PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
基因沉默：双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
PTEN基因：是迄今发现的第一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，该基因的突变失活与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，在细胞的生长发育、信号转导和细胞凋亡中起着重要作用。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死是近年来的研究热点，但是心肌梗死区域的缺血缺氧微环境和早期炎症反应不利于移植细胞的存活，影响治疗效果。
目的：探讨PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的效果。
方法：①SD大鼠骨髓间充质干细胞随机分为3组，空白对照组不进行任何处理，阴性对照组用Lipofectamin2000转染无意义的NCsiRNA，RNAi组用Lipofectamin2000转染PTEN基因特异的siRNA。采用MTT法描绘细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期；②取30只SD大鼠建立心肌梗死模型，随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组、阴性对照组、RNAi组。建模6 h后，使用微量注射器和立体定位仪在左心室前壁梗死区中心注射相应的骨髓间充质干细胞，治疗后4周进行超声心功能检测，采用荧光显微镜观察细胞的存活和增殖情况。
结果与结论：①RNAi组骨髓间充质干细胞在培养各时间点的吸光度值均显著大于空白对照组和阴性对照组；②RNAi组S+G2期细胞占总数的比例显著大于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)；③RNAi组大鼠心肌组织中骨髓间充质细胞数量显著多于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)；④治疗4周，RNAi组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著小于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)；⑤体外实验表明PTEN基因沉默能有效地促进骨髓间充质干细胞的增殖，抑制细胞凋亡；⑥体内实验表明PTEN基因沉默的骨髓间充质干细胞在心肌梗死区域更易存活和扩增，心功能改善明显。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程ORCID: 0000-0002-4913-489X(徐慧敏)

关键词: 干细胞, 移植, 急性心肌梗死, 第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因, 基因沉默, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for myocardial infarction becomes popularized in recent years, but transplanted cells cannot survive and proliferate under early inflammatory reaction or local ischemia/hypoxia microenvironment, eventually hampering the therapeutic outcomes.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of PTEN-silenced bone marrow mesenchymal stem cells on acute myocardial infarction.
METHODS: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were randomly assigned to receive no treatment, NCsiRNA transfection using Lipofectamin2000 or PTEN siRNA transfection using Lipofectamin2000. Cell growth curves were described using MTT method to detect cell cycle using flow cytometry. (2) Thirty Sprague-Dawley rats were selected to prepare myocardial infarction models that were randomized into three groups (n=10 per group): blank control, negative control and RNAi group. Six hours after modeling, bone marrow mesenchymal stem cells transfected with nothing, NCsiRNA and PTEN siRNA were respectively injected into the infarcted center of the left ventricular anterior wall in these three rat groups. After 4 weeks, all rats were subjected to cardiac function detection using echocardiography, and the survival and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in the rats were observed by fluorescence microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other two groups, a significant increase in the absorbance values at different culture time, the proportion of cells in S+G2 phase, and the number of bone marrow mesenchymal stem cells in the myocardial tissue was found in the RNAi group (all P < 0.05). Additionally, the left ventricular ejection fraction and left ventricular shortening fraction were significantly reduced in the RNAi group than the blank control and negative control groups at 4 weeks after cell transplantation (P < 0.05). Both in vivo and in vitro experimental findings showed that PTEN silencing could effectively improve cell survival and proliferation in the infarcted myocardium. Moreover, in the in vivo experiment, an overt improvement in rat’s cardiac function was achieved.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, PTEN Phosphohydrolase, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Gene Silencing, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

徐慧敏，刘玉茹，万琪琳，李彦明，吴昌维. PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3400-3406.

Xu Hui-min, Liu Yu-ru, Wan Qi-lin, Li Yan-ming, Wu Chang-wei. PTEN-silenced bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for acute myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3400-3406.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态 骨髓间充质干细胞散在分布，细胞呈多角形或者长梭形，活力好，可见细胞分裂相(图1)。

2.2 细胞转染情况 流式细胞术检测细胞转染率达到95%，见图2。

2.3 各组细胞生长曲线比较 RNAi组在不同时间点的吸光度值均显著大于其他两组(P < 0.05)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，可见PTEN基因沉默之后，细胞生长显著加快，见表1，图3。

2.4 各组细胞周期比较 经流式细胞仪检测，RNAi组S+G₂期占总数的比例显著大于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。PTEN基因沉默后，细胞周期发生了变化，S期和G₂期细胞比例升高，表明细胞分裂、生长速度增加，见表2，图4。

2.5 实验动物数量分析 纳入研究的30只SD大鼠均进入最终结果分析，未出现死亡或者脱落现象。

2.6 各组心肌梗死模型中的骨髓间充质细胞存活和增殖情况 荧光显微镜观察RNAi组的细胞数量显著多于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3，图5。PTEN沉默后的骨髓间充质干细胞更有利于在心肌损伤局部的存活和扩增。

2.7 心肌组织形态学 正常对照组心脏大体标本局部未见苍白缺血及瘢痕形成，阴性对照组梗死区中可见新生心肌样细胞，呈小岛样分布，形态呈椭圆形且与心肌纤维排列方向一致，RNAi组梗死区可见更多的此类新生心肌样细胞分布，见图6。

2.8 各组治疗前后超声心功能指标变化 与治疗前比较，治疗4周时各组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著下降(P < 0.05)。治疗4周，RNAi组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著小于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察，随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在河南大学淮河医院实验室完成。

1.3 材料 雄性SD大鼠30只，2月龄，体质量180- 270 g，由上海義森生物科技有限公司提供。SD大鼠骨髓间充质干细胞株由上海信裕生物技术有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养 将骨髓间充质干细胞株从液氮中取出，放入水浴锅中，轻轻摇动让细胞快速溶解，用吸管将冻存管中的细胞悬液移至加入DMEM培养液的离心管中，离心，弃上清，添加2-4 mL DMEM培养液进行细胞重悬。将细胞悬液接种至培养瓶中，加入适量培养液，晃动培养瓶使细胞均匀贴壁，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养，第2天进行换液，以后每3 d换液1次，待细胞长到80%-90%汇合时进行传代。

1.4.2 细胞分组和细胞转染 将骨髓间充质干细胞随机分为3组，分别为正常组(空白对照，不进行任何处理)，阴性对照组(用Lipofectamin2000转染无意义的NCsiRNA)，RNAi组(用Lipofectamin2000转染PTEN 基因特异的siRNA)。严格按照说明书操作，利用Lipofectamin2000将PTEN基因特异的siRNA瞬时转染至事先接种在6孔板的骨髓间充质干细胞中，转染3 d时流式细胞仪检测其转染效率。

1.4.3 MTT法描绘生长曲线 将上述3组细胞接种于96孔培养板，每孔2×10³个细胞，分别在培养12，24，48，72 h添加MTT液，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内孵育4 h，弃掉上清液，每孔添加二甲基亚砜，置于摇床中振荡10 min充分溶解结晶物，用酶标仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度值，并按照结果描绘出各组的生长曲线。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期 取各组细胞制备单细胞悬液，体积分数为75%乙醇固定，添加RnaseA和PI工作液，染色，上流式细胞仪检测S期+G₂期细胞比例。

1.4.5 心肌梗死模型建立 取30只大鼠建立急性心肌梗死模型，给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤，分离皮下组织及肌肉，暴露气管，用套管针行气管穿刺，进入气管后，拔除针芯，连接小动物定压呼吸机，实施间歇正压通气，沿胸骨左缘3，4肋间逐层剪开皮肤和皮下筋膜，剪断第4肋，打开胸腔，暴露心脏，利用小圆针及丝线在左心耳下缘约2 mm处结扎冠状动脉左前降支，观察左心室前壁颜色变苍白，收缩力减弱则视为造模成功。

1.4.6 骨髓间充质干细胞移植 将30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组、阴性对照组、RNAi组。建模6 h后，使用微量注射器和立体定位仪在左心室前壁梗死区中心注射5 μL(1×10⁵个)相应的骨髓间充质细胞悬液。

1.4.7 超声心功能检测 治疗前和治疗后4周，用多普勒超声诊断仪以二维超声和M型超声进行心脏功能检测。每只实验动物均在胸骨旁乳头肌水平以短轴形式测量3次，取平均值作为该大鼠的心功能数据，测量指标为左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(LVFS)。

1.4.8 苏木精-伊红染色　骨髓间充质干细胞移植4周后取材，大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开胸腔，迅速取出心脏，制备切片，进行苏木精-伊红染色。
1.5 主要观察指标 ①各组骨髓间充质干细胞的生长曲线。②各组骨髓间充质干细胞S+G₂期细胞百分比。③各组SD大鼠心肌组织形态学变化。④各组SD大鼠心功能指标。

1.6 统计学分析 利用SPSS 19.0软件完成数据处理。计量资料用x(_)±s表示，进行t 检验比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

当前，干细胞移植治疗心肌梗死已经得到了较为广泛的应用，其临床效果及安全性均得到证实^[9-13]。目前，关于骨髓间充质干细胞移植改善心功能的具体作用机制，尚缺乏明确的定论。大多数研究认为可能与骨髓间充质干细胞分化为新的心肌样细胞，达到修复心肌损伤的效果^[14-16]。

经过大量的研究发现，单纯实施干细胞移植治疗心肌梗死的过程中，由于缺血缺氧微环境和早期炎症反应使能够迁移到心肌缺血区域并存活发挥功能的细胞较少，无法获得理想的治疗效果^[17-27]。为提高移植治疗效果，需要采取有效的措施来提高骨髓间充质干细胞在局部的生存和分化。众多学者开始从基因角度入手，通过基因修饰方式对骨髓间充质干细胞进行处理^[28-30]，以提高其生物学性能，更好地耐受缺血、缺氧环境，保证较高的移植后存活率和分化率等。

PTEN基因是具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能有效抑制肿瘤细胞的生长^[31]，该基因还具有十分复杂的分子机制，通过基因沉默促进细胞增殖和更新^[32]。PTEN调节细胞周期的进展是通过抑制细胞周期相关基因来实现的^[33-34]，PTEN基因能通过抑制Akt途径而使Bcl-2蛋白表达减少，从而促进细胞凋亡^[35-39]。实验结果显示，RNAi组骨髓间充质干细胞在培养各时间点的吸光度值均显著大于空白对照组和阴性对照组，说明PTEN基因沉默后，细胞生长速度加快。流式细胞仪检测RNAi组S+G₂期细胞占总数的比例显著大于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)，说明PTEN基因沉默后，细胞周期发生了变化，S期和G₂期细胞比例升高，细胞生长速度增加^[40]。荧光显微镜观察和统计心肌梗死模型中的骨髓间充质细胞存活和增殖情况，RNAi组的细胞数量显著多于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)，表明PTEN沉默后的骨髓间充质干细胞更有利于在心肌损伤局部的存活和扩增。超声心功能检测结果显示，与治疗前比较，治疗4周时各组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著下降(P < 0.05)。治疗4周，RNAi组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著小于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)，表明PTEN沉默后的骨髓间充质干细胞显著改善患者心功能，获得理想的治疗效果。

综上所述，PTEN基因沉默后的骨髓间充质干细胞生长速度增加，体内实验证实，PTEN基因沉默后的骨髓间充质干细胞在心肌梗死区域更易存活和扩增，心功能改善明显。受到实验条件和时间等因素的影响，是否可以通过导入其他一些外源性基因来促进心功能恢复等问题，还需要在以后的研究中予以进一步分析。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程