京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.015

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (21): 3143-3149.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.015

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京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性

刘晨¹，赵泉来¹，王凌挺¹，王弘¹，刘平¹，李斌²，徐宏光¹

¹皖南医学院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001；²苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215007

收稿日期:2016-03-22 出版日期:2016-05-20 发布日期:2016-05-20
通讯作者: 徐宏光，教授，主任医师，皖南医学院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001 李斌，教授，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215007
作者简介:刘晨，男，1989 年生，安徽省巢湖市人，汉族，2015年苏州大学毕业，硕士，主要从事纤维环组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81272048)；安徽省自然科学基金(1308085MH152)

Biocompatibility of rabbit annulus fibrosus-derived stem cells with genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogels

Liu Chen¹, Zhao Quan-lai¹, Wang Ling-ting¹, Wang Hong¹, Liu Ping¹, Li Bin², Xu Hong-guang¹

¹Department of Spine Surgery, Yijishan Hospital of Wannan Medical University, Wuhu 241001, Anhui Province, China; ²Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China

Received:2016-03-22 Online:2016-05-20 Published:2016-05-20
Contact: Xu Hong-guang, Professor, Chief physician, Department of Spine Surgery, Yijishan Hospital of Wannan Medical University, Wuhu 241001, Anhui Province, China Li Bin, Professor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China
About author:Liu Chen, Master, Department of Spine Surgery, Yijishan Hospital of Wannan Medical University, Wuhu 241001, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81272048; the Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 1308085MH152

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脱细胞基质：是运用化学、酶解或机械等方法去除组织中的细胞成分，而保存以细胞外基质为主的其他成分，不仅维持了原有的力学特性和生物学功能，还明显降低了支架的免疫原性。由于其保留了大量的细胞外基质和原有组织的部分结构，具有良好的生物相容性和可降解性，有利于各种细胞的黏附、扩增和分化同时，促进了组织再生，可作为生物组织工程的支架材料。但其力学性能较差，单独作为纤维环组织工程支架材料仍存在不足。
京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶：天然材料壳聚糖具有良好的生物相容性和较强的力学性能，有文献报道其分子结构近似于纤维环重要组成成分——聚集蛋白聚糖，通过生物交联剂京尼平将脱细胞基质与壳聚糖交联制备成水凝胶，可望成为纤维环修复的新型支架材料。

背景：为改善脱细胞基质的力学性能及降解不可控性，前期研究制备了京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶纤维环组织工程支架。
目的：观察京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶和纤维环源干细胞的生物相容性，以及京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的体内降解情况。
方法：制备京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶，通过扫描电镜和接触角测试仪观察水凝胶内部结构及表面亲水性。将第1代兔纤维环源干细胞种植于京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶上3 d，行细胞骨架染色，通过倒置免疫荧光显微镜和扫描电镜观察细胞形态，并绘制细胞生长曲线。将京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶种植于新西兰大耳白兔肌间隙内，4周后观察水凝胶降解情况及与周围组织炎症反应。
结果与结论：京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶支架为多孔网状结构，接触角为(39.94±1.61)°；纤维环源干细胞黏附于京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶支架表面，增殖较快，生长状态良好，说明京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶具有良好的生物相容性。种植于兔体内的水凝胶支架在4周后有所降解，周围肌肉组织有炎症细胞存在。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-4105-7823(徐宏光)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 纤维环组织工程, 脱细胞基质, 壳聚糖, 水凝胶, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: To improve the mechanical properties and uncontrollability of degradation of decellularized matrix, we manufactured genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogels as annulus fibrosus tissue-engineered scaffold.

OBJECTIVE: To observe the biocompatibility of annulus fibrosus-derived stem cells with genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogels, and the degradation of hydrogels in vivo.

METHODS: Genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogel scaffolds were prepared, and the internal structure and hydrophilic property of hydrogels was detected by scanning electron microscopy and contact angle meter, respectively. Afterwards, passage 1 rabbit annulus fibrosus-derived stem cells were seeded on the scaffolds for 3 days, cell morphology was observed by inverted immunofluorescence microscopy and scanning electron microscopy after cytoskeleton staining, and additionally, curve of cell growth was obtained. In the meanwhile, the scafflods were transplanted into the intermuscular space of New Zealand white rabbits, and the degradation and inflammatory reaction of the hydrogels were observed after 4 weeks.

RESULTS AND CONCLUSION: The prepared hydrogel scaffold showed porous and network structure and the contact angle was (39.94±1.61)°; annulus fibrosus-derived stem cells adhered well on the scaffold surface with a faster growth rate. Furthermore, at 4 weeks after transplantation, the hydrogel in vivo was degraded, and inflammatory cells appeared. These findings indicate that genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogels have good biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Hydrogel, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘晨，赵泉来，王凌挺，王弘，刘平，李斌，徐宏光. 京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(21): 3143-3149.

Liu Chen, Zhao Quan-lai, Wang Ling-ting, Wang Hong, Liu Ping, Li Bin, Xu Hong-guang. Biocompatibility of rabbit annulus fibrosus-derived stem cells with genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogels[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(21): 3143-3149.

图/表（结果） 6

2.1 纤维环源干细胞形态原代兔纤维环源干细胞在含有体积分数20%胎牛血清的DMEM-LG培养基中生长，经过3 d即可看到有细胞集落形成，见图1A；7 d以后可见细胞集落明显增大，细胞呈梭形，见图1B。

2.2 水凝胶形态及表征室温下静置48 h后可见水凝胶形成，呈胶冻状，有弹性，见图2A；通过接触角测试仪可得出所得水凝胶的接触角为(39.94±1.61)°，具有较好的亲水性，见图2B；扫描电子显微镜可以看出，水凝胶内部呈孔洞样网状结构，易于细胞向内生长，见图2C。

2.3 纤维环源干细胞与水凝胶共培养的细胞骨架染色倒置免疫荧光显微镜下观察兔纤维环源干细胞在水凝胶及空白培养板上的细胞骨架染色(绿色荧光显示鬼笔环肽染色的细胞骨架，蓝色荧光显示DAPI染色的细胞核)，结果显示细胞在水凝胶表面呈梭形生长，细胞生长状态良好，见图3。

2.4 纤维环源干细胞与水凝胶共培养的的电镜观察兔纤维环源干细胞在水凝胶上培养3 d后，扫描电镜下可见水凝胶上的细胞形态饱满，平铺于水凝胶表面，细胞与细胞之间也相互联系，见图4。

2.5 纤维环源干细胞与水凝胶共培养的增殖曲线检测水凝胶组和空白对照组细胞均有增殖趋势，水凝胶组培养第1，3，5，7天的A值均大于空白对照组，说明细胞在水凝胶上生长良好，细胞与水凝胶的生物相容性好，见图5。

2.6 京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的体内降解检测置入体内4周后，京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶在兔体内有所降解，见图6A，通过苏木精-伊红染色可以发现，水凝胶周围有炎症细胞存在，见图6B。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验与对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至7月在苏州大学骨科研究所及皖南医学院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：6月龄雄性新西兰大耳白兔5只，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号：SCXK(苏) 2012-0008。实验过程对动物的处置和实验操作符合科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》。家猪购于普通市场。

1.4 实验方法

兔纤维环源干细胞的提取：无菌条件下取出6周龄新西兰白兔T₁₀-L₅脊柱，用无菌刀片完整取出各节段的椎间盘，将其放入含有5%双抗(100 U/mL青霉素和 100 mg/L链霉素)的DMEM-LG培养基中。将椎间盘移至超净台中，移除髓核，获得的纤维环组织用无菌PBS清洗3遍，将其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织颗粒，放置于37 ℃和体积分数5%CO₂的培养箱中，用Ⅰ型胶原酶消化，以200个/cm²的密度接种于直径为10 cm的培养皿内，放置于37 ℃和体积分数5%CO₂的培养箱中培养。每3 d换1次液，当细胞达到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代或用于后续实验^[7]。

京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的制备及表征：将猪纤维环内侧的髓核组织及外侧筋膜脂肪组织剔除干净，用PBS洗3次，将纤维环组织剪碎成 1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，放于研钵中，加入液氮冷冻使组织僵硬，用研钵将组织进一步碾碎；加入0.25%胰酶溶液，放于37 ℃恒温振荡器中消化24 h，每4 h换1次胰酶，PBS洗3次，每次30 min；然后加入核酶溶液(含50 U/mL DNase和1 U/mL RNase的 10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5)，37 ℃恒温振荡器消化12 h；最后用1% Triton X-100处理 24 h；PBS洗6次，每次8 h；2 000 r/min离心10 min，将所得的沉淀用3%醋酸溶液溶解，所得脱细胞纤维环基质溶液存放于4 ℃冰箱备用^[8]。

称取1.5 g壳聚糖粉末，用100 mL 3%醋酸溶液溶解，制备成质量分数为1.5%的壳聚糖溶液；称取0.2 g京尼平粉末溶于10 mL体积分数75%乙醇溶液，制备成质量分数为2%的京尼平溶液，放置于4 ℃冰箱备用。将3 mL壳聚糖溶液和3 mL脱细胞纤维环基质溶液混合，再加入1 mL京尼平溶液在磁力搅拌器上搅拌30 min，取2 mL混合溶液加入6孔细胞培养板中，室温下静置48 h。所得水凝胶在冷冻干燥机内冷冻干燥24 h，在电子显微镜下观察水凝胶结构。所得水凝胶支架制备完成后，用KRÜSS DSA25接触角测试仪来通过去离子水气泡法来测定支架的接触角，取5个样品进行测试，取平均值作为该样品的接触角^[9]。

纤维环源干细胞与水凝胶共培养的细胞骨架染色：将京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶制备成24孔板大小，放置于24孔板中，用去离子水漂洗24 h后放置于超净台中，紫外灯灭菌2 h后，用无菌PBS清洗2次。取第1代兔纤维环源干细胞，以5 000个/孔的密度接种于水凝胶上，培养3 d后，通过细胞骨架染色观察干细胞在其上黏附及增殖情况(设置空白培养板)，具体方法如下：每孔用PBS清洗2次，40 g/L冰冷多聚甲醛固定15 min后，再用PBS洗2次，每次5 min；弃去PBS，每孔加入5 mg/L的FITC-Phalloidin溶液200 µL，染细胞骨架，避光条件下孵育5 min；PBS洗3次，每次5 min；弃去PBS后每孔加入5 mg/L DAPI溶液200 µL，染细胞核，置于避光处5 min；PBS洗3次，每次5 min，倒置免疫荧光显微镜下观察细胞形态。

纤维环源干细胞与水凝胶共培养的电镜观察：纤维环源干细胞在水凝胶上培养后第3天时，通过扫描电镜观察细胞在支架上形态，具体方法为：将干细胞-水凝胶支架用PBS清洗2次，然后用2.5%戊二醛固定2 h，随后分别用体积分数50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液和无水乙醇依次梯度脱水10 min，在电镜下观察细胞形态。

纤维环源干细胞与水凝胶共培养的增殖曲线检测：取第1代纤维环源干细胞，以2 000个/孔的密度接种于96孔板中的水凝胶支架上，以空白培养板作为对照组。在第1，3，5，7天用MTS试剂盒测定细胞增殖情况，绘制细胞增殖曲线图，具体操作为弃去每孔培养基，PBS洗2次，每孔加入200 µL PBS和20 µL MTS试剂，放置于37 ℃培养箱孵育4 h后，移取150 µL上清液至另一96孔空白板中，在紫外分光光度仪中读取490 nm处吸光度值，并绘制生长曲线。

京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的内降解检测：将京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶制成直径为1 cm左右圆柱状，埋置于2只新西兰大耳白兔椎旁肌肉内，4周后处死动物，观察水凝胶在体内降解情况及与周围组织炎症反应。

1.5 主要观察指标京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶和纤维环源干细胞的生物相容性，以及京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的体内降解。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

纤维环是椎间盘的重要组成部分，其功能主要是维持髓核压力，限制髓核突出。纤维环组织工程在椎间盘退行性疾病的治疗上已越来越受到重视。种子细胞和支架是构成组织工程化纤维环的重要组成部分。在以往的研究中，纤维环组织工程的种子细胞主要是纤维环细胞和骨髓间充质干细胞，二者应用虽然较为广泛但存在弊端^[10-13]。对于纤维环细胞而言，研究者需要通过有创穿刺获得，并且需在体外培养获得大量纤维环细胞，研究表明纤维环细胞在体外二维培养的过程中会导致Ⅱ型胶原和细胞形态的丢失^[14-15]；骨髓间充质干细胞虽然被广泛应用于各类组织工程中，但到目前未有任何研究表明骨髓间充质干细胞能诱导分化成纤维环细胞^[16]。而此次研究中所用的纤维环源干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，尤为重要的是，其来源于纤维环组织，因此更易于向纤维环细胞分化。

目前应用于纤维环组织工程的支架包括天然材料，有丝素蛋白^[10,17]、琼脂糖^[18]、藻酸盐^[19-20]，脱细胞基质和聚合物如聚氨酯^[21-24]、聚己内酯等^[25]。其中，脱细胞基质作为体内环境中的细胞外基质，以其调控细胞的功能诸如增殖和分化等越发吸引研究者的注意。脱细胞基质是运用化学、酶解或机械等方法去除组织中的细胞成分，而保存以细胞外基质为主的其他成分，不仅维持了原有的力学特性和生物学功能，还明显降低了支架的免疫原性。由于其保留了大量的细胞外基质和原有组织的部分结构，具有良好的生物相容性和可降解性，有利于各种细胞的黏附、扩增和分化同时，促进了组织再生，可作为生物组织工程的支架材料。不仅如此，脱细胞基质还可以在体外环境中提供细胞在体内生长相似的微环境。因此已被经广泛应用于诸如骨^[26]、膀胱^[27]、血管等组织工程中^[28]。

脱细胞纤维环基质来源于纤维环组织本身，经过脱细胞处理之后降低了其免疫原性，不仅保留了结构更接近于实际纤维环的纤维网状结构，而且保留了调控细胞生长的生长因子和细胞因子，因此更加有利于该组织来源的种子细胞——纤维环源干细胞的生长。依据脱细胞肌腱基质的制备过程，采用液氮反复冻融和胰酶消化等物理化学方法，彻底去除纤维环组织里的细胞，获得了脱细胞纤维环基质，前期研究表明，相比于空白培养板而言，兔纤维环源干细胞更易在脱细胞纤维环基质上黏附，并在其上较快增殖。但脱细胞基质力学性能较差，同时还受制于生物学变异情况，如依赖宿主年龄、组织来源和处理具体方法，仍不能单独作为纤维环组织工程支架材料，限制了其在纤维环组织工程中的应用，因而需要适宜的材料加强其力学性能。相比而言，天然材料壳聚糖具有良好的生物相容性和较强的力学性能，有文献报道其分子结构近似于纤维环重要组成成分——聚集蛋白聚糖，通过生物交联剂京尼平将两者交联制备成水凝胶，可望成为纤维环修复的新型支架材料^[29]。实验中，通过干细胞增殖速率检测，可得出兔纤维环源干细胞在水凝胶支架上增殖明显快于在细胞培养板上的生长速率，分析可能是由于以下原因引起：其一，所制备水凝胶具有亲水性，细胞易于黏附于支架表面；其二，水凝胶支架具有多孔网状结构，细胞向支架内生长。

在体内降解实验中，4周后水凝胶在兔体内发生了降解。研究表明，脱细胞基质及壳聚糖都具有良好的降解性能，通过生物交联剂京尼平将两者交联制备成水凝胶，置入兔背部肌肉内4周后水凝胶也发生了降解。通过苏木精-伊红染色可见，周围有炎症细胞浸润，主要是中性粒细胞及淋巴细胞等。以往的研究表明，壳聚糖移植部位会引起置入处局部炎性细胞的浸润，有学者认为局部中性粒细胞的浸润与壳聚糖自身性能相关，推测可能是壳聚糖或其单体与中性粒细胞表面受体相互作用引发这一现象^[30]。在研究中，作者推测局部炎性细胞浸润不仅与壳聚糖有关，同时考虑亦有可能是溶解脱细胞基质及壳聚糖的醋酸溶液引起的局部炎症反应。而普遍认为良好的生物材料最基本的要求是在置入后无明显全身及局部不良反应。因此，在接下来进一步的研究中，要着重解决水凝胶置入体内引发的炎症反应这一问题。

作者此次实验分离提取兔纤维环源干细胞，将其接种于京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶上，通过电子扫描显微镜可以观察到干细胞在水凝胶上黏附较好；通过细胞骨架染色可以观察到干细胞在水凝胶上增殖较快。实验在体内仅仅进行了降解实验，未来需进一步将水凝胶支架置入椎间盘退变实验动物模型体内，观察干细胞-水凝胶支架复合体材料对纤维环修复的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性

Biocompatibility of rabbit annulus fibrosus-derived stem cells with genipin cross-linked decellularized annulus fibrosus matrix/chitosan hydrogels

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