高效传递，维持和保护神经元的正常功能。少突胶质细胞的异常除导致中枢神经系统脱髓鞘病变之外，还会导致神经元损伤或精神类疾病，甚至可以引发脑肿瘤。

摘要
背景：脊髓损伤后的治疗和康复是一直困扰医学界的一个难题，其中神经反射通路的重建和再髓鞘化是关键，在其过程中少突胶质细胞发挥着重要作用。
目的：观察少突胶质细胞移植对急性大鼠脊髓损伤的修复作用。
方法：将胰岛素样生长因子1诱导骨髓间充质干细胞转化为少突胶质细胞移植至大鼠损伤脊髓，并设少突胶质细胞移植组和单纯注射生理盐水的对照组作对比。通过斜板实验和BBB评分观察各组行为学变化，脊髓诱发电位检测和免疫组织化学染色观察各组神经功能恢复情况和移植细胞存活情况。
结果与结论：①行为学、脊髓诱发电位和脊髓组织形态变化：移植后4，8周，与对照组相比，诱导分化细胞移植组和少突胶质细胞移植组BBB评分及斜板实验倾斜平面临界角度明显增加(P < 0.05)，脊髓运动和感觉诱发电位潜伏期逐渐下降(P < 0.05)，脊髓损伤区均可见移植并存活的少突胶质细胞，而两组间相比较上述指标均差异无显著性意义；②结果说明：胰岛素样生长因子1诱导骨髓间充质干细胞转化为少突胶质细胞移植至损伤脊髓修复效果较好，能达到少突胶质细胞的移植修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1312-2192(魏芬)

关键词: 干细胞, 移植, 少突胶质细胞, 脊髓损伤, 分化, 胰岛素样生长因子, 骨髓间充质干细胞, 诱导

Abstract:

BACKGROUND: Treatment and rehabilitation of spinal cord injury is a complicated problem, and the reconstruction and remyelination of neural reflex pathways are the essential process, during which oligodendrocytes play an important role in spinal cord injury repair.
OBJECTIVE: To observe the effect of oligodendrocyte transplantation for acute spinal cord injury in rats.
METHODS: Insulin-like growth factor 1 induced bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into oligodendrocytes, and those oligodendrocytes were transplanted into rats with acute spinal cord injury as induced cell transplantation group. Simple normal saline and natural oligodendrocytes were transplanted into the rat injured spinal cord as control group and oligodendrocyte group, respectively. Rat behavioral changes were observed by inclined plane test and Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) scores. Neurological recovery and survival of the transplanted cells was detected and observed using spinal evoked potential and immunohistochemical staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, BBB scores and the critical elevation angle of the incline plane test significantly increased, latencies of spinal motor and sensory evoked potential were on the decline (P < 0.05), and there were no significant differences in above indicators between the two groups at 4 and 8 weeks after transplantation. Moreover, survived oligodendrocytes after transplantation could be found in the lesions of spinal cord in both two groups. In conclusion, insulin-like growth factor 1-induced bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into oligodendrocytes that exact an excellent role in acute spinal cord injury repair after transplantation, which achieve the equal clinical efficacy to the natural oligodendrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Spinal Cord Injuries, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

魏芬，肖秀兰. 胰岛素样生长因子1诱导骨髓间充质干细胞转化为少突胶质细胞移植修复急性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3419-3424.

Wei Fen, Xiao Xiu-lan. Oligodendrocyte transplantation for acute spinal cord injury: insulin-like growth factor 1 induces bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into oligodendrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3419-3424.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠60只，建模过程中死亡12只，最终48只进入结果分析。

2.2 骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化 经诱导分化后，大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征，胞质向细胞核回缩，细胞突起向外延伸，折光性增强，随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。荧光显微镜下显示，半乳糖脑苷脂阳性率为65%，磷脂碱性蛋白阳性率为45%。见图1。

2.3 大鼠一般情况变化 大鼠脊髓损伤后均出现典型的截瘫表现，两后肢瘫痪、肌张力低、肌力0级。移植后2周大鼠的四肢活动无明显差异，移植后两三周，大鼠的双后肢运动功能恢复明显，从移植第4周开始恢复比较缓慢。

2.4 各组大鼠行为学变化 诱导分化细胞移植组，少突胶质细胞移植组和对照组移植后2，4，8周各时间点倾斜平面临界角度值和BBB评分结果见表1。移植后2周，各组大鼠倾斜平面临界角度值和BBB评分增大，但两组间比较差异无显著意义(P > 0.05)。移植4，8周时诱导分化细胞移植组，少突胶质细胞移植组倾斜平面临界角度值和BBB评分较对照组明显增加(P < 0.05)。

2.5 各组脊髓诱发电位变化 移植后随着时间的延长，各组运动和感觉诱发电位潜伏期逐渐下降，移植后4，8周，诱导分化细胞移植组和少突胶质细胞移植组运动和感觉诱发电位潜伏期显著低于对照组(P < 0.05)，见表2。

2.6 各组大鼠脊髓组织BrdU和半乳糖脑苷脂的表达变化 免疫荧光染色结果显示，移植后4周，诱导分化细胞移植组和少突胶质细胞移植组脊髓组织均可见BrdU和半乳糖脑苷脂的表达，见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2012年1月至2013年5月在同济医科大学神经病学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级健康4周龄SD大鼠60只，雌雄不限，体质量250 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。

细胞：大鼠少突胶质细胞由华中科技大学同济医学院提供。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的制备 大鼠颈椎脱臼法处死后，无菌条件下分离大鼠双侧胫骨与股骨。暴露骨髓腔，抽取体积分数10%的DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔，吹打离散细胞，将冲洗液收集于25 cm²培养瓶中，加入DMEM培养液3.0-5.0 mL，重悬细胞种植于25 cm²培养瓶中，培养体系中含DMEM、体积分数10%的胎牛血清、终浓度2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素。37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱内培养，3 d后更换培养液，去除未贴壁细胞，以后每3 d更换培养液1次，待贴壁细胞达90%融合铺满单层时，用质量浓度2.5 g/L的胰蛋白酶消化贴壁细胞，当细胞变圆，细胞间隙增大，细胞胞质回缩，可以停止消化。将细胞悬液转移至无菌离心管中，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，然后用培养液重悬细胞，按 1∶2传代，随着换液和传代细胞逐渐纯化。

1.4.2 少突胶质细胞的分离纯化 根据McCarthy等^[3]的方法，采用振荡分离纯化法和化学限定无血清培养基获得。取出生48 h之内SD大鼠，无菌条件下取大脑，置入PBS中。分离出大脑皮质，剪碎吹打，滤器过滤， 1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入培养基高糖DMEM，含体积分数15%FCS，使细胞充分分离，然后以1×10⁶的浓度接种，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，3 d换液1次。细胞生长七八天后可分为2层，用封口膜封闭培养瓶口，置于37 ℃恒温摇床中，150 r/min振荡2 h后，吸掉上层培养液，去除小胶质细胞。加入培养基高糖DMEM，含体积分数15%FCS，再以250 r/min振荡17-19 h，收集脱落细胞于离心管内，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入培养基高糖DMEM，含体积分数15%FCS重悬细胞，以3×10⁴ L^-¹的细胞浓度接种于24孔培养板。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养 6 h后，改用DMEM/F12条件培养基A继续培养，即可得到纯化的细胞。培养3 d后改用DMEM/F12条件培养基B诱导分化^[4]，可得到成熟的少突胶质细胞。

1.4.3 骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的诱导分化取生长良好的第4代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，离心加入诱导液(Neurobasal A，体积分数1%N₂ Supplemented，质量浓度20 µg/L碱性成纤维细胞生长因子，质量浓度20 µg/L表皮生长因子，20 mmol/L L-Glutamine)，转移至含有盖玻片的培养皿中，细胞数为1×10⁴个/cm²，放入体积分数5%CO₂孵箱中培养48 h后，更换培养液，用含有质量浓度500 µg/L的胰岛素样生长因子1培养液(Neurobasal A，体积分数1%N₂ Supplemented)，培养3 d后，免疫荧光染色检测少突胶质细胞的特异性标志物半乳糖脑苷脂和磷脂碱性蛋白的表达，并收集细胞进行移植准备。

1.4.4 脊髓损伤模型的制作 用改良Allen打击法建立急性脊髓损伤动物模型。大鼠称质量后，体积分数8%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉，手术切口3 cm范围内背部剪毛，将动物俯卧并固定于手术台上，体积分数10%活力碘消毒，铺洞巾，以T₁₀棘突为中心取背部正中切口，长约4 cm，切开皮肤、皮下筋膜，以脊髓为中心显露直径约3 mm圆形区，在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片，用自制重10 g的圆柱状金属棒在细玻璃管的引导下从5 cm高处垂直落下，打击垫片致T₁₀脊髓急性中度挫伤，打击力5 cm×10 g。以双下肢猛烈收缩为有效打击。建模成功后逐层缝合然后逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤。医用手术膜外固定。

1.4.5 分组及干预 将建模成功的48只大鼠随机分为诱导分化细胞移植组，少突胶质细胞移植组，对照组，每组16只，脊髓损伤后9 d原切口进入，调节细胞浓度为4×10⁸ L^-¹，分别注射诱导分化细胞悬液，大鼠少突胶质细胞悬液，生理盐水各5 µL。逐层缝合伤口。不限饮水及进食，人工膀胱排尿3次/d，直至恢复排尿功能。

1.4.6 斜板实验 采用Rivlin方法，在一长方形木制板上垫2 mm的橡胶垫。将大鼠头向前，身体纵轴与斜面板纵轴垂直放置，渐加大木板与水平面间的角度，直至大鼠在原定位置上刚好可以维持5 s(不翻下来)的最大角度。这一角度即为倾斜平面临界角度。移植后2，4，8周分别测定倾斜平面临界角度。

1.4.7 BBB评分 分别于移植后2，4，8周测定各组BBB评分，分值越高恢复越好，由对该评分标准十分熟悉的非本组实验人员进行。

1.4.8 脊髓诱发电位的检测 将受检测的大鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉，切开头颅后部皮肤，剥离骨膜，用电钻在右侧皮质中央后回感觉区相对应的冠状缝后 3 mm，矢状缝旁1 mm处钻1个孔，并暴露左腿胫神经。记录感觉诱发电位和运动诱发电位微波形曲线。

1.4.9 免疫组织化学染色 于移植后4，8周，用40 g/L多聚甲醛心脏灌注大鼠，切取损伤区脊髓，标本沿脊髓横轴切片，进行BrdU和半乳糖脑苷脂免疫双标荧光染色，观察移植的细胞形态。

1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化，各组行为学变化，脊髓诱发电位检测结果和免疫组织化学染色结果。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，组间数据差异比较应用重复测量方差分析法。P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

目前研究发现间充质干细胞具有干细胞可塑性的现象^[7-10]，同时其自身分泌的细胞因子也能影响周围细胞的分化。Alexanian等^[11]研究表明神经干细胞通过旁分泌和细胞间的受体作用，能诱导间充质干细胞向神经干样细胞分化，在体外能分化为神经元和胶质细胞，有研究体外诱导间充质干细胞为许旺细胞修复大鼠坐骨神经获得了满意的效果^[12]。少突胶质细胞与脊髓损伤等中枢神经系统疾病关系密切。少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化，在髓鞘化形成过程中少突胶质细胞发挥着重要作用^[13-15]，为中枢神经系统提供生长因子和神经营养因子等作用。

干细胞的体外化机制目前尚不十分清楚^[16-18]。实验从大鼠骨髓组织中分离出间充质干细胞，并诱导分化为大量表达少突胶质细胞^[19-22]。其中诱导液中的碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子作为促分化因子可能参与间充质干细胞向神经细胞转化的启动，有研究表明成纤维细胞生长因子家族成员在干细胞分化为神经细胞中起重要作用^[23-33]。

实验将骨髓间充质干细胞诱导分化后，表达少突胶质细胞特异标志物的少突胶质细胞移植于大鼠脊髓损伤模型的损伤区，正常的少突胶质细胞移植和生理盐水注射作为对照，发现实验组和少突胶质细胞移植组脊髓功能恢复无显著性差异，细胞移植后2周，各组大鼠倾斜平面临界角度值和BBB分值增大，但组间比较无显著意义。移植后4，8周，诱导分化细胞移植组和少突胶质细胞移植组倾斜平面临界角度值和BBB分值上升较对照组大鼠倾斜平面临界更明显。脊髓诱发电位检测结果显示，潜伏期长短反映神经传递速度，在移植后第4，8周潜伏期逐渐下降，诱导分化细胞移植组和少突胶质细胞移植组与对照组的运动学评分差异有显著性意义。

实验结果表明，骨髓间充质干细胞诱导分化后的少突胶质细胞能在脊髓损伤区存活，使脊髓功能得到部分恢复。其作用机制可能是少突胶质细胞发挥了部分类似少突胶质细胞的功能，形成髓鞘，分泌生长因子和神经营养因子促进神经细胞的存活，使脊髓损伤大鼠的神经功能得到有效的恢复。