人胚胎干细胞向内皮细胞的分化诱导

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.007

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胚胎干细胞：是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，胚胎干细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。
胚胎干细胞诱导分化为内皮细胞：国外学者进行了一次实验，首次提出将人胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞，该方法的提出不仅有效促进了胚胎干细胞诱导分化、鉴定血管内皮细胞的研究，同时还能够为血管内皮细胞提供充足的来源，加快内皮细胞在临床中的运用进程。研究显示，利用细胞共同培养技术或添加培养基，将人胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞效果理想，能够获得一定数量的内皮细胞。但该方法需要细胞共同培养，增加了病原污染风险，并且诱导分化过程中难以对靶细胞进行分离、提取。而利用添加生长因子方法诱导分化内皮细胞，虽然能够克服共同培养分化缺陷，但该方法定向分化效率较低，并不能满足临床各个领域需要。

摘要
背景：人胚胎干细胞是一类特殊的细胞，具有自我更新及多向分化潜力，在一定诱导条件下能够分化为内皮细胞。
目的：探讨人胚胎干细胞向内皮细胞分化的条件，研究血管内皮生长因子诱导人胚胎干细胞诱导分化为内皮细胞的效果。
方法：取40代H9细胞进行复苏，采用悬浮培养法制备胚体，培养5 d后转入贴壁培养阶段，分化为拟胚体，添加含50 µg/L血管内皮生长因子的胚胎干细胞培养基进行诱导培养。取诱导分化第2代细胞，进行DiI-Ac-LDL摄取实验；取诱导分化第15代细胞，进行免疫组织化学染色。
结果与结论：①培养1 d时，可见条索或多角形的单层细胞在拟胚体细胞周围呈芽样放射状生长，细胞生长相对迅速，能够与周围集落的细胞相互融合；培养二三天后，悬浮细胞数得到进一步增加，但中心小圆形细胞开始死亡；培养5 d后，拟胚体细胞开始传代，细胞聚集呈现出典型铺路石样外观；②经过诱导分化后，部分人胚胎干细胞能够主动摄取荧光标记LDL，且细胞呈现为红色荧光颗粒；③免疫组化染色显示，诱导分化的第15代人胚胎干细胞呈CD31和FLK-1阳性；④结果表明：人胚胎干细胞在血管内皮生长因子诱导下可分化为内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7941-2037(时洋)

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 人胚胎干细胞, 内皮细胞, 分化诱导, 血管内皮生长因子, 体外培养, 免疫组化, DiI 标记, 内皮细胞特性

Abstract:

BACKGROUND: Human embryonic stem cells exhibit self-renewal and multi-differentiation potential, and can differentiate into endothelial cells under certain induction conditions.
OBJECTIVE: To explore induced conditions of the human embryonic stem cells differentiating into endothelial cells and to investigate the effect of vascular endothelial growth factors on the endothelial differentiation of human embryonic stem cells.
METHODS: After resuscitation, passage 40 human embryonic stem cell lines H9 were subjected to suspension culture to prepare embryos, and after 5-day culture, these cells were cultured in attachment medium to differentiate into embryoid bodies, followed by induction with 50 µg/L vascular endothelial growth factors. Passage 2 and 15 embryonic stem cells after induced differentiation were taken for Dil-Ac-LDL uptake test and immunohistochemical staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: After 1-day culture, cord-like or polygonal monolayer cells around embryoid bodies showed bud-like and radial growth with a relative rapid speed merging into surrounding colonies; at 2-3 days, the number of suspension cells increased further, but the small-round cells in the center began to die; at 5 days, embryoid bodies started to passage, and aggregated cells exhibited typical paving stone-like appearance. Moreover, some human embryonic cells after induced differentiation could actively take up fluorescent labeled LDL, and red fluorescent particles appeared. Additionally, passage 15 embryonic stem cells after induced differentiation could express CD31 and FLK-1. These findings suggest that human embryonic stem cells induced by vascular endothelial growth factors can differentiate into endothelial cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Embryonic Stem Cells, Endothelial Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

时洋，沈军生，毋涛涛，李小飞. 人胚胎干细胞向内皮细胞的分化诱导[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3394-3399.

Shi Yang, Shen Jun-sheng, Wu Tao-tao, Li Xiao-fei. Induced differentiation of human embryonic stem cells into endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3394-3399.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Peiffer I,Barbet R,Hatzfeld A,et al.Optimization of physiological xenofree molecularly defined media and matrices to maintain human embryonic stem cell pluripotency.Methods Mol Biol.2010;584:97-108.
[2] Park Y,Choi IY,Lee SJ,et al.Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines，H1 and HSF6，on human placenta derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev.2010;19(11):1713-1722.
[3] 盖慧,褚建新.人胚胎干细胞建系、培养及体外诱导分化研究现状[J].国际生物医学工程杂志,2006,29(4):209-214．
[4] 徐兰,李斌.人胚胎干细胞建系和培养的研究进展[J].现代生物医学进展,2012,12(32):6393-6398．
[5] Scull CM,Tabas I.Mechanisms of ER stress-induced apoptosis in atherosclerosis .Arterioscler Thromb Vasc Biol.2011;31(12):2792-2797.
[6] Fu HY,Okada K,Liao Y,et al.Ablation of C/EBP homol ogousprotein atteuates ER-mediated apoptosis and cardiac dysfunction induced by pressureoverload.Circulation.2010;122(4):361-369.
[7] Lu Y,Qian L,Zhang Q,et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life Sci.2013;92(24-26): 1165-1173.
[8] Nakatsuka A,Wada J,Iseda I,et al. Visceral adipose tissue-derived serine proteinase inhibitor inhibits apoptosis of endothelial cells as a ligand for the cell-surface GRP78 / Voltage- dependent anion channel complex.Circ Res.2013;112(5):771-780.
[9] Wu XD,Zhang ZY,Sun S,et al.Hypoxic preconditioning protects microvascular endothelial cells against hypoxia / reoxygenation injury by attenuating endoplasmic reticulum stress. Apoptosis. 2013; 18(1):85-98.
[10] 刘城,吴平生,王月刚,等.野生型低氧诱导因子1α对人微血管内皮细胞增殖、迁移及成管的影响[J].中华生物医学工程杂志,2013,19(4):261-265.
[11] 邹多宏,黄远亮.低氧诱导因子1在血管形成及血管重塑中的作用[J].中华口腔医学杂志,2011,46(3):190-192.
[12] Csordas A,Kreutmayer S,Ploner C,et al.Cigarette smoke extract induces prolonged endoplasmic reticulum stress and autophagic cell death in human umbilical vein endothelial cells.Cardiovasc Res.2011; 92(1):141-148.
[13] Rowe C,Goldring CE,Kitteringham NR,et al.Network analysis of primary hepatocyte dedifferentiation using a shotgun proteomics approach.J Proteome Res. 2010;9(5):2658-2668.
[14] Lau TT,Lee LQ,Leong W,et al.Formation of model hepato cellular aggregates in a hydrogel scaffold using degradable genipin crosslinked gelatin microspheres as cell carriers.Biomed Mater.2012;7(6):65003-65010.
[15] De Kock J,Ceelen L,De Spiegelaere W,et al.Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool? Arch Toxicol. 2011;85(6):607-612.
[16] 张瑞,刘明.球形多孔微载体支持下高密度培养人肝细胞L-02的定时形态变化[J].中国组织工程研究,2015,19(12): 1924-1930．
[17] 梁卫,张瑞.三维多孔微载体支持下人肝细胞L-02的培养[J].内蒙古医学院学报,2011,33(2):103-110.
[18] 刘巍,朱新辉,张洁,等.Matrigel凝胶和壳聚糖/磷酸甘油凝胶两种支架体外构建组织工程软骨的比较[J].江苏医药, 2011,37(6):627-629.
[19] 刘芃芃,于文文,程亚楠,等.基于3D细胞培养系统的肺癌类干细胞的分离和鉴定[J].中国肿瘤临床,2014,41(16): 1013-1016.
[20] 张巍,徐宏光,俞云飞.短时间机械循环压力对3D培养脊柱终板软骨细胞的影响[J].皖南医学院学报,2015, 34(1): 1720.
[21] 舒申友,陈露,李雪雪,等.人体外泌汗腺细胞的三维培养及形态学观察[J].中国修复重建外科杂志,2014,28(2): 162-166.
[22] 蔡国徽,韩云竹,唐富山,等．Matrigel三维培养下卵巢癌细胞生长状况观察[J].江苏大学学报(医学版),2015,25(1): 14-18.
[23] Tania M,Hsu MN,Png SN,et al.Perfusion enhanced polydimethylsiloxane based scaffold cell culturing system for multi-well drug screening platform. Biotechnol Prog. 2014;30(2):418-428.
[24] Guo C,He L,Yao D,et al.Alpha-naphthylisothiocyanate modulates hepatobiliary transporters in sandwich- cultured rat hepatocytes. Toxicol Lett. 2014;224(1): 93-100.
[25] Kotani N,Maeda K,Watanabe T,et al.Culture period-dependent changes in the uptake of transporter substrates in sandwich-cultured rat and human hepatocytes. Drug Metab Dispos.2011;39(9): 1503-1510.
[26] Shen K,Leung SW,Huang Y,et al.Notoginsenoside Ft1 activates both glucocorticoid and estrogen receptors to induce endothelium-dependent，nitric oxide-mediated relaxations in rat mesenteric arteries.Biochem Pharmacol. 2014;88(1):66-74.
[27] Zomorodian E,Baghaban Eslaminejad M. Mesenchymal stem cells as a potent cell source for bone regeneration.Stem Cells Int.2012;2012:980353.
[28] 胡峰,赵劲民,李晓峰,等.早期激素性股骨头缺血性坏死模型的建立及半胱天冬酶3活性测定[J].中国中国组织工程研究与临床康复,2012,14(20):3701-3704.
[29] Nagai N,Kubota S,Tsubota K,et al.Resveratrol prevents the development of choroidal neovascularization by modulating AMP-activated protein kinase in macrophages and other cell types.J Nutr Biochem.2014;25(11):1218-1225.
[30] 施展,郭治平.心脑舒通胶囊治疗心肌梗死伴慢性心功能不全 41 例临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2013,11(11):1310-1311.
[31] 张锐东,张澜,毛洪刚,等.激素性股骨头坏死模型中凋亡相关因子的表达[J].中国中国组织工程研究与临床康复, 2013,17(7):1189-1195.
[32] Nold P, Hackstein H, Riedlinger T, et al. Immunosuppressive capabilities of mesenchymal stromal cells are maintained under hypoxic growth conditions and after gamma irradiation. Cytotherapy. 2015;17(2):152-162.
[33] Zhu H,Sun A,Zou Y,et al.Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia～induced and glycogen～based energy prestorage strategy.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2014;34(4):870-876.
[34] Anderson JM,Vines JB,Patterson JL,et al.Osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells synergistically enhanced by biomimetic peptide amphiphiles combined with conditioned medium.Acta Biomater.2011;7(2):675-682．
[35] 狄晓萍,狄维鹏.薯蓣皂苷片治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病疗效观察[J].医学理论与实践,2011,24(23): 2809-2010.
[36] Wang M,Su Y,Sun H,et al.Induced endothelial differentiation of cells from a murine embryonic mesenchymal cell line C3H /10T1/2 by angiogenic factors in vitro.Differentiation.2010;79(1):21-30.
[37] 文娱,陈雪梅,张金娟,等.朝藿定C对去卵巢小鼠雌激素的影响[J].中国现代中药,2012,14(5):15-17.
[38] Zhao L,Li G,Chan KM,et al.Comparison of multipotent differentiation potentials of murine primary bone marrow stromal cells and mesenchymal stem cell line C3H10T1 / 2.Calcified Tissue Int.2009;84(1): 56-64.
[39] Grünewald JK,Ridley AJ.CD73 represses pro inflammatory responses in human endothelial cells.J Inflamm.2010;7(10):1-7.
[40] 刘黎青,高艳霞,周盛年.中药制剂诱导骨髓间充质干细胞多向分化的研究进展[J].山东中医药大学学报,2007, 31(6):520-522.

引言

胚胎干细胞是一类比较特殊的细胞，具有无限增殖及全能分化特性，已成为血管组织工程及细胞替代治疗过程中重要的种子细胞来源之一^[1-3]。血管组织工程是近年来刚刚兴起的一门新学科，它能够为血管损伤性疾病的治疗、修复等提供方法和手段^[4-5]。血管在人体中相对比较重要，其发生、发育不仅对胚胎形成中各个器官的生长发育产生重要作用，并且对于受损机体修复及生殖功能也具有重要意义^[6-7]。但是，由于人体原代血管内皮细胞获取相对比较困难，再加上体外增殖数量和质量相对有限，使得相关学者对于干细胞诱导分化为内皮细胞研究较多^[8-9]。

国外学者进行了一次实验，实验中首次提出将人胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞，该方法的提出不仅有效促进了胚胎干细胞诱导分化、鉴定血管内皮细胞的研究，同时还能够为血管内皮细胞提供充足的来源，加快内皮细胞在临床中的运用进程^[10-11]。研究显示，利用细胞共同培养技术或添加培养基，将人胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞效果理想，能够获得一定数量的内皮细胞^[12-14]。但该方法需要细胞共同培养，增加了病原污染风险，并且诱导分化过程中难以对靶细胞进行分离、提取。而利用添加生长因子方法诱导分化内皮细胞，虽然能够克服共同培养分化缺陷，但该方法定向分化效率较低，并不能满足临床各个领域需要^[15-16]。鉴于上述实验人胚胎干细胞向内皮细胞分化诱导过程中的复杂性及效率较低等缺点，实验主要利用一种简单的贴壁方法，并且采用血管内皮生长因子作为诱导因子，将人胚胎干细胞向内皮细胞分化诱导^[17]。

实验将以血管内皮生长因子作为诱导因子，探讨人胚胎干细胞向内皮细胞分化诱导的条件，研究血管内皮生长因子诱导人胚胎干细胞诱导分化为内皮细胞的效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞形态学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年2至7月在河南理工大学医学院完成。

1.3 材料

1.4 实验方法

人胚胎干细胞的体外培养：取40代H9细胞进行复苏，将其接种在Matrigle包被的6孔培养板中，并向其中加入无血清mTsSR培养基，进行去滋养层细胞培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中。为了保证人体胚胎细胞的未分化状态，采用1 g/L Dispase酶消化后进行机械分离，并根据1∶4比例进行传代，观察细胞的生长情况及细胞形态，在显微镜下及时去除发生分化胚胎干细胞^[18-19]。

血管内皮生长因子下人体胚胎干细胞诱导内皮细胞：采用低黏附培养皿经过悬浮培养方法制备胚体，培养5 d后转入贴壁培养阶段，可执法分化为拟胚体，以50-100 µL/孔的密度置入0.1%明胶预衬的6孔培养板中，以添加50 µg/L血管内皮生长因子的胚胎干细胞培养基进行培养，每天进行1次换液，在倒置显微镜下观察诱导分化情况，每5 d传代1次^[20-21]。

1.5 主要观察指标

DiI-Ac-LDL摄取实验：取成功诱导分化的第2代细胞，根据2×10⁴个/cm²的密度加入24孔培养板中，培养二三天，待细胞融合60%后去除培养基，并加入10 mg/L DiI-Ac-LDL工作液，置于37 ℃、以及分数5%CO₂环境下培养4 h。去除DiI-Ac-LDL工作液，采用PBS进行清洗，向每孔中加入0.3-0.5 mL以PBS1∶1 000倍稀释的DAPI，孵育10-15 min，PBS清洗，在荧光显微镜下进行观察^[22-23]。

免疫组织化学染色检测：取成功诱导分化的第15代胚胎干细胞，待细胞生长融合80%后取出上层清液，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，采用PBS清洗，在体积分数3%H₂O₂条件下孵育10 min，PBS清洗，加入适量的一抗，相关操作步骤必须严格遵循免疫组织化学染色试剂盒要求进行操作、观察^[24]。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较两组数据间存在统计学差异。

讨论

血管组织工程是近年来刚刚兴起的的一门重要的学科分支，而对于其种子细胞来源问题一直是制约血管组织组织工程发展的“瓶颈”，如何采取有效措施解决内皮细胞在体外分离培养过程中产生的“去分化”及“低扩增”现象，不断提高种子细胞的数量和质量，推进血管工程不断发展成为研究热点。干细胞诱导分化技术为种子细胞的来源问题提供了新的思路和方法。通过体外定向诱导分化，能够获得理想的表型，并且结合干细胞本身具备的一些特定，能够保证其在体外进行无限增殖，在理论上能够获得更加理想数量和表型的干细胞源内皮细胞^[25-29]。

虽然在细胞培养过程中存在共同培养等方法，但是拟胚体法仍然是诱导胚胎干细胞最为主要的方法之一。胚胎干细胞在撤出抑制分化因素后，能够形成3个胚层的组织结构，即获得拟胚体细胞^[30]。目前，临床上诱导拟胚体细胞的方法主要有3种，悬滴培养法、悬浮培养法及甲基纤维素半固定培养法。这些方法均能够获得理想的拟胚体细胞，并且大小均一，但不同的培养方法均存在缺点^[31-32]。此次实验中主要采用悬浮培养方法获得拟胚体细胞，该方法操作相对比较简单，成功率也较高，更加适合人胚胎干细胞分化。研究显示，多种细胞因子诱导人胚胎干细胞向内皮细胞分化，采用CD34阳性细胞等进行纯化，虽操作比较复杂，但多种因子之间复杂的相互作用在一定程度上阻碍了内皮分化分子机制研究^[33-34]。研究中采用简单的贴壁方法进行培养，并且采用单一的血管内皮生长因子细胞进行诱导分化^[35]。此次研究中，在采用无血清培养基mTeSR1培养条件下，培养1 d后出现较多小细胞团并出现增加趋势；培养2 d后，形成悬浮生长的较大球状细胞团；培养三四天后可见拟胚体形态，且细胞团比较致密，大小不等，周围悬浮少量单个细胞。同时，将拟胚体细胞种植在浓度为0.1%明胶预衬的6孔板进行1 d培养，能够看见条索或多角形单层细胞在拟胚体细胞周围呈芽样放射状生长。细胞生长相对迅速，能够与周围集落的细胞相互融合，培养二三天后，悬浮细胞数进一步增加，但中心小圆形细胞开始死亡。拟胚体细胞培养5 d后开始传代，细胞聚集呈现出典型铺路石样外观，该研究结果与相关文献报道类似^[36]。

从血管内皮生长因子的功能来说，它是胚胎生长、发育过程中相对比较重要的血管形成调节因子，同时还是内皮细胞生长发育过程中的最为重要的细胞因子，对于血管内皮细胞的分化及发育具有重大意义^[37-38]。血管内皮生长因子能够与机体内的酪氨酸激酶受体血管内皮生长因子R-2相互结合，在特异的γ型磷脂酶C-蛋白激酶C信号转导通路下，激活raf-1蛋白，能够激活MAPK，最终调节和控制内皮细胞分化和增殖，它是人体胚胎干细胞向内皮细胞分化的作为重要的因素之一。本次研究中经过诱导分化后，部分人胚胎干细胞能够主动摄取荧光标记LDL，且细胞呈现为红色荧光颗粒，由此看出该细胞具有与内皮细胞相类似的生物学功能活性^[39]。但临床上对于人胚胎干细胞向内皮细胞分化诱导时，血管内皮生长因子使用量存在较大的争议。相关研究显示，诱导人胚干细胞生产内皮细胞的比例与血管内皮生长因子梯度浓度表现出正相关性，由此看出，血管内皮细胞的发育与血管内皮生长因子的使用剂量呈现出依赖性，且相关文献中采用50 µg/L大剂量进行诱导，并且能够取得人胚胎干细胞向内皮细胞分化诱导^[40]。此次研究中，人胚干细胞诱导分化培养产生15代细胞呈CD31和FLK-阳性。但在后续的研究过程中还应该进一步优化人体胚胎干细胞向内皮细胞分化诱导的条件，确定其准确的机制，从而能够获得更加稳定、可靠的干细胞数量和质量。

综上所述，胚胎干细胞是人体内比较特殊的一类细胞，该细胞和其他细胞相比能够自我更新，多向分化，并且在血管内皮生长因子条件下能够诱导分化为内皮细胞，发挥不同细胞之间的协同作用，能够解决内皮细胞数量和质量问题，具有较高的临床应用价值。