瑞舒伐他汀联合脐血间充质干细胞移植改善急性心肌梗死后心功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
瑞舒伐他汀：是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂。HMG-CoA还原酶抑制剂是转变3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A为甲戊酸盐(胆固醇的前体)的限速酶。瑞舒伐他汀的主要作用部位是肝(降低胆固醇的靶向器官)。瑞舒伐他汀增加了肝低密度脂蛋白细胞表面受体数目，促进低密度脂蛋白的吸收和分解代谢，抑制了极低密度脂蛋白的肝合成，由此降低极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白微粒的总数。
热休克蛋白70：相对分子质量70 ku的热休克蛋白(诱导型)在正常细胞中水平较低，在应激状态下可明显升高，是热休克蛋白研究中最多的一种。正常情况下热休克蛋白70位于胞浆内，受到热休克刺激时，核内热休克蛋白70迅速增加，浆内只有少量存在，细胞处于恢复阶段时，核内的热休克蛋白70消失，浆内仍有低水平热休克蛋白70表达。

摘要
背景：近年来通过干细胞移植诱导梗死区心肌细胞的再生用以治疗急性心肌梗死后心功能不全，成为较为热议的一种新的治疗手段。
目的：观察瑞舒伐他汀联合脐血间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后心功能的改善作用。
方法：选取45只SD大鼠采用结扎左冠状动脉前降支方法制备心肌梗死模型，随机分为模型组、脐血间充质干细胞移植组和联合组，每组15只。大鼠冠脉结扎后第7天，脐血间充质干细胞移植组及联合组经尾静脉注射脐血间充质干细胞悬液300 μL(15.0×10⁸个细胞)，模型组注射相同剂量LG-DMEM培养液，联合组给予瑞舒伐他汀1 mg/kg灌胃×28 d(从术后第1天开始灌胃，1次/d)，脐血间充质干细胞移植组及模型组同步灌胃相同剂量的生理盐水。造模后5周(细胞移植4周)采用彩色多普勒超声仪检测心功能改善情况，酶联免疫吸附法检测血浆Lp-PLA2水平，苏木精-伊红染色观察心肌组织病理变化；Western blot方法检测心肌梗死区热休克蛋白70表达。
结果与结论：①联合组大鼠的左心室射血分数、左心室收缩末压明显高于脐血间充质干细胞移植组(P < 0.05)，脐血间充质干细胞移植组明显高于模型组(P < 0.05)；联合组大鼠的左心室舒张末压明显低于脐血间充质干细胞移植组(P < 0.05)，脐血间充质干细胞移植组明显低于模型组(P < 0.05)；②联合组Lp-PLA2水平明显低于脐血间充质干细胞移植组(P < 0.05)，脐血间充质干细胞移植组明显低于模型组(P < 0.05)；③联合组梗死区的心肌细胞数量较模型组、脐血间充质干细胞移植组明显增加；④心肌梗死区HSP70蛋白表达在联合组明显升高，各组间的表达差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，瑞舒伐他汀联合脐血间充质干细胞移植干预后能确切改善心肌梗死大鼠心功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7125-4281(王艳丽)

关键词: 干细胞, 移植, 瑞舒伐他汀, 脐血间充质干细胞, 细胞移植, 急性心肌梗死, 心功能

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, it has been a hot topic that stem cell transplantation is used to improve cardiac insufficiency after acute myocardial infarction by inducing regeneration of cardiomyocytes in the infarction regions.
OBJECTIVE: To observe the effect of rosuvastatin combined with umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation on rat cardiac function after acute myocardial infarction.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were enrolled to prepare myocardial infarction models by ligaturing the left anterior descending coronary artery. Then they were equivalently divided into model group, transplantation group and combination group. At 7 days after modeling, rats in the combination group were given injection of 300 μL umbilical cord blood mesenchymal stem cells (15.0×10⁸) via the tail vein and by gavage once a day for 28 days with 1 mg/kg rosuvastatin; rats in the transplantation group and model group were injected with 300 μL umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension through the tail veins or the same amount of LG-DMEM medium, respectively, followed by intragastrical administration of the same amount normal saline. At 5 weeks after modeling, indexes of cardiac function, level of plasma Lp-PLA2 and heat shock protein 70 in the infarction regions were detected by color Doppler ultrasound, enzyme-linked immunosorbent assay and western blot assay, respectively. In addition, pathological changes of myocardial tissues were observed using hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Left ventricular ejection fraction and left ventricular end-systolic pressure were significantly higher in the combination group than in the transplantation group as well as higher in the transplantation group than the model group (P < 0.05); compared with the transplantation group, left ventricular end-diastolic pressure was significantly decreased in the combination group, but significantly increased in the model group (P < 0.05); the number of cardiomyocytes in the infarction regions was significantly higher in the combination group than the other groups. Additionally, expression of heat shock protein 70 in the infarction regions was significantly increased in the combination group (P < 0.05). To conclude, rosuvastatin combined with umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation can significantly improve rat cardiac function after myocardial infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors, Cord Blood Stem Cell Transplantation, Myocardial Infarction, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王艳丽，李金峰，王艳萍，高明. 瑞舒伐他汀联合脐血间充质干细胞移植改善急性心肌梗死后心功能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2796-2802.

Wang Yan-li, Li Jin-feng, Wang Yan-ping, Gao Ming. Rosuvastatin combined with umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation improves cardiac function after acute myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(19): 2796-2802.

图/表（结果） 5

2.1 脐血间充质干细胞的形态 原代培养的细胞为圆形，4-7 d后开始贴壁，最初散在分布，培养7 d左右时，逐渐伸出突起，细胞呈长梭形或多角形，部分细胞呈集落状生长，随着培养时间延长，成纤维样的短梭形细胞占优势，也有一部分为多角形。培养八九天时，细胞铺满培养瓶底面，呈漩涡状生长，漩涡中心的细胞为复层生长。三四周时细胞生长可达到80%融合。细胞传至第2代，杂细胞生长则受到明显抑制，细胞形态为较单一的成纤维样细胞，呈漩涡样生长，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD90及CD105阳性，脐血间充质干细胞均一性好，纯度达95%以上，见图1。

2.2 实验动物数量分析 纳入实验45只大鼠，均进入结果分析，中途无脱落。

2.3 心功能指标 细胞移植4周后，联合组大鼠的左室射血分数、左室收缩末压明显高于脐血间充质干细胞移植组(P < 0.05)；脐血间充质干细胞移植组明显高于模型组，联合组大鼠的左室舒张末压明显低于脐血间充质干细胞移植组，脐血间充质干细胞移植组明显低于模型组(P < 0.05)，见表1。

2.4 血浆Lp-PLA2水平 各组大鼠在急性心肌梗死后的第1天，模型组血浆Lp-PLA2水平均轻微升高，与脐血间充质干细胞移植组、联合组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)；在移植14 d后，联合组 Lp-PLA2水平明显低于模型组及脐血间充质干细胞移植组，脐血间充质干细胞移植组Lp-PLA2水平又低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，此结果可提示血浆 Lp-PLA2是预测梗死后心功能一个较好的指标。

2.5 组织学观察大鼠梗死心肌病理变化 病理切片可见模型组梗死区的心肌细胞排列不整齐，肌细胞数量减少，细胞核大小不甚规则，细胞分界不清楚；联合组梗死区的心肌细胞数量较模型组、脐血间充质干细胞移植组明显增加。各组大鼠梗死灶切片病理变化见图2。

2.6 Western blot检测心肌梗死区HSP70蛋白表达 细胞移植4周后，联合组心肌梗死区HSP70蛋白表达较模型组、脐血间充质干细胞移植组有明显升高，各组间的表达差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

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引言

心功能不全是指由心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等各种原因引起心肌结构和功能的变化，导致心室泵血或充盈功能低下，心排血量不能满足机体的需要，组织、器官血液灌注不足，并出现肺循环和(或)体循环淤血的一种病生理状态。存活心肌细胞数目的减少以及由此产生的心室重构是心功能不全的直接原因^[1]。心肌细胞损伤或坏死后不能再生，在坏死区仅遗留瘢痕组织来替代坏死组织，心肌梗死的药物、介入等治疗措施未能达到心肌细胞再生的效果。针对急性心肌梗死后心肌细胞如何再生，亟需研究新的治疗方法进行探索，近年来通过干细胞移植诱导梗死区心肌细胞的再生用以治疗急性心肌梗死后心功能不全，成为较为热议的一种新的治疗手段，已有多个相关干细胞在心肌再生方面的研究成果丰硕^[2-4]。人脐血中的间充质干细胞属全能干细胞，在心肌梗死治疗方面潜能无限。研究发现他汀类药物除了可以调节脂类代谢，还能够改善心肌纤维化，抑制心室重构，从而起到保护心血管的作用^[5]。Tang等^[6]经过阿托伐他汀1个月的治疗心室重构得到逆转并使心功能得到改善。瑞舒伐他汀作为新型的他汀类药物，对于调脂、降低炎性细胞因子和炎症标志物表达水平具有显著临床效果^[7]。实验旨在探讨脐血间充质干细胞移植联合瑞舒伐他汀干预对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响，为干细胞在心肌梗死领域的进一步探索提供实验数据及理论依据。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2012年4月至2014年12月在河北医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料 健康纯系成年SD大鼠45只，二三个月龄，雌雄不限，体质量为165-220 g，购自君科(南京)生物工程有限公司，动物质量合格证号：SCXK(冀) 20050001，饲养于河北医科大学动物实验中心，饲养温度20- 25 ℃，相对湿度(57±3)%，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠急性心肌梗死模型的建立 按文献[8]报道，经腹腔注射10%水合氯醛将实验大鼠麻醉，仰卧位固定于操作台上，经口插管并连接小动物呼吸机。术区消毒后沿胸骨左缘纵行逐层切开并分离皮下组织、心包，暴露心脏，于左心耳下缘1 mm处以6-0慕丝线结扎左冠状动脉前降支。模型制作成功标准：大体观察见左心室心肌变苍白，心肌活动减弱，心电记录仪提示胸导ST段弓背向上抬高。探查无明显出血后逐层关胸，逐次拔出气管插管并脱呼吸机。

1.4.2 人脐血间充质干细胞的培养 在无菌环境下取健康产妇的新鲜脐带及胎盘组织的新鲜血，根据参考文献[9]用含肝素钠抗凝剂的PBS洗2次，加入1︰1的D-Hank’s并混匀，将混合液缓慢放入淋巴细胞分离液中，以2 000 r/min离心20 min，摄取上层的白色细胞，加D-Hank’s后吹打，再以1 000 r/min离心5 min，弃上清，将细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养基中。培养48 h后贴壁，72 h后换液去除悬浮细胞，每隔4 d换液1次。待细胞融合至80%-90%后，吸出培养液，PBS洗2次，用0.25%胰酶消化3 min，加入Mesencult培养基中止消化，按1︰2进行传代，传至3代以上的细胞备用。

1.4.3 动物分组及各组处理 急性心肌梗死模型制备成功后，完全随机分组法分为3组：脐血间充质干细胞移植组、联合组(脐血间充质干细胞尾静脉移植+瑞舒伐他汀)、模型组，每组15只。大鼠冠脉结扎术后第7天，取脐血间充质干细胞悬液用LG-DMEM调整细胞浓度至5.0×10⁹ L^-¹。各组大鼠以上述相同方法麻醉后，脐血间充质干细胞移植组及联合组经尾静脉移植注射脐血间充质干细胞悬液300 μL (共15.0×10⁸个细胞)，模型组注射同剂量LG-DMEM培养液，联合组给予瑞舒伐他汀1 mg/kg灌胃×28 d(从术后第1天开始灌胃，1次/d)，脐血间充质干细胞移植组及模型组同步灌胃相同剂量的生理盐水，大鼠麻醉复苏后放回笼内继续饲养。

1.4.4 心功能测定 急性心肌梗死造模后35 d(细胞移植后4周)，各组大鼠均以上述相同方法进行麻醉，应用彩色多普勒超声仪测定各组大鼠的左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LVEDP)，根据公式算出射血分数(LVEF)：LVEF(%)=[(LVEDP)³-(LVESP)³]/(LVEDP)³× 100%。参照文献[10]步骤，经颈正中逐层切开暴露右颈动脉，以PE50小鞘管穿入右侧颈动脉，逆行血流将传感器送至左心室，远端连接生物医学信号采集处理系统，检测左室收缩末压(LVESP)及左室舒张末压(LVEDP)。各组均连续测量并记录5个心动周期，所得数据计算平均值。

1.4.5 酶联免疫吸附法检测血浆Lp-PLA2水平 急性心肌梗死造模后21 d(细胞移植后2周)，尾静脉取血，分离血浆，采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定Lp-PLA2水平。按文献[11]步骤，将酶标包被板固定，设以待测样本孔、标准品孔和空白对照孔，将标准品50 μL加入标准品孔中，待测样本孔加入待测样本50 μL，每孔均加入酶标工作液100 μL，空白对照孔不加。置于37 ℃恒温箱内静置60 min，离心去除洗涤液，并于吸水纸上拍干。每孔添加显色剂显影，取出酶标板，加终止液50 μL终止反应，酶标仪调整至450 nm波长测量各孔吸光度值，应用回归方程计算出待测样品浓度。

1.4.6 苏木精-伊红染色 急性心肌梗死造模后35 d (细胞移植后4周)，麻醉状态下处死动物，取原梗死区心肌制成5 μm石蜡切片，二甲苯及梯度乙醇脱蜡处理，苏木精染色，流水冲洗，盐酸乙醇处理，流水冲洗返蓝，体积分数为95%乙醇浸渍数秒，伊红染色，脱水封固，显微镜下观察。

1.4.7 Western blot法检测心肌组织HSP-70表达量 急性心肌梗死造模后35 d(细胞移植后4周)，麻醉状态下处死动物，取坏死区心肌组织并提取总蛋白，PBS冲洗3次，加入150 μL RIPA裂解液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，取上样总蛋白50 μg，经8% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转法转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉在室温下封闭2 h，加入HSP-70多克隆一抗，置于4 ℃摇床上过夜。将膜用三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS-T)持续洗涤10 min，重复3次，洗膜后再加入二抗(1︰5 000)。暗室中曝光，DAB显色，采用超敏ECL化学发光试剂盒检测蛋白条带，将所得图像进行条带灰度值分析。HSP-70表达量=HSP-70蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.5 主要观察指标 ①心功能。②血浆Lp-PLA2水平。③心肌组织病理变化。④心肌组织HSP-70表达量。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。所有计量资料均以x(_)±s表示，采用方差分析，t 检验进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

虽然通过心内科不断升级的药物治疗、介入支架及外科搭桥手术等现代医学手段，急性期心肌梗死的病死率已呈逐渐下降趋势，但远期病死率仍居高不下^[12]。心室重构是指心室由于心肌损伤或负荷增加所产生的大小、形状、室壁厚度和组织结构等一系列变化，是病变修复和心室整体代偿及继发的病理生理反应过程。心肌细胞的坏死与凋亡，成纤维细胞的替代性增殖，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活，炎性细胞因子的水平升高和活性增强等最终致使发生急性心肌梗死后心室重构^[13-14]。虽然传统治疗方法可解除血管机械性梗阻，延缓心室重构与改善心功能，但对已梗死的心肌细胞束手无策。心肌梗死后心室重构以及心功能的的严重程度与心肌细胞的凋亡数量关系密切，近年来在学术界干细胞心肌内移植成为心肌细胞再生治疗技术最具活力的课题。

间充质干细胞有较强扩增能力，免疫反应弱，可分化成心肌样细胞及其周围的支持性细胞等诸多优点^[15]。脐血内含有丰富的间充质干细胞^[16]。脐血间充质干细胞是从脐带内及胎盘近胎儿侧血管内的血液中分离出来的干细胞，相对骨髓间充质干细胞其增殖分化能力更强，免疫原性更低^[17]，故预见拥有广阔的应用前景，对心肌梗死后的心肌重构和血管再生有明显的生物学基础优势。

Tang等^[18]报道心肌梗死后移植间充质干细胞对心功能改善有明显效果。研究发现，骨髓源性间充质干细胞经心肌内注射72 h便可检测到明显的心功能改善^[19]，具体机制可能包括^[20-22]：干细胞的心肌样细胞分化、坏死区的血管新生、细胞因子的分泌、细胞融合等。Fukuhara等^[23]证明间充质干细胞在心肌组织中可以向心肌细胞分化。

Lp-PLA2是由炎性细胞所分泌的一种酶，对血管炎性反应及动脉粥样硬化的形成有促进作用^[24]。大量研究显示心血管意外随着粥样斑块组织中Lp-PLA2水平的升高而升高^[25]，Lp-PLA2由粥样斑块组织释入血中，所以血浆Lp-PLA2水平能够直接反映出粥样斑块组织中的Lp-PLA2水平，从而能够准确地反映急性损伤心肌细胞中的炎症反应等^[26]。热休克蛋白70基因在心肌局部缺血或损伤等应激状态时能够迅速地被诱导而出现高水平表达，进而参与心肌缺血再灌注损伤^[27]。Knowhon等^[28]在兔心肌缺血再灌注实验中发现，心肌再灌注区的HSP70 mRNA于1 h后即可见有明显升高，4 h为最高峰，24 h后又恢复到损伤前的水平。

研究结果显示，他汀类药物除调脂外，还有多种如缩小粥样硬化斑块、抗氧化、抗炎、抗血小板、改善血流变以及改善内皮细胞功能等药理作用^[29]。Sheng等^[30]研究发现辛伐他汀通过TLR4途径改善心肌梗死大鼠的心室重构。Ishida等^[31]认为他汀类药物治疗可以通过增加内源性一氧化氮恢复冠状动脉内皮功能，明显改善急性心肌梗死后的左心室重构。瑞舒伐他汀在他汀类药物中属强效类型，具有高生物利用率且半衰期长，调脂作用显著^[32]。瑞舒伐他汀的药理特性与其他他汀类药物相比有明显的优势：除了较强的调脂作用，还可以降低血清细胞因子水平^[33]。Ridker等^[34]研究发现瑞舒伐他汀使单核细胞趋化因子1等表达水平下降，同时降低淀粉样蛋白A及纤维蛋白原水平，进而达到防治心血管疾病的目的。

实验通过瑞舒伐他汀联合脐血间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠进行干预，发现两者对急性心肌梗死大鼠心功能的恢复有叠加协同作用。与模型组比较，联合组和脐血间充质干细胞移植组大鼠心功能指标恢复明显，而联合组较脐血间充质干细胞移植组更为显著。联合组大鼠的Lp-PLA2水平明显低于脐血间充质干细胞移植组，脐血间充质干细胞移植组明显低于模型组；病理切片可见在联合组梗死区的心肌细胞数量较模型组、脐血间充质干细胞移植组明显增加；Western blot检测结果显示，心肌梗死区 HSP70蛋白表达在联合组明显升高，各组间的表达水平差异有显著性意义，充分证明了急性心肌梗死治疗中二者的联合效应。综上所述，瑞舒伐他汀联合脐血间充质干细胞移植可以明显改善心肌梗死大鼠心功能，为急性心肌梗死后心功能改善的研究领域提供了有价值的思路。