重组腺病毒介导突变型低氧诱导因子1α基因转染脂肪间充质干细胞并促进其增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
低氧诱导因子1α：低氧诱导因子1α是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，对体内局部微环境中的氧浓度敏感。可提高组织和细胞在缺血环境下的生存能力，在促进血管再生，微血管系统的形成方面有重要的意义。
脂肪间充质干细胞：脂肪间充质干细胞作为脂肪组织的一种前体干细胞，它可参与到各种脂肪组织的重建过程，包括生长发育、肥胖、损伤或缺氧后的再修复以及机械力诱导的组织扩张等生理病理过程。

摘要
背景：为了提高移植组织的存活率，多数学者把研究的焦点放在了细胞治疗上，特别是经细胞辅助的脂肪移植领域。
目的：分析三点突变型低氧诱导因子1α转染脂肪间充质干细胞后促进脂肪移植成活率的作用。
方法：①利用目的片段重组三点突变型低氧诱导因子1α基因入腺病毒pAdEasy-1系统，包装病毒并测定滴度；②人脂肪间充质干细胞的培养传代及鉴定；③以3种病毒液连同空白组共分4组进行后续实验(实验组含三点突变型低氧诱导因子1α基因；阳性对照组；阴性对照组；空白组)；将病毒液转染入脂肪间充质干细胞内，通过示踪因子增强型绿色荧光蛋白观察病毒转染效率，检测各组细胞中低氧诱导因子1α基因mRNA和蛋白表达情况；④通过MTT法检测各组脂肪间充质干细胞的增殖情况。
结果与结论：①腺病毒重组体构建成功并包装成功，符合转染要求；②通过成脂诱导、成骨诱导及成软骨诱导鉴定证明脂肪间充质干细胞培养成功，可以作为后续实验的种子细胞；③RT-PCR结果显示，实验组和阳性对照组细胞内低氧诱导因子1α mRNA表达量均明显高于另外2组(P < 0.05)；④Western blot检测显示，实验组蛋白表达相对吸光度值明显高于其他3组(P < 0.05)；⑤实验组转染脂肪间充质干细胞后分裂增殖程度显著增加，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑥结果提示腺病毒介导的三点突变型低氧诱导因子1α基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以在常氧条件下持续表达目的蛋白，同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖，达到一种双赢的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6630-1509(张馨)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 脂肪间充质干细胞, 低氧诱导因子1α, 基因突变, 脂肪移植, 血管化

Abstract:

BACKGROUND: To improve the survival rate of transplanted tissue, most scholars focus on cell therapy, particularly cell-assisted fat grafting.
OBJECTIVE: To analyze the effect of recombinant adenovirus-mediated hypoxia inducible factor 1alpha (HIF1α) mutant on survival rate of transplanted fat particles through transfection of adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Recombinant adenovirus-mediated triple-mutant HIF1α was inserted into an adenovirus pAdEasy-1 system, followed by viral packaging and titer determination. Human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured, passaged and identified, and subsequently transfected with three kinds of viruses and blank vector (experimental group with transfection of the triple mutant of HIF1α; positive control group; negative control group; blank control group). Transfection efficiency was determined using enhanced green fluorescent protein labeling. Additionally, MTT assay was used to detect cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: The recombinant adenovirus was successfully constructed and packaged in line with transfection requirements. Moreover, adipose-derived mesenchymal stem cells were successfully identified by adipogenic, osteogenic and chondrogenic induction and could be used as seed cells for subsequent experiments. RT-PCR results showed that HIF1α mRNA expression in the experimental group and positive control group was significantly higher than that in the other two groups(P < 0.05). Western blot analysis showed that the relative absorbance value in the experimental group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). A significant increase in the cell proliferation was found in the experimental group, significantly different from the other three groups (P < 0.05). Therefore, our findings indicate that transfection of adenovirus-mediated triple-mutant HIF1α not only can sustain the expression of target protein in transfected adipose-derived mesenchymal stem cells under normoxic conditions, but also can promote the proliferation of transfected adipose-derived mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Hypoxia-Inducible Factor 1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张馨，周琳，张晓雷. 重组腺病毒介导突变型低氧诱导因子1α基因转染脂肪间充质干细胞并促进其增殖[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3386-3393.

Zhang Xin, Zhou Lin, Zhang Xiao-lei. Recombinant adenovirus-mediated hypoxia inducible factor 1alpha mutant promotes proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3386-3393.

图/表（结果） 2

2.1 低氧诱导因子1α突变鉴定结果 测序结果显示供体质粒中所携带的低氧诱导因子1α基因编码区402位氨基酸由CCA(脯氨酸)突变成GCA(丙氨酸)，564位氨基酸由CCC(脯氨酸)突变成GCC(丙氨酸)，803位氨基酸由ATT(天冬酰胺)突变成AGC丙氨酸(图1)。

2.2 腺病毒包装结果 HEK293A细胞经腺病毒转染后均观察到有大量绿色荧光蛋白表达并出现相似的细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)(图2，3)。滴度检测结果依次为实验组病毒液1.76×10⁸ pfu/mL，阳性对照组病毒液2.09×10⁸ pfu/mL，阴性对照组病毒液1.92×10⁸ pfu/mL，符合转染要求。

2.3 脂肪间充质干细胞鉴定结果 在成脂诱导培养2周后，细胞内开始出现部分脂滴，同时进行油红O染色鉴定，结果显示：成脂诱导组脂肪间充质干细胞油红O染色阳性，对照组阴性(图4)。在成骨诱导的第14天，通过茜素红染色鉴定可以观察到红色典型钙化结节形态，而对照组的细胞形态仍为成纤维细胞样，大小基本没有变化，茜素红染色均不着色或着色极为虚弱(图5)。在成软骨诱导培养后，脂肪间充质干细胞的形态逐渐由梭形向多角形或多边形转变。诱导14 d后发现软骨细胞结构层清晰，核被染成蓝色，胞浆几乎不着色，基质呈淡蓝紫色，对照组不着色或着色极为虚弱(图6)。

2.4 脂肪间充质干细胞增殖检测结果 各组细胞分别在培养24，48，72，96，120 h后利用MTT法检测细胞的吸光度值，同时绘制增殖曲线。结果提示，阳性对照组及空白组的脂肪间充质干细胞生长速度较慢，两组相比较差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组细胞增殖程度显著增加，相比于另外两组差异有着显著性意义(P < 0.05)，说明三点突变型低氧诱导因子1α可以显著提高脂肪间充质干细胞的增殖(图7)。

2.5 RT-PCR检测结果 实验组和阳性对照组细胞内低氧诱导因子1α mRNA表达两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；阴性对照组和空白组两组低氧诱导因子1α mRNA的表达量非常低，几乎可以忽略，差异也无显著性意义(P > 0.05)；而前两组细胞内低氧诱导因子1α mRNA表达量均明显高于后两组，差异有显著性意义 (P < 0.05，图8)。
2.6 Western blot检测结果 实验组细胞中低氧诱导因子1α蛋白表达明显高于阳性对照组、阴性对照组和空白组(P < 0.05)；而阳性对照组、阴性对照组和空白组3组间差异无显著性意义(P > 0.05，图9)。结果显示，三点突变型低氧诱导因子1α可以在常氧条件下高效表达，有利于促进移植种子细胞的增殖及新血管生成。

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引言

自体脂肪组织移植指的是将患者本身健康部位的脂肪组织移植到发生软组织缺损的部位，进而使得受损移植区域可以达到塑形的疗效^[1-2]。目前自体脂肪移植在临床上已经很广泛的被应用于整形烧伤美容等方面，例如对身体上某个软组织缺损凹陷进行填充修复、乳房缺损及小乳症等美容修复等整形美容领域^[3-5]。然而，随访观察发现，移植后的脂肪组织的存活率相关报道并不十分一致，在移植后1年内脂肪组织的存活率仅在30%- 60%之间。导致移植组织存活率较低的原因为在移植早期，移植的脂肪和本体之间尚未建立充足的血液供应，只能靠周围局部组织液的自行渗出来提供所需的所有养分，而组织液的渗出距离极短，仅可达到100-200 μm，而此时移植物处于严重的缺氧缺血状态，移植中央区很快就出现大量的坏死组织，坏死组织随后被纤维结缔组织所替代进一步导致移植的远期效果也不十分理想，结果常常需要多次手术以保证充足的活性脂肪持续进行充填，影响了其在临床上的进一步推广^[6-8]。综上，在移植后早期及时的建立血供对于移植脂肪的后期存活是必不可少的。

为解决这一问题，提高移植组织的存活率，多数学者把研究的焦点放在了细胞治疗上面，特别是经细胞辅助的脂肪移植领域。截止到目前，采用脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)辅助自体脂肪进行联合移植，被证实为可以有效的提高移植后局部脂肪组织和细胞的存活率^[9]。相比骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)来说，通过普通的抽脂术就可以获得大量的脂肪间充质干细胞被认为是作为辅助脂肪移植的最佳选择^[10]。

只有尽早地在移植区局部构建有效的血管网络，才能为脂肪间充质干细胞分化提供足够的营养支持和代谢保证，加速损伤局部的愈合。研究表明，低氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1，HIF1α)在促血管新生中的作用日益显著，使得近年来在缺血性研究中，被认为是最具有临床应用前景的基因^[11-13]。

综上所述，为了更加直观的研究低氧诱导因子1α在促血管生成中的作用，研究拟采用基因转染技术，构建三点突变的低氧诱导因子1α重组腺病毒表达载体，将其转染脂肪间充质干细胞后研究该基因在脂肪移植过程中的促血管新生作用，进而发挥其促进脂肪移植成活率的作用，并从细胞因子角度阐明影响脂肪移植成活率的分子生物学机制，为提高颗粒脂肪移植成活率提供新的方法和理论依据。

材料方法

1.1 设计 分组对照观察。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年10月在鞍山市第三医院中心实验室完成。

1.3 材料

脂肪组织来源：实验所需的细胞提取来源生物样本均来自于鞍山市第三医院整形科实施抽脂术的患者，患者性别年龄不限，无传染病及内分泌疾病等病史，取脂肪抽吸物的液体部分，冻存于鞍山市第三医院中心实验室液氮库中。患者均签署知情同意书并获得鞍山市第三医院医学伦理委员会批准。

引物：引物设计、合成，基因测序由日本TaKaRa公司完成见表1。

1.4 实验方法
1.4.1 构建突变型重组腺病毒载体以供体质粒和pAdEasy-1试剂盒中的pShuttle为底物建立双酶切反应体系，回收片段大小约为2.5 kb的低氧诱导因子1 α^mu片段和8.9 kb的pShuttle大片段，连接后筛选克隆进行测序鉴定，构建成腺病毒穿梭重组体(pShuttle-HIF1α^mu- IRES-EGFP-1)；再次经PmeⅠ酶切后与BJ5183混合以200 Ω、25 μF、2.5 kV为基础条件实行电击1次，构建成pAd-HIF1αmu-IRES-EGFP-1；超纯提取后经PacⅠ酶切并提纯，以Lipofectamine 2000为媒介转染HEK293A细胞进行包装，利用自身携带的增强型绿色荧光蛋白示踪基因观察病毒包装效果。同理分别包装阳性对照和阴性对照。

1.4.2 人脂肪间充质干细胞的培养及传代 将通过抽脂术所获得的脂肪组织用0.25%浓度的Ⅰ型胶原酶于37 ℃水浴消化30 min，加入完全高糖DMEM培养基(+体积分数10%胎牛血清+1%双抗)终止消化，200目滤网以去除尚未消化掉的组织，1 200×g离心5 min弃上清。1 mL完全培养基重悬细胞沉淀，另加入6倍体积的红细胞裂解液，1 200×g离心5 inin，弃掉上清，再以适量的培养基重悬沉淀，以1×10⁶/皿的密度接种于直径为 10 cm的细胞培养皿中。每3 d换液一次，待细胞密度生长至80%左右以1∶3的比例进行传代。实验后续采用的脂肪间充质干细胞均为第3代细胞。将1.4步骤包装好备用的3种病毒液分别以最佳感染复数(Multiplicity of infection，MOI)=100进行转染，72 h后通过增强型绿色荧光蛋白观察转染效果。

1.4.3 脂肪间充质干细胞鉴定 选取上步获得的第3代脂肪间充质干细胞分别进行成脂诱导分化油红O染色鉴定、成骨诱导分化茜素红染色鉴定以及成软骨诱导分化甲苯胺蓝染色鉴定，以对所培养的细胞进行鉴定，确保移植的细胞为脂肪间充质干细胞。

1.4.4 实验分组 见表2。

1.4.5 脂肪间充质干细胞增殖情况检测 常规培养 24 h后以0.25%的胰酶消化各组细胞(实验组、阳性对照组、空白组)，以2×10³/孔接种于96孔培养板上，每组设10个复孔，继续培养24 h待脂肪间充质干细胞贴壁后每孔再另行加入20 μL(15 g/L)MTT溶液，继续培养4 h后弃掉上清溶液，每孔再加入200 μL细胞培养级二甲基亚砜，振荡10 min后用测定490 nm吸光度值，并计算细胞增殖率。

1.4.6 RT-PCR检测低氧诱导因子1α mRNA表达情况利用Trizol分别提取4组细胞的总RNA，紫外分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀，使其比值分布在1.8-2.0之间，进行后续操作。RT-PCR反应条件：50 ℃，30 min，1个循环；94 ℃，2 min，1个循环；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30个循环。结束后取反应液5μL进行琼脂糖凝胶电泳验证，分析各条带吸光度值，重复3次，取平均相对吸光度值。

1.4.7 Western blot检测低氧诱导因子1α蛋白表达情况 提取各组细胞的总蛋白并检测浓度；分别配制浓缩胶与分离胶，以条件为60 V×30 min，150 V×1 h进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后分离胶放入转膜仪，以100 mA× 30 min为转膜条件进行转膜操作，孵育兔抗人低氧诱导因子1α单克隆抗体(浓度1∶1 000)，4 ℃过夜，孵育二抗及显影液，室温避光30 min，凝胶成像系统分析目的条带与内参的光密度值。重复3次，计算平均相对吸光度值。

1.5 主要观察指标 低氧诱导因子1α基因突变位点；细胞病变效应；脂肪间充质干细胞鉴定及增殖情况；低氧诱导因子1α mRNA表达和蛋白表达情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对所得的实验结果进行统计学分析，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，种子细胞的替代疗法已经成为干细胞研究方面的热点，如何获得理想的种子细胞更是目前亟待解决的问题之一。近年来的许多研究均证实了脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的免疫表型及生物学特性极为相似，相较于骨髓间充质干细胞而言，来源于人体脂肪组织的脂肪间充质干细胞还具有取材方便，来源充足的更多优势，具有实时自我更新的能力以及多向分化的潜能^[14-15]。研究表明实施普通抽脂术所获取的人脂肪中至少有十分之一的含量是脂肪间充质干细胞，并且其具有与骨髓间充质干细胞相似的干细胞特性，是继骨髓间充质干细胞后在成体干细胞中最具有潜力的一类多能干细胞^[16-17]。随着研究的深入，作为脂肪组织工程潜在的最大的成体干细胞库——人脂肪间充质干细胞将成为细胞替代治疗中理想的种子来源。

最近还有研究报道提示，脂肪间充质干细胞十分易于外源性基因的导入，可作为基因治疗的承载细胞之一，不管是质粒载体，还是病毒载体或者其他分子载体，均可将携带的目的基因转染至脂肪间充质干细胞中，同时可以在体内持久并且高效地表达目的因子而不影响其干细胞本身的多向分化潜能的特性^[18-19]。

随着当前对组织损伤修复机制的进一步研究，学者们逐步了解了血管再生在缺损组织再生过程中的重要性。新血管系统构筑成功越早对局部损伤后的愈合就越有利^[20-21]。随着低氧诱导因子1α在促血管新生领域的重要作用，使得其在组织工程领域内的应用前景被一致看好。有研究表明低氧诱导因子1α对于细胞和组织对抗低氧环境，同时提高其在缺血缺氧环境下的生存能力及促进新血管完整再生，微血管系统的完美形成方面有着重要的作用^[22]。但是低氧诱导因子1α仅能在低氧条件下表达并积累，其编码区中的氧依赖性降解结构域(Oxygen dependent degradation domain，ODDD)第402和第564位脯氨酸不能被羟化是细胞产生的低氧诱导因子1α很快被降解(数分钟内)的主要原因^[23-24]。另外有研究报道提示低氧诱导因子1α的转录活性可以由其编码区的第803位天冬酰胺的作用而减低^[25]。以上均提示编码区第402、564位脯氨酸和第803位天冬酰胺都是低氧诱导因子1α的重要结构位点。为了能够发挥低氧诱导因子1α在常氧条件下的最强转录活性，作者获取了将第402、第564和第803位氨基酸同时突变为丙氨酸的质粒，并且为了更加直观的研究突变型低氧诱导因子1α的作用，特构建了三点突变的低氧诱导因子1α重组腺病毒表达载体。

通过对脂肪间充质干细胞内转染的低氧诱导因子1α基因mRNA和蛋白的分别检测结果发现，尽管阳性对照组的细胞中低氧诱导因子1α基因mRNA表达量由了明显的增加，但是在该组蛋白的检测中并没有任何增加，这个结果提示给阳性对照组或许可能引起了低氧诱导因子1α蛋白表达的增加，但是增加的低氧诱导因子1α蛋白由于其正常编码区中的第402和564位脯氨酸依旧存在，发生降解而不能在细胞内蓄积，可以进一步推测出野生型低氧诱导因子1α蛋白在常氧条件下是完全降解的，因而不能发挥其任何促血管生成的功能。而阴性对照组和空白组由于未转染低氧诱导因子1α基因，所以并未检测出mRNA与蛋白的表达，这一点是正常现象。与阳性对照组不同的是，实验组在用Western blot方法检测时能在常氧条件下检测到脂肪间充质干细胞内含有较高水平的低氧诱导因子1α蛋白，说明这种突变的表达载体在常氧条件下在细胞内是可以高效表达并且蓄积的，结果提示降解对低氧诱导因子1α表达的影响主要发生在翻译水平，即蛋白水平；而突变后低氧诱导因子1α在常氧条件下较之野生型更加的稳定而不易被降解。

同时，当转染腺病毒24 h后，就可发现脂肪间充质干细胞的增殖水平相对于阳性对照组以及空白组来说有了一个明显的增加，可以推测出腺病毒承载的突变型低氧诱导因子1α基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达该目的蛋白，同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖，达到了一种双赢的效果，这为后期将突变型低氧诱导因子1α联合脂肪间充质干细胞移植入体内治疗组织缺损奠定了良好的实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程